ヒト腸管上皮細胞およびBALB / cマウスのマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素の濃度の測定

本手順の目的は、細胞の生存に悪影響を及ぼさない、許容可能な脂肪酸およびコレラ毒素の濃度を決定することです。まず、適切な種類の細胞を培養します。次に、細胞を、テストする3種類の脂肪酸の異なる濃度、またはコレラ毒素とともにインキュベートします。

24時間後、MTTアッセイを用いて細胞生存率を評価します。最終的に、MTTアッセイによる分光光度計データから、細胞生存率を著しく低下させずに処理可能な脂肪酸およびコレラ毒素の最適濃度が明らかになります。ワクチン接種が必ずしも成功するとは限らないため、この手法はコレラ感染の予防への応用に期待されます。

すべてのコトキシン測定および脂肪酸の大規模な濃度決定には、bowel Cマウス由来のMus musculusマクロファージを使用します。細胞は、10%胎児ウシ血清および1%抗生物質・抗真菌剤を添加したL-グルタミン含有DMEM、または10%胎児ウシ血清、5%L-グルタミン、および1%抗生物質・抗真菌剤を添加したRPMI 1640基本培地のいずれかで培養します。本プロトコルでは、bowel C細胞をベントキャップ付きの75 cm² Corningフラスコを用い、37°C、空気95%および二酸化炭素5%の条件下で育成します。微細な脂肪酸濃度決定には、10%FPSおよび30 ng/mLを添加したhypercare培地を用い、ベントキャップ付きの75 cm² Corningフラスコで培養したヒト腸上皮細胞を使用します。

ヒトEGFを用い、製造元の指示に従って抗生物質および抗真菌剤は使用せず、37°C、95%空気および5%二酸化炭素条件下で培養します。細胞の種類に応じて、合流度が約70%に達した時点で、すべての細胞を1対3の比率で継代します。通常、細胞は脂肪酸処理の2～5日前ごとに継代します。まず脂肪酸を調製します。会社から提供されたガラスアンプルから、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸を滅菌済みのガラスバイアルに移します。次に、各脂肪酸を個別の滅菌済みエッペンドルフチューブに移します。

各脂肪酸を100% Ethanolで1:6に希釈して溶解させ、次いでRPMI 1640不完全培地を加えて最終濃度を10 micrograms per microliterにします。各溶液をボルテックスで撹拌し、ガラスバイアルに移して−20 °Cのフリーザープレートで保存します。

96ウェル組織培養プレートに、ヒト腸上皮細胞を1ウェルあたり2,500 cellsで播種し、適切な完全培地を加えて各ウェルの全量を200 µLとする。細胞を37 °C、95%空気および5%二酸化炭素条件下で24時間インキュベートする。

24時間の増殖期間後、培地を除去します。ポジティブコントロールとして、テストする各脂肪酸を適切な濃度でウェルに添加します。ネガティブコントロールとして細胞を完全培地でインキュベートし、また細胞を70% ethanolでインキュベートします。

その後、各ウェルの総量が200 microlitersになるまで完全培地を加えます。MTTアッセイを開始する前に、処理したプレートを24時間インキュベートします。細胞処理用のコレラ毒素を調製するため、コレラ毒素をPBSに溶解し、濃度を1 mg/mLにします。

溶液をクライオバイアルに分注し、細胞処理まで2〜8°Cで保存します。毒素を滅菌済みPBSまたは不完全DMEMで1/100に希釈し、最終的な作動濃度を1 ng/µL plateにします。マクロファージを96ウェルプレートに1ウェルあたり2,500 cellsで播種します。

ウェル組織培養プレートを37 °C、空気95％、二酸化炭素5％の条件下で24時間インキュベートします。24時間の増殖期間後、培地を除去し、適切な試験濃度のコレラトキシンを各ウェルに添加します。脂肪酸処理と同様に、すべてのサンプルおよび処理において、陽性対照として完全培地を、陰性対照として70% ethanolを用いて細胞をインキュベートします。

最低3回の反復実験を行い、陽性対照ではさらに回数を増やしてください。完全培地を加え、各ウェルの総量を200 microlitersにします。MTTアッセイを開始する前に、コレラ毒素処理したプレートを24時間インキュベートしてください。

脂肪酸またはコロトインで細胞を処理してから24時間後、MTTアッセイにより細胞生存率を測定します。テスト対象となる96ウェルプレートの各ウェルから溶液を除去し、200 µLの新鮮な完全培地溶液に交換します。

freshly prepared 2.5 mg/mL MTT溶液を10 µLずつ各ウェルに加えます。プレートを37 °Cで3〜4時間インキュベートします。3〜4時間後、培地溶液を除去し、0.04 M 塩酸イソプロパノール溶液を100 µLずつ各ウェルに加えます。

プレートを室温で5分間インキュベートします。次に、各ウェルの溶液を遠心管に移し、20,000 ×gで1分間、またはペレットが形成されるまで遠心分離します。各サンプルから20〜40 µLをマイクロプレートリーダーに移し、分光光度計を用いて570 nmで吸光度を測定します。

この図は、オレイン酸、リノール酸、およびリノール酸の濃度を上昇させて処理した際の、陽性対照に対する大半のマクロファージの生存率を示しています。いずれの脂肪酸においても、100 ng/µLを超える濃度では細胞が耐えられないことが明らかです。この実験は、100 ng/µL未満の濃度について、ヒト上皮細胞を用いて10 ng/µL刻みで70 ng/µLまで繰り返し行われました。

このグラフは、オレイン酸の各濃度における細胞生存率を示しています。一元配置分散分析（One-way ANOVA）により、1つ以上の平均値に統計的な差があることが示されました。しかし、陽性対照群と統計的に有意な差が認められたのは、高濃度での処理のみでした。

興味深いことに、観察された差異は、細胞生存率の上昇とそれに伴うばらつきの増大によるものでした。リノール酸およびリノール酸についても同様の結果が得られました。一つの方法は、

Inovaにより、治療平均のいずれも陽性対照の平均と統計的な差がないことが示されましたが、リノール酸 60 ng/µL などの高濃度域ではばらつきが増加しているように見受けられます。ヒト腸上皮細胞を使用する場合の最適な脂肪酸濃度は、1 ng/µL から 5 ng/µL の間であると考えられます。また、大部分のマクロファージの生存に対する異なる濃度のコレラ毒素の影響についても、毒素レベルを比較的大きな増分とした処理を用いて検証しました。

各処理において細胞生存率に大きなばらつきが見られたため、期待通り細胞生存率は低下傾向を示しました。生存率のばらつきが大きかったため、陽性対照の平均値とどの処理群との間にも有意差が認められず、さらに100 nanograms以下の毒素レベルでの試験を行うこととなりました。このグラフは、より低い毒素レベルで処理した際の細胞生存率を示しています。

ほぼすべての毒素濃度において細胞生存率は変動が激しいものの、処置の結果として生存率のわずかな上昇が観察されました。これらの上昇は、いずれの処置においても、陽性対照の平均と比較して統計的に有意ではありませんでした。これらの結果に基づき、

Bowel C マウスマクロファージを用いた場合、推奨されるコレラ毒素の濃度は、分化後の1回あたりの処理につき 30 nanograms 未満です。この手法は、コレラ研究分野の研究者が、脂肪酸がコレラ菌による感染に対する免疫を高める可能性があるかどうかを探索するための道を開きました。