Name: ヒト腸管上皮細胞およびBALB / cマウスのマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素の濃度の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ、ヒト腸管上皮細胞とBALB/cマウスマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素濃度の測定法。MTTアッセイで細胞生存率を評価し、安全な実験濃度を確立する。

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我々はそれぞれ、実験支援のためにポーラコボス博士エヴロスバシリウに感謝し、マウスのマクロファージを提供。また、材料と指導と助けを私たちの研究室マネージャーリチャードCriasiaに感謝します。最後に、著者は、ビデオ制作のヘルプはRamanpreet Kaurさんに感謝します。

1。組織培養<ol><li>コレラ毒素の測定にハツカネズミマクロファージ （BALB / cマウス）を使用します。当初は文化M.のすべてベンダーの指示に従って筋細胞 。 </li><li> 10％ウシ胎児血清で完了L-グルタミンを有するダルベッコ変法イーグル培地中でBALB / cマウス細胞を伝播して、1％の抗生物質/抗真菌剤またはRPMI 1640ベース媒体は、10％ウシ胎児血清、5％L-グルタミン、および1で完了し％抗生物質/抗真菌剤試薬。 </li><li> 37℃でベントキャップ付き75cm 2のコーニングフラスコ中の細胞を増殖°C、95％空気および5％CO 2。 </li><li>脂肪酸の決定の決定のため、メーカーの指示に従って配信の24時間以内にヒト腸上皮細胞を持ち出す。 </li><li> 37℃、10％FBSおよび30 ngの/ mlのヒトEGFで完了HybriCareメディアベントキャップ付75cm 2のコーニングフラスコ、℃で人間の腸管上皮細胞を伝播抗生物質を使用しないでくださいメーカーの指示に従って、/抗真菌薬。 </li><li>密集度約70％で、すべてのセル（1:3）を分割します。 </li><li>フリーズと標準凍結プロトコルを使用して研究を通して、すべてのセルを持ち出す。 </li><li> 注：脂肪酸のより大規模な濃度決定のために、最初は速く成長し、保守が容易にマウスマクロファージを使用しています。細かいスケール脂肪酸濃度の決定のために、ヒト上皮細胞を使用しています。すべてのコレラ毒素治療（説明を参照してください）​​、マウスマクロファージを使用してください。 </li></ol> 2。脂肪酸とコレラ毒素トリートメント<ol><li>オレイン酸は、同社が提供するガラスアンプルから滅菌ガラスバイアルにリノール酸とリノレン酸を転送します。 </li><li>個別滅菌エッペンドルフチュー​​ブに各脂肪酸を転送し、1:6希釈で100％エタノールで最初にそれを溶解した後、10μgの/μlの最終濃度のためにRPMI 1640不完全なメディアである。 </li><li>ボルテックス各ソリューションとTRANSFえーそれは冷凍庫内のストレージ用ガラスバイアル（-20°C）へ。 </li><li> 96ウェル組織培養プレートでよく2,500細胞/皿で細胞。 </li><li> MTTアッセイの準備のために脂肪酸と細胞の治療のために200μlに合計うまくボリュームを持って適切な完全なメディアを追加します。 </li><li> 24時間増殖期間の後、メディアを取り出し、新鮮な培地と交換してください。 </li><li> （結果を参照）ウェルにテストする各脂肪酸の適切な濃度を追加します。 200μlに合計うまくボリュームを持って完全なメディアを追加します。 </li><li> MTTアッセイを開始する前に24時間処理プレートをインキュベートする。 </li><li>クライオバイアルに1 mg / mlのアリコートと溶液の濃度でPBSでコレラ毒素を溶解し、2-8でクライオバイアルを保管℃に</li><li>細胞治療のため、1 ngの/μLの最終作業濃度のどちら滅菌PBS（pH7.4）に、または不完全なDMEM中で毒素1:100に希釈する。 </li><li>におけるコレラ毒素を持つ細胞を治療する上述したようにMTTアッセイプレート電池用製剤。 </li><li> 24時間増殖期間の後、脂肪酸アプリケーション（上）で使用される手順に従って、ウェルにテストする（我々の濃度について、結果を参照）コレラ毒素の適切な濃度を追加します。 </li><li> MTTアッセイを開始する前に24時間処理プレートをインキュベートする。 </li><li>それぞれの脂肪酸及びコレラ毒素治療の両方のための正（紙全体に正c）および陰性対照（負c）は、完全培地および70％エタノールでインキュベートした細胞、など。 </li><li>すべてのサンプルとトリートメントにはポジティブコントロールのためのより多くの複製（本研究ではn = 6）で、3反復（n = 3）での最小値を使用しています。 </li></ol> 3。 MTTアッセイ<ol><li> 2.5 mg / mlの濃度にMTT原液を作る。 </li><li>テストする、96ウェルプレートの各ウェル中の溶液を取り除き、新鮮な完全なメディア溶液200μlと交換してください。 </li><li>広告各ウェルにMTT溶液を10μlのD。 </li><li> 37℃で3-4時間、プレートをインキュベートする。 </li><li>メディアソリューションを捨て、各ウェルにイソプロパノールで0.04 M HClを100μlのを追加します。 </li><li> 5分間室温でプレートをインキュベートする。 </li><li>各ウェルから新しい遠心管にソリューションを移す。 </li><li> 1分間、またはペレットが形成されるまで、室温で、20,000×gで遠心分離します。 </li><li>各サンプルの20〜40μlの間にマイクロプレートリーダーへの転送。 </li><li>分光光度計を用いて570nmで吸光度を読み取る。 </li></ol>

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この研究の著者らは、この研究の結果からの経済的利害関係を持っていません。この研究のための資金はキーン大学がFTに提供されたが、FTは、現在Kingsboroughコミュニティカレッジの従業員です。

脂肪酸とコレラ毒素の濃度の提案脂肪酸は粘膜免疫を高める方法の正確なメカニズムは不明であるが、いくつかの研究は、それらの有益な効果を調べることを試みた。我々の研究は、細胞が細胞は細胞の生存に重要な影響を及ぼすことなく耐えることができるだけでなく、コレラ毒素の最大濃度に耐えることができる脂肪酸の​​最大濃度を決定する方法を提供することを目的とする。 だけでなく、我々は異なるに脂肪酸とコレラ毒素と処理組織培養細胞を可溶化し、細胞の生存率に非常に重大な悪影響を及ぼすことなく、細胞の治療のためのコレラ毒素のものと3脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）の濃度を決定するために、濃度は、生存率を評価するMTTアッセイを行った。我々の手法とその結果に基づいて、我々は脂肪酸およびコレラ毒素有用な範囲を提供する（下記参照）は、これらの脂肪酸またはコレラ毒素を使用することを目指して将来の調査のために。我々は、ヒトの腸上皮細胞を使用するため、それぞれ、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸に対して1 384-768、および384-768（ng /μ...

オレイン酸、リノール酸やリノレン酸などの脂肪酸の健康上の利点は、き、文書化され続けてきた。例えば、オレイン酸は、ボディ1,2における親油性薬物の浸透を促進するのに役立ち飽和脂肪酸3に代入するとき24％冠状動脈性心臓病を低減し、X-連結されるよう副腎4などの代謝性疾患を治療するために使用される脂肪酸代謝の遺伝性疾患。 。哺乳類におけるアラキドン酸、リノール酸（オレイン酸とは異なります）のために必要な前駆体は、体内で合成されず、そのような亜麻の種子の消費などによって外部ソースを介して取得する必要がありますが5つの研究は、次のようなリノール酸のいくつかの有益な健康への影響を示しています。肌のためのアンチエイジングの特性、6抗炎症作用、大腸と前立腺癌細胞の増殖が減少7、8、肥満と戦うための能力と昇進Ofの心臓血管の健康。9 ​​リノレン酸が歯周炎症、10および変調トロンボキサンとプロスタサイクリン合成を減少させる役割を果たしています11 Arpita 12 V.に胆汁脂肪酸とコレステロールの影響を検討病原因子と運動性のコレラ菌の表現。山崎13は、赤唐辛子、およびその他の天然抽出物、メタノール抽出物から、潜在的にコレラ毒素産生を減少させることができることが示された。これは、粘膜免疫を提供する介して、例えばコレラなどの感染症の予防及び緩和上記脂肪酸（例えば、亜麻種子など）に富んだ食品の使用を検討することも考えられる。我々は、細胞増殖アッセイ、ヒト腸管上皮細胞は、セリウムに有害な影響を与えることなく許容できる脂肪酸の​​最大濃度を用いて、脂肪酸を可溶化し、決定するために検討を重ねLL生存能力。我々は、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸は、低濃度で細胞生存度に有益な効果を提供すると仮定したが、より高い濃度では、それらは細胞に対して毒性であること。我々はまた、コレラ毒素を可溶化し、BALB / Cマウスのマクロファージ細胞生存率の有意な減少なしに耐えることができるコレラ毒素の最大濃度を決定した。私たちも、非常に低レベルでの細胞生存率にコレラ毒素の毒性効果を仮定する。コレラ毒素を可溶化し、細胞の生存性を大幅に低下させることなく耐えることができる毒素の最大量を決定するためにそれを使用する方法は、将来の研究のための利点を提供する。例えば、上記の方法の組み合わせが脂肪酸がコレラ感染に対する粘膜免疫細胞を提供するかどうかを決定するために使用することができる。我々の知る限り、これは合理的手法が検討されていない。 私たちは、ジ我々の予備的データはオレインかどうかを判断するために後で調査で使用することができますscuss方法、リノール酸とリノレン酸がコレラ感染に対する粘膜免疫で細胞を提供する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells/Reagent</td></tr><tr><td>Mus musculus マクロファージ</td><td>ATCC</td><td>ATCC RAW 264.7</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変鷲の培地</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 </td><td>Bio-west</td><td>S0250</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌性 </td><td>Hyclone</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>ヒト腸上皮細胞 </td><td>ATCC</td><td>ATTC CCL-241</td><td></td></tr><tr><td>HybriCare 培地 </td><td>ATCC</td><td>46-X</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>リノール酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-1376</td><td></td></tr><tr><td>リノレン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2376</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates</td><td>BD Biosciences</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software</td><td>Dynex</td><td>91000101</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト腸管上皮細胞およびbalb / cマウスのマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素の濃度の測定

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

非ヒトとヒトの疾患の予防や緩和に脂肪酸の積極的な役割があっと広範囲に文書化され続けてきた。これらの役割は、炎症の予防だけでなく、感染症に対する粘膜免疫を含む感染と非感染性疾患への影響が含まれています。コレラは細菌コレラ菌によって引き起こされる急性の腸の病気です。それは発展途上国で発生し、放置すれば、死に至ることができます。コレラのためのワクチンは存在するが、それらは必ずしも有効と他の予防方法が必要とされているではありません。我々はそれぞれ、マウスBALB / Cマクロファージおよびヒト腸上皮細胞を使用して、3つの脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）とコレラ毒素の許容濃度を決定するために設定してください。我々は、濃度範囲であると無脂肪酸の特定の濃度を決定するために、上記の脂肪酸および使用される細胞増殖アッセイを可溶化ヒト腸管上皮細胞の生存率に有害トン。我々は、コレラ毒素を可溶化し、統計的にBALB / Cマクロファージにおける細胞生存率を低下させない濃度範囲およびコレラ毒素の特定の濃度を決定するためのアッセイでそれを使用した。 我々は1-5 ngの/μlの間になるように最適な脂肪酸濃度を発見し、そして、それは、コレラ毒素の治療あたり&lt;30 ngのように。このデータは、予防またはコレラ感染の緩和中の脂肪酸の保護粘膜の役割を見つけることを目指して今後の研究を支援することがあります。

脂肪酸の最適濃度の決定脂肪酸の最適な濃度は、細胞増殖に匹敵するか、または結果のばらつきが比較的低いと、コントロール細胞とを超えた最大濃度として定義される。オレイン酸の最適濃度を決定するために、リノール酸およびリノレン酸の細胞は、最初は少しずつで大きな増分以降では、各脂肪酸の濃度を変化させることで処理した。 図1は、使用する処置のための陽性対照の関数として示されている細胞の生存を示してい脂肪酸の濃度を増加させる。それは、細胞が脂肪酸のいずれかの上記100ngの/μlの濃度を許容しないことが明らかである。一つの方法は、ANOVAは、治療の各々について、手段の一つ又はそれ以上が他た（p &lt;0.001）とは異なることを示した。事後検定（Tukeyのは）を示したことを除いて、オレイン酸のすべての治療をするため1 ngの/μL、ポジティブコントロールとは異なっていた。興味深いことに、高い変動に起因し、この治療法のいずれかわずかにネガティブコントロールと有意差はなかった。リノール酸およびリノレン酸の両方について、一方向ANOVAは、少なくとも1...

我々は大幅な悪影響脂肪酸と毒素を可溶化し、細胞生存率アッセイでそれらを使用することによって、細胞の生存に影響を及ぼさなかった3脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）とコレラ毒素の許容濃度を決定するために設定してください。

ヒト腸管上皮細胞およびBALB / cマウスのマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素の濃度の測定

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

本手順の目的は、細胞の生存に悪影響を及ぼさない、許容可能な脂肪酸およびコレラ毒素の濃度を決定することです。まず、適切な種類の細胞を培養します。次に、細胞を、テストする3種類の脂肪酸の異なる濃度、またはコレラ毒素とともにインキュベートします。24時間後、MTTアッセイを用いて細胞生存率を評価します。最終的に、MTTアッセイによる分光光度計データから、細胞生存率を著しく低下させずに処理可能な脂肪酸およびコレラ毒素の最適濃度が明らかになります。ワクチン接種が必ずしも成功するとは限らないため、この手法はコレラ感染の予防への応用に期待されます。すべてのコトキシン測定および脂肪酸の大規模な濃度決定には、bowel Cマウス由来のMus musculusマクロファージを使用します。細胞は、10%胎児ウシ血清および1%抗生物質・抗真菌剤を添加したL-グルタミン含有DMEM、または10%胎児ウシ血清、5%L-グルタミン、および1%抗生物質・抗真菌剤を添加したRPMI 1640基本培地のいずれかで培養します。本プロトコルでは、bowel C細胞をベントキャップ付きの75 cm² Corningフラスコを用い、37°C、空気95%および二酸化炭素5%の条件下で育成します。微細な脂肪酸濃度決定には、10%FPSおよび30 ng/mLを添加したhypercare培地を用い、ベントキャップ付きの75 cm² Corningフラスコで培養したヒト腸上皮細胞を使用します。ヒトEGFを用い、製造元の指示に従って抗生物質および抗真菌剤は使用せず、37°C、95%空気および5%二酸化炭素条件下で培養します。細胞の種類に応じて、合流度が約70%に達した時点で、すべての細胞を1対3の比率で継代します。通常、細胞は脂肪酸処理の2～5日前ごとに継代します。まず脂肪酸を調製します。会社から提供されたガラスアンプルから、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸を滅菌済みのガラスバイアルに移します。次に、各脂肪酸を個別の滅菌済みエッペンドルフチューブに移します。各脂肪酸を100% Ethanolで1:6に希釈して溶解させ、次いでRPMI 1640不完全培地を加えて最終濃度を10 micrograms per microliterにします。各溶液をボルテックスで撹拌し、ガラスバイアルに移して−20 °Cのフリーザープレートで保存します。96ウェル組織培養プレートに、ヒト腸上皮細胞を1ウェルあたり2,500 cellsで播種し、適切な完全培地を加えて各ウェルの全量を200 µLとする。細胞を37 °C、95%空気および5%二酸化炭素条件下で24時間インキュベートする。24時間の増殖期間後、培地を除去します。ポジティブコントロールとして、テストする各脂肪酸を適切な濃度でウェルに添加します。ネガティブコントロールとして細胞を完全培地でインキュベートし、また細胞を70% ethanolでインキュベートします。その後、各ウェルの総量が200 microlitersになるまで完全培地を加えます。MTTアッセイを開始する前に、処理したプレートを24時間インキュベートします。細胞処理用のコレラ毒素を調製するため、コレラ毒素をPBSに溶解し、濃度を1 mg/mLにします。溶液をクライオバイアルに分注し、細胞処理まで2〜8°Cで保存します。毒素を滅菌済みPBSまたは不完全DMEMで1/100に希釈し、最終的な作動濃度を1 ng/µL plateにします。マクロファージを96ウェルプレートに1ウェルあたり2,500 cellsで播種します。ウェル組織培養プレートを37 °C、空気95％、二酸化炭素5％の条件下で24時間インキュベートします。24時間の増殖期間後、培地を除去し、適切な試験濃度のコレラトキシンを各ウェルに添加します。脂肪酸処理と同様に、すべてのサンプルおよび処理において、陽性対照として完全培地を、陰性対照として70% ethanolを用いて細胞をインキュベートします。最低3回の反復実験を行い、陽性対照ではさらに回数を増やしてください。完全培地を加え、各ウェルの総量を200 microlitersにします。MTTアッセイを開始する前に、コレラ毒素処理したプレートを24時間インキュベートしてください。脂肪酸またはコロトインで細胞を処理してから24時間後、MTTアッセイにより細胞生存率を測定します。テスト対象となる96ウェルプレートの各ウェルから溶液を除去し、200 µLの新鮮な完全培地溶液に交換します。 freshly prepared 2.5 mg/mL MTT溶液を10 µLずつ各ウェルに加えます。プレートを37 °Cで3〜4時間インキュベートします。3〜4時間後、培地溶液を除去し、0.04 M 塩酸イソプロパノール溶液を100 µLずつ各ウェルに加えます。プレートを室温で5分間インキュベートします。次に、各ウェルの溶液を遠心管に移し、20,000 ×gで1分間、またはペレットが形成されるまで遠心分離します。各サンプルから20〜40 µLをマイクロプレートリーダーに移し、分光光度計を用いて570 nmで吸光度を測定します。この図は、オレイン酸、リノール酸、およびリノール酸の濃度を上昇させて処理した際の、陽性対照に対する大半のマクロファージの生存率を示しています。いずれの脂肪酸においても、100 ng/µLを超える濃度では細胞が耐えられないことが明らかです。この実験は、100 ng/µL未満の濃度について、ヒト上皮細胞を用いて10 ng/µL刻みで70 ng/µLまで繰り返し行われました。このグラフは、オレイン酸の各濃度における細胞生存率を示しています。一元配置分散分析（One-way ANOVA）により、1つ以上の平均値に統計的な差があることが示されました。しかし、陽性対照群と統計的に有意な差が認められたのは、高濃度での処理のみでした。興味深いことに、観察された差異は、細胞生存率の上昇とそれに伴うばらつきの増大によるものでした。リノール酸およびリノール酸についても同様の結果が得られました。一つの方法は、Inovaにより、治療平均のいずれも陽性対照の平均と統計的な差がないことが示されましたが、リノール酸 60 ng/µL などの高濃度域ではばらつきが増加しているように見受けられます。ヒト腸上皮細胞を使用する場合の最適な脂肪酸濃度は、1 ng/µL から 5 ng/µL の間であると考えられます。また、大部分のマクロファージの生存に対する異なる濃度のコレラ毒素の影響についても、毒素レベルを比較的大きな増分とした処理を用いて検証しました。各処理において細胞生存率に大きなばらつきが見られたため、期待通り細胞生存率は低下傾向を示しました。生存率のばらつきが大きかったため、陽性対照の平均値とどの処理群との間にも有意差が認められず、さらに100 nanograms以下の毒素レベルでの試験を行うこととなりました。このグラフは、より低い毒素レベルで処理した際の細胞生存率を示しています。ほぼすべての毒素濃度において細胞生存率は変動が激しいものの、処置の結果として生存率のわずかな上昇が観察されました。これらの上昇は、いずれの処置においても、陽性対照の平均と比較して統計的に有意ではありませんでした。これらの結果に基づき、Bowel C マウスマクロファージを用いた場合、推奨されるコレラ毒素の濃度は、分化後の1回あたりの処理につき 30 nanograms 未満です。この手法は、コレラ研究分野の研究者が、脂肪酸がコレラ菌による感染に対する免疫を高める可能性があるかどうかを探索するための道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ、ヒト腸管上皮細胞とBALB/cマウスマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素濃度の測定法。MTTアッセイで細胞生存率を評価し、安全な実験濃度を確立する。

ヒト腸管上皮細胞およびBALB / cマウスのマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素の濃度の測定

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