Name: エレクトロ組換えスパイダーシルクタンパク質の不織布メッシュを含むエアフィルターデバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶエレクトロスピニング法による組換えクモ糸タンパク質の不織布メッシュ製造と空気ろ過効率向上技術。エタノール蒸気処理で水中安定性を付与し、環境・医療分野への応用可能性を示す。

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我々は感謝してアニャローターバッハ（Lehrstuhl Biomaterialien）、ローレンツ大全（サンドラーAG）とアーミンベック（B / S / H / G）の技術的及び科学的サポートを認める。 SEM-イメージングは​​ヨハネスディール（Lehrstuhl Biomaterialien）により行った。資金は、BMBF（01RB0710）から派生した。

1。紡糸原液の調製<ol><li> eADF4（C16）のタンパク質を凍結乾燥させてください。 </li><li>高精度の尺度を用いて、1mlの反応容器内でeADF4（C16）を20mg秤量する。 </li><li>ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）を200μlを加え、パラフィルムで容器を密封する。 注： HFIPは非常に揮発性と有害である。それは慎重にピペット、安全フードの下で呼吸トラック、仕事に害を引き起こす、チューブキャップをすることができますように。 </li><li>ボルテックスは1分間サスペンションと、さらにソリューションをクリアするためにそれを振る。確実にするために、タンパク質の全体量が完全に溶解されていることを、一晩待つ。 </li></ol> 2。エレクトロスピニング<ol><li>場所対極と電極（-22.5キロボルト）と対極（+2.5 kVの）両方のプリセット電圧の上にフィルター材料：エレクトロデバイス（ 図1）を準備します。 315μL/時に体積流量を設定します。 注：Whileエレクトロ、毒性HFIPを蒸発されます。あなたのエレクトロデバイスがドラフトに接続されていることを確認してください。 </li><li>市販の20 G針を取り、30mmの残存長さにハンドグラインダーで鋭い先端を挽く。 、1mlのシリンジに針を接続します。 注：平面ニードルチップは、明確に定義されたテーラーコーンを生成するために必要とされる。 </li><li>シリンジに全体紡糸原液を（200μl）をロードします。完全な溶液が紡糸工程中に押し出すことができるようにするために、空気100μlのドープを重ねる。 注：針の目詰まりを避けるために、紡糸原液には粒子（集合体や不純物）がないことを確認してください。ヒュームフード下で働く！ </li><li>エレクトロデバイスのシリンジポンプにフィルドシリンジを接続し、液滴は、針の先端に表示されるまで、慎重に注射器にピストンを押してください。ピストンをロックします。 </li><li>距離を設定針の先端と8月20 cmまで対極との間。 </li><li>シリンジポンプを起動し、針の開口部から（通常は乾い）滴を削除します。直ちにエレクトロデバイスのすべての安全のインストールを有効にして、新たな液滴が現れるとすぐに高電圧源を開始します。紡糸原液のエレクトロと、続いて開始されます。回転持続時間を制御するためにストップウォッチを使用してください。 注：溶液の乾燥を回避するため、針の目詰まりするためには、それはすぐに乾燥させた液滴を除去した後、紡糸プロセスを開始する必要がある。 </li><li>組換えスパイダーシルクタンパク質のエレクトロは湿度と温度に依存するため、個々の研究室の状況に向けたプロセスパラメータの適応は（ 図2）必要があるかもしれません。 注：乾燥から滴を防ぐため（ 図2B）十分な流量を有効にします。低加湿がある場合TYは、周囲の雰囲気中で、相対湿度を調整するか、流量を引き上げる。適切なテイラーコーンが発生するまで電圧を下げます（ 図2A）。先端（ 図2C）全く解が存在しない場合、流速を高め、液滴が発生するまで電圧を低下させる。その後、定期的かつ安定したテイラーコーン（ 図2A）を確立するために、電圧を調整します。 </li><li> 30シリンジポンプオフスイッチをエレクトロスピニングの秒/ 60秒/ 90秒後。落下液滴を避けるために、シリンジ内の残圧を解放するために高圧電源を切る前に10秒待つ。 </li><li>ステップ6〜8は、比較のため、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエステル不織布メッシュと同様に、黒色の紙のようなフィルター材料、異なるタイプのを行うことができる。 </li><li>その後の安定性実験のための不織布のメッシュを生成するには、フィルター材料の代わりに黒い紙を使用し、ステップ5〜7を実行します。エレクトロの5分後、停止ステップ8で説明したようにプロセス。 </li></ol> 3。シルク不織布メッシュの後処理<ol><li> 60予熱オーブン℃まで</li><li> eADF4（C16）不織布メッシュを垂直にし、ロック可能なガラス容器に2cmの最小距離をもつフィルタ基板を置きます。容器は、続いてエタノールと水を導入するために使用される2つの開口部を有するべきである。 注：フィルター材を固定する場合は、透水性実験のために必要な領域がクランプによって損傷されていないことを確認してください。 </li><li>後処理容器の内部底面（ 図3）にポインティングシリコーンチューブを60mlずつ2シリンジ、エタノールを充填した1、水で満たされたものを、接続する。 注：治療後の容器から液体を除去できるようにするために、できるだけ近い底部にパイプの開口部を配置する。 </li><li> OVで後処理容器を置きENとシリンジを押し出すことにより、エタノール60 mlを加える。治療期間を制御するためにストップウォッチを使用してください。 </li><li>エタノール蒸気処理の90分後、ガラスから注射器でエタノールを除去し、第2のシリンジから水60mlを加えます。 </li><li>別の90分間待ってから、水を除去し、オーブンのスイッチを切る。それが完全に冷えて凝縮して液滴を避けるために、炉容器を残す。 </li></ol> 4。スパイダーシルク不織布メッシュの分析<ol><li>黒い紙または他の取り外し可能な支持体上の安定性試験のための絹織メッシュを準備します。段ボールの2つのフレームを切り出し、両面粘着性粘着テープを調整します。黒い紙の上に堆積絹織メッシュに1つのフレームを押して、シルク繊維（その後のSEMイメージングのための過剰繊維を保つ）の過剰を遮断するメスを使用しています。丁寧に紙から不織布を切り離すために、フレームを削除します。二フレームを使用してこの手順を繰り返し（ 図4）。 </li><li>実用ディップテスト：各のピース（1 cm 2）を、後処理および非処理絹織メッシュをカットし、脱イオン水に浸す。治療不織メッシュ（ 図5）が安定になる一方、非処理絹織メッシュはすぐに、溶解します。浸漬した後、浸漬、試料を乾燥させ、SEMイメージングのための準備をします。 </li><li>フーリエ変換赤外分光法（FTIR）測定およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）：不織布メッシュの後処理時の絹タンパク質の構造変化に関する情報を得るために、FTIR、パラメータを使用して適用することができる。透過率モード、60蓄積は、各スペクトルを測定し、平均しているcm -1の、一つの基準は、スペクトルごとに測定されます800から4,000にスキャンします。データの定量分析については、FSD（ 図6および図7）を用いることができる。これにより、データ曲線はARに低減される1590と1705センチメートル-1およびベースライン補正との間のEAが行われる。地元の最小二乗適合が22（1611 1619、1624、1630、1640、1650、1659、1666、1680、1691、1698センチメートル-1）これまでの研究から取らピーク位置に応じて算出される。 </li><li> SEM撮像：SEMは、繊維直径および異なるフィルタ基板上のシルク繊維の形態を調査するために、繊維の形態（ 図8）上の後処理の影響を分析するために適用することができる。十分に詳細な画像を得るために25,000 X〜5,000 Xの倍率を使用してください。 </li></ol> 5。通気性の決定<ol><li> Akustron空気透過性デバイスの測定領域にフィルター材料の適切な嵌合部を置きます。 注::あなたは空気透過装置の他のタイプを使用する場合は、DINの要件53 887、DIN 53 120、ISOを満たしていることを確認してください9237およびASTM D 737から96規格。 </li><li>Akustronの通気性·デバイス（または他の任意のよう5.1に示されている）を採用。必要はノルムのデータを計算すると[L /（M×2 秒）]。 </li><li>サンプルのさまざまな部分で、手順1と2は少なくとも10回繰り返し、算術ミドル（ 図9）を計算。 注：測定通気性は、デバイスの接触および不織布メッシュを必要とする。従って、試料の取り扱いに注意が繊細なシルク不織布メッシュの破壊を防止することが重要である。 </li></ol> 6。フィルター効率の決定<ol><li>このようなユニバーサルパーティクルサイザー（パラス社、カールスルーエ、GER）として、圧力制御やパーティクルカウンターで適切なマシンを使用してください。 </li><li>デバイスと測定粒子保持（ 図10）でフィルタのサンプルを置きます。エアゾール：DI-エチル-ヘキシルsebacat（DEHS）、粒径：0.3〜ミクロン、長さ：30秒;液体速度：2350センチメートル/秒;空気流量：3400メートル3 /時。 <br/&gt; 注：注意してサンプルを処理し、不織布メッシュの破壊を防ぎ、任意の汚染を避けるために、表面に触れないでください。パフォーマンス測定のために同等の品質の十分なサンプルを作成してください。 </li></ol>

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我々は、開示することは何もありません。

新しいフィルタ装置は、一定以上のフィルター効率で空気ろ過の全体のエネルギー消費を下げるようにする必要があります。ここでは、そのようなデバイスは、クモの糸で作られた不織布を使用して作成された。その低表面張力と高揮発性のため、HFIPは電気紡糸のために適切な溶媒として選択されている。また、水性シルク溶液は以前の実験で試験されたが、まだ繊維が生成されなかった。ここで、表面張力を低下させ、それによって溶液の紡糸特性を改善するために添加物を使用することが重要であろう。最も重要な工程は、高電圧及び押出速度を回転させて、条件および使用される材料の濃度および紡糸溶液の溶媒を調整することである。演奏中に、先端の目詰まり例えば水蒸気の形での水分とニードルチップを供給することにより防止することができるが、エレクトロスピニングセットアップでの追加の任意の種類は、その後乱す可能性があります敏感なプロセスおよび電界。本質的なプロセスパラメータ（濃度、電圧、距離、湿度）は、単独で独立した実験的な系列（データは示さず）を行う決定した。考慮し、すべてのパラメータを取ること、それは、連続テイラーコーンと均一繊維を作成するために紡糸工程の世話をすることが重要です。 フィルタ効率は、フィルタ材料の最も重要なパラメータの一つである。このパラメータは、主にフィルター材料の構造によって影響される。織布は、均一な細孔サイズと、その後一貫し通気性を継承します。これは、毛穴を埋めるために、ゼロ欠陥フィルタを生成するために、これらのテンプレート素材で均質織メッシュを作成することが重要です。我々のフィルタにおいて、フィルタ効率は、不織布、メッシュ層の数、従って、紡糸時間（シルクタンパク質の）に直接依存性を示し、。単繊維間の空隙が一貫保持Oの有効化、満たされているfは小さい粒子。 本研究では、高いフィルター効率を示す、スパイダーシルク不織布メッシュを有する新規なフィルター材料を製造するための方法を導入しました。したがって、これらのフィルタは、空気ろ過システムにおける将来の使用のための有望な候補である。

強度および伸展それらの組み合わせにより、スパイダーシルク繊維は、他のほとんどの天然又は合成繊維の1以上の運動エネルギーを吸収することができる。さらに、ほとんどの合成高分子材料とは異なり、絹材料は無毒と生体適合性であり、2,3を組み込んだ全くアレルギー反応を起こさない。推定上の健康上のリスクは、スパイダーシルクを使用することにより防止することができる。これらの機能は、医療と技術の様々なアプリケーションのためのクモの糸は非常に魅力的です。スパイダーは、その共食い動作により、養殖することができないので、生物工学的方法の両方、コスト効率的かつ十分な量4には、スパイダーシルクタンパク質を生成するために開発されてきた。 組換えシルクプロテインeADF4（C16）はAraneusのdiadematusのフィブロイン4（ADF4）の自然な配列に基づいて設計されています。 eADF4は、（C16）5 48kDaの分子量を有し、種々の溶媒に可溶である（hexafluoroisopropanol（HFIP）6、ギ酸7、水性緩衝液）8。 eADF4（C16）は、このような膜9、カプセル8、粒子10、ヒドロゲル11、コーティング7、繊維12と不織布メッシュ6などの異なる形態に加工することができる。それらの化学的安定性のために、後者はフィルタ用途において高い電位を与える。 ここでは、エレクトロ換えスパイダーシルクタンパク質の不織布のメッシュを含むエアフィルターデバイスを製造するためのプロトコルを提示する。エレクトロスピニング又は静電紡糸は、典型的には既にフィルタ·アプリケーション14として研究されてきたが10nm程度13 -10、及び不織布のメッシュの範囲の直径を有するポリマー繊維を製造するために採用される技術である。過去には、エレクトロスピニングが正常でなく、組換え的に産生さ16クモの糸のように再生された15の処理のために適用されているタンパク質。典型的には、高電圧（kVの5-30）をシリンジと8月20 cmの距離に配置された対向電極（0-20キロボルト）に印加さ​​れる。強い静電場は、帯電したソリューション内の反発力を誘導する。表面張力を超えた場合、テーラーコーンが形成され、細いジェットは、先端部17,18から噴出される。形成後、曲げ不安定性は、さらに、溶媒が蒸発するように延伸させる噴流内で発生し、固体繊維が形成されている。最後に、繊維がランダムに不織布メッシュ19と対向電極上に堆積される。直径と表面トポロジー（多孔質、滑らかな）のような繊維の特性、濃度、粘度、表面自由エネルギーと溶媒との本質的な導電率と透磁率20などのソリューションパラメータに主に依存している。溶液中のタンパク質の濃度に応じて80-1,100程度から直径がスムーズファイバにおけるHFIP結果に溶解eADF4（C16）のエレクトロ。HFIPからeADF4（C16）エレクトロは、主にα-ヘリックス二次構造を表示し、繊維は水溶性6アール。シルク繊維を安定化させるためには、β-シート構造はエタノールでその後の処理によって誘導されなければならない。以前に確立された後処理方法21とは対照的に、本 ​​研究でeADF4（C16）不織布は、シルク繊維の形態を維持するために、エタノール蒸気で処理されている。二次構造解析は、文献22に記載されているように、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）を用いて行った。 FSDは、FTIRスペクトルの分解能は、いくつかのオーバーラップバンドから成ることができ、信号処理ツールである。これにより、I領域の中の不明瞭な広い帯域が改善されたピークの解像度でデコンボリューションしたスペクトルを受信するためにハイパスフィルタを用いて狭くすることができる。 effのを評価するために、シルク不織布メッシュを補完フィルタ基板のiciencyは、通気性試験は、標準的なプロトコルに従ってAkustron装置を用いて行った。堆積速度は、パラスユニバーサルパーティクルサイザーを用いて測定した。

エレクトロ組換えスパイダーシルクタンパク質の不織布メッシュを含むエアフィルターデバイス

Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

Araneusのdiadematusのフィブロイン4（ADF4）、組換えスパイダーシルクタンパク質eADF4の天然の配列に基づいて（C16）設計されています。この反復性の高いタンパク質は48kDaの分子量を有し、異なる溶媒（ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）、ギ酸および水性緩衝液）に可溶性である。 eADF4（C16）は、フィルム、カプセル、粒子、ヒドロゲル、コーティング、繊維や不織布メッシュなどの形態に加工した様々な技術的なアプリケーションのための高い潜在性を提供します。それらの化学的安定性および制御された形態のために、後者は濾材を改善するために使用することができる。このプロトコルでは、電界紡糸、組換えスパイダーシルクタンパク質の不織メッシュの堆積によって、異なるエアフィルタデバイスの効率を高めるための手順を示す。スムーズ繊維中HFIP結果に溶解eADF4（C16）のエレクトロ。異なる繊維直径（80-1,100ナノメートル）およびタンパク質濃度の変動（5〜25％w / vのは）結果不織布メッシュのため、細孔径。 タンパク質が新たに紡いだ繊維で、主にα-ヘリックス二次構造を表示しますので、HFIPからeADF4（C16）エレクトロの後処理が必要であるため、繊維は水溶性である。エタノール蒸気とのその後の処理は、シルク繊維とメッシュの形態を維持し、耐水性、安定したβシート構造の形成を誘導する。二次構造解析は、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）を用いて行った。 主な目的は、上にシルク不織布層を追加することで、既存のフィルタ基材のフィルタ効率を改善することであった。持続時間をエレクトロスピニングの影響及びフィルタ効率に従って、不織布層の厚さを評価するために、我々は、粒子堆積測定と組み合わせて通気性試験を行​​った。実験は標準に従って実施されたプロトコル。

HFIP〜10％w / vの濃度の組換えスパイダーシルク溶液のエレクトロスピニングは、不織布のメッシュの形成を可能にする、80〜120nmの範囲の直径を有する滑らかな繊維をもたらした。エタノール蒸気による後処理は、絹織後処理の適切な方法（ 図8）として設立され、それゆえ、だっ目立つ形態学的変化には ​​つながらなかった。構造変化は、FT-IR及びIバンドが単一寄与ピーク（ 図6）を分析するために行われた中での後続のFSDを用いて検出した。これは、α-ヘリックスundのランダムコイル構造の含有量が少なくなる（ 図7）が、後処理は、β-シート構造の増加をもたらすことを示すことができた。この結果は、実質的に水（ 図5）内に不織後処理を浸漬することによって証明することができる。でも、一週間後、不織布メッシュのない溶解が発生しません。 スピニング·デュ配給は、エレクトロ繊維の高密度化に基づいて圧力降下に起因するフィルター材料シルク不織布の適用に関する最も重要なパラメータである。こうして拡張回転期間のウント通気性の指数関数的な減少繊維層結果の上位数。この効果は、ポスト処理前と処理後の全ての異なるフィルタ基板材料（ 図9）を検出することができる。同様に、サブミクロン粒子が増加する（ 図10）のシルク含有濾材の濾過効率。短い回転期間（30秒）は、低フィルタ効率、より高い回転期間（90秒）高い効率のリードを獲得しながら。 <img alt="図1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1.jpg" /> 図1の高電圧（0〜30キロボルト）は、i<html> sがシルク溶液を充填したシリンジに適用され、対向電極（0-20キロボルト）は8〜20センチメートルの距離に配置されている。このセットアップでは、帯電したソリューション内の反発力を誘発する、強い静電場につながる。表面張力を超えた場合、テーラーコーンが形成され、細いジェット先端から噴出される。形成後、曲げ不安定性は、さらに、溶媒が蒸発するように延伸させる噴流内で発生し、固体繊維が形成されている。最後に、繊維がランダムに不織布メッシュ状の対向電極上に堆積される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig2.jpg" /> 図2の正規テイラーコーン（）、乾燥滴（B）、及び液滴（C）なしのセットアップの写真を。 iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg &quot;/&gt; 蒸気後処理中に図3の回路図手順。最初のステップでは、チャンバはエタノールで充填されており、試料を90分間60℃で蒸している。以降の処理のために不織布メッシュを柔らかくするために、エタノールが除去され、繊維は60℃90分間水蒸気で蒸している℃で<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig3large.jpg" target="_blank">大きい図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig4.jpg" /> 後処理に使用する付属の絹織メッシュと段ボールのフレームの図4。写真。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig5.jpg" /> 図5。Electrosp国連とその後は後処理乾燥状態（A）に、水（B）の下で不織布。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6.jpg" /> 図6。アミド（A）未処理および後処理（B）スパイダーシルク不織布メッシュの私はバンドのフーリエセルフデコンボリューションされた吸光度スペクトル。実線はデコンボリューション後派生のような単一の拠出ピーク（点線）に起因する吸光帯が表示されます。それぞれの曲線の割り当ては、文献22から以前に発行された値に基づいていました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig6large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:conten<html> T-幅= &quot;5インチ&quot;のfo：srcが= SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg&quot;を &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg&quot; /&gt; 図7非処理およびeADF4（C16）後処理織メッシュの二次構造含量。 <img alt="図8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8.jpg" /> 図8は 、異なるフィルタ基板上のエレクトロeADF4のSEM像（C16）繊維：ポリアミド（PA）、ポリエステル（PE）、ポリプロピレン（PP）、純eADF4（C16）繊維前（S1）と後（S2）、ポストエタノール蒸気を用いた治療。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig8large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 / ftp_upload/50492/50492fig9.jpg &quot;/&gt; 図9空気透過性試験の前（A）および後処理の後に（B）をエタノール蒸気で絹織布のメッシュの増大紡糸時次いで、空気透過性を低下させる多くの不織布層につながる。 <img alt="図10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10.jpg" /> 図10エタノールによる後処理後、シルク層量に影響を与える別の回転期間におけるポリアミドフィルタ材料に関するエレクトロスパイダーシルク不織布メッシュ、上のジ-エチル-ヘキシルsebacatエアロゾルのフィルター効率。

クモの糸繊維は、臨時の機械的特性を表示します。エンジニアリング<em&gt; Araneusのdiadematusの</em&gt;フィブロイン4（eADF4）はエレクトロスピニングを用いた不織布メッシュに加工することができる。ここで、eADF4織メッシュは空気除菌装置の性能を改善するために使用される。

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

本実験の全体的な目的は、微小粒子のろ過のためにクモ糸不織布メッシュを堆積させることで、市販のフィルター材料を改良することである。まず、凍結乾燥した組換えクモ糸タンパク質をHFIPに溶解し、適切な紡糸ドープを調製する。次に、この溶液をさまざまなフィルター材料上に電界紡糸し、それらの材料をシルクおよび不織布層でコーティングする。次に、絹のサブマイクロメートル繊維をエタノール蒸気で処理し、安定した水溶性構造を誘導することで、その後の取り扱いが容易になるよう不織布を軟化させます。水蒸気でサンプルを加湿した結果、粒子ろ過測定に基づくと、合成ポリマーのメルトブローと比較して、紡糸時間、およびそれに伴う層の厚さがフィルター効率に明確に依存していることが示されました。エレクトロスピニングでは、合成ポリマーよりも直径が約10倍小さく、サイズ分布の狭い繊維を得ることができます。重要な点として、生分解性クモ nano fibers を使用することで、他のポリマー繊維に伴う潜在的な健康リスクを低減できます。したがって、この手法は技術的ろ過の分野で高い有用性を提供できます。また、クモ糸の不織布メッシュが創傷治癒を促進できるため、創傷被覆材などの医療システムにも適用可能です。私たちは、さまざまな手法でクモ糸繊維の作製を試みた際に、最初にこの手法を考案しました。エレクトロスピニングによって得られた微小な直径に着目し、それを空気ろ過装置に利用するというアイデアに至りました。20 mgの凍結乾燥タンパク質に200 µLのHFIPを加え、容器を封印してボルテックスミキサーで1分間振とうして溶液を清澄化し、室温で一晩インキュベートして、紡糸ドープ懸濁液を調製します。エレクトロスピニング装置を準備するには、フィルター材料を対極の上に配置し、電極と対極の両方の電圧をあらかじめ設定します。次に、体積流量を設定します。毒性のあるHFIPが蒸発するため、電界紡糸装置がドラフトチャンバーに接続されていることを確認してください。明確なテイラーコーンを形成させるために、20ゲージの針の鋭い先端を削り、残りの長さを30 millimetersにします。次に、針を1 mLのシリンジに接続します。紡糸ドープをすべてシリンジに充填し、紡糸プロセス中に溶液が完全に押し出されるように、ドープの上に100 µLの空気を重ねます。次に、充填したシリンジを電界紡糸装置のシリンジポンプに取り付けます。針先に液滴が現れるまで、慎重にプランジャーを押し込みます。次に、プランジャーを固定します。針先と対極との距離を8〜20 cmに設定してください。高電圧電源を接続した後、シリンジポンプを始動させ、針の先端から液滴を取り除きます。直ちに電界紡糸装置のすべての安全設備を有効にし、高電圧電源を起動します。新しい液滴が現れた直後に操作を行います。リコンビナントクモ糸タンパク質の電界紡糸は湿度や温度に依存し、個々の研究室の条件に合わせてプロセスパラメータを調整する必要があるため、ストップウォッチを使用して紡糸時間を制御してください。規定の電界紡糸時間が経過した後、シリンジポンプを停止させます。10秒後に高電圧電源を切ることで、不織布状のメッシュを作製します。その後の安定性試験に使用します。ろ材の代わりに黒い紙を使用してください。エレクトロスピンニングを5分間行った後、前述の手順に従い、60 °Cに予熱したオーブン内で処理を停止させます。不織布メッシュを備えたフィルター基材を垂直に配置します。2つの開口部があるロック可能なガラス容器の壁面から、サンプルまで最低2 cmの間隔を空けてください。溶媒の導入には、一方にエタノール、もう一方に水を充填した2本の60 mLシリンジを使用し、シリコンチューブを後処理容器の底面内側に向けて接続します。後処理用容器をオーブンに入れ、シリンジでエタノール60 millilitersを注入します。ストップウォッチを使用して処理時間を管理してください。その後、シリンジでエタノールを除去し、別のシリンジから水60 millilitersをさらに90分かけてガラスに注入します。その後、水を除去し、オーブンをオフにします。結露による水滴の発生を防ぐため、容器が完全に冷却されてからオーブンから取り出してください。安定性試験には、黒い紙またはその他の取り外し可能な支持体に紡糸したシルク不織布メッシュを使用します。両面粘着テープを調整します。次に、段ボールから2つのフレームを切り出します。一方のフレームを、黒い紙上に配置したシルク不織布メッシュの上に押し当てます。次に、不要な不織布メッシュを切り取り、フレームを慎重に取り除きます。その後、同様の手順で2つ目のフレームを取り付けます。実用的なディップテストを行うため、前処理後のシルク不織布メッシュと未処理のシルク不織布メッシュのサンプルを用意し、脱イオン水に浸します。未処理のシルク不織布メッシュがすぐに溶解することを確認してください。一方、処理済みの不織布メッシュは安定した状態を維持します。その後、風乾させてください。SEMイメージング用のサンプルに対し、不織布メッシュの後処理によるシルクタンパク質の構造変化に関する情報を得るため、フーリエ変換赤外分光法を適用します。透過モードを選択し、スキャン範囲を800から4,000 cm⁻¹に設定します。各スペクトルについて60回の累積測定を行い平均化し、スペクトルごとに1回のレファレンス測定を行います。Mについて、データの定量分析を行うには、フーリエ自己デコンボリューションを用います。曲線の範囲を1,590から1,705 cm⁻¹に設定し、ベースライン補正も行います。その後、2006年にSchuらによって詳述された局所最小二乗法によるフィッティングを算出します。次に、SEMイメージングを用いて、異なるフィルター基材上の絹繊維の直径と形態を調査し、後処理が繊維形態に及ぼす影響を分析します。十分に詳細な画像を得るために、5,000倍から25,000倍の倍率を使用してください。まず、フィルター材料の適切な部位を装置の測定領域に配置します。メーカーの指示に従ってアキュトロン空気透過性測定装置を使用し、規格化されたデータを記録します。サンプルの少なくとも10か所の異なる部位からデータを収集した後、算術平均を算出してフィルター効率を決定します。ユニバーサル粒子径分析計など、圧力制御機能と粒子計数機能を備えた適切な装置を使用してください。不織布メッシュの破壊を防ぎ、汚染を避けるため、サンプルは慎重に取り扱い、表面に触れないようにしてください。性能測定のために、同等の品質のサンプルを十分に作成してください。HFIP中で10% w/vの濃度に調製した組換えクモ糸を、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエステルなどの異なるフィルター材料上で電界紡糸した結果、直径80から120 nanometersの範囲の滑らかな繊維が得られ、さまざまなフィルター材料上で不織布メッシュを形成することが可能となりました。エタノール蒸気による後処理では顕著な形態学的変化は見られず、シルク不織布の後処理法として適切であることが確認されました。構造変化はFTIRを用いて検出され、続いてアミドIBバンドのFSDを行うことで、個々の寄与ピークの解析を実施しました。興味深いことに、後処理によってβシート構造が増加し、一方でαヘリックス構造およびランダムコイル構造の含有量は減少することが明らかになりました。この結果は、前処理を施した不織布メッシュを水に浸すことで実際に証明できます。前述の通り、紡糸時間はシルク不織布メッシュをフィルター材料に適用する際において最も重要なパラメータであり、紡糸時間が長くなることで繊維層の数が増加し、その結果、空気透過率が指数関数的に減少します。同様に、サブミクロン粒子のシルク含有フィルター材料のろ過効率は、その形成に伴い向上します。この技術は、バイオインスパイア材料分野の研究者が、技術的応用における高い可能性を追求するための道を開きました。このビデオを視聴することで、組換えクモ糸タンパク質をサブマイクロメートルの不織布メッシュに加工する方法について、十分に理解できるはずです。これは微小粒子のろ過に有用です。HFIPの取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、常にドラフトチャンバーの使用などの予防措置を検討してください。

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Bioengineering

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