Name: の検討ショウジョウバエ幼虫気管ターミナルセル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫気管ターミナルセルの形態解析法。GFP蛍光標識と熱固定を用いて、野生型と変異体の細胞形態を迅速に分類・定量化できます。遺伝学的スクリーニングに適した高速イメージング技術です。

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私たちは、原稿上のコメントにジリアンスタンフィールドに感謝します。 TAJはNIHのNIGMSからユタ遺伝トレーニンググラントT32-GM007464大学によってサポートされています。

1。モザイク生成<ol><li> 遺伝的交雑 W FRT 19A浴槽 ：GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4、UAS-GFP（男性）X *を検討する変異を表し* FRT 19A / バル （メス）、。注：これは動物が適切に嵌合することができるように、実験前に少なくとも1日を越える設定します。 </li><li> プリ素人：転送クロスメディア上に置かれ、新鮮な酵母ペーストの小さな汚れとフライ食品のバイアルへ。 25℃で1時間置くことを許可</li><li> レイ：新鮮な酵母ペーストの小さな塗抹標本と新鮮なバイアルにプリ置くバイアルから動物を転送します。 25℃で6時間置くことを許可</li><li>その後の実験で貯蔵および使用のために事前に置くバイアルに戻って大人を転送します。すぐにヒートショック循環水浴中で38℃で45分間のために0-6時間古い胚を含む素人のバイアル。注：食品の表面はすべてを検証するために水位より下でなければなりません胚を適切にショックを受けて加熱されています。 </li><li> 3齢幼虫がさまよい始めるまで4-5日間25℃でヒートショックバイアルをインキュベートする。 </li></ol> 2。モザイク動物用の画面<ol><li>細かい鉗子を使用すると、静かにバイアルの側面から放浪サード齢幼虫を選んで、小さなプラスチック板でチルド100％グリセロールにそれらを配置します。 </li><li>蛍光光学系を搭載した高倍率·解剖顕微鏡を使って幼虫を調べます。蛍光標識された気管の細胞のモザイク表現で幼虫を識別します。通常、これは10〜20倍の倍率で行うことができる。 </li></ol> 3。熱固定<ol><li>細かい鉗子を使用して慎重に75x25x1 mmの白いガラスの顕微鏡スライド上に新鮮な100％のグリセロールのドロップディッシュと場所のモザイク動物を選び出す。注：複数の動物を降下（ 図1A）に配置することができる。 動物はまた、カバースリップ上に直接グリセロールの低下に配置することができ動物は非常に迅速に加熱され、オーバー固定になることができるとしてではなく、ケアが、固定（ステップ3.2）中に撮影されなければならない。 </li><li>動物まで、70℃のヒートブロック上に配置したスライドガラスは、単にカバースリップ（ 図1B）のためにスライドし、10秒間、何以上20秒移動しない停止。動物は、最初は身をくねらせますが、停止して、剛性と細長い一度死んだようになります。注：熱過ぎる暴露は、端末の枝やルーメンを損傷するだけでなく、薄暗いと拡散GFPシグナルを作ります。最適な効率のためには、顕微鏡と同じ部屋にヒートブロックを持っていることをお勧めします。 </li><li>オリエントは慎重にスライド上のすべての幼虫が互いに（ 図1C）に平行に配向しているような一方向にドロップ全ての幼虫を、細かい鉗子を使用する。 </li><li>そっと幼虫の上部（またはスライドガラス上にカバースリップを反転）に18x18mmマイクロカバーガラスを配置し、気泡を形成します（ 図1D）を避ける。注：カバースリップは、正確に嘘をつかないこと幼虫以上フラット、これは問題ではありません。 </li><li> 30分以内に撮影幼虫。熱固定端末セルが劣化するとGFP信号が極めて拡散になるであろう。 </li></ol> 4。気管ターミナル細胞のin vivoイメージング <ol><li>複合実体顕微鏡のステージ上でスライドを置きます。動物の背側表面（ 図1F）で後部に前方から実行している2つの平行背トランクを見つけ5X対物レンズを用いて。直接2背トランクの間に2つの背側の端子セルを探します。これは、分析のための適切なセグメントを識別するのに役立ちます。 </li><li>一度指向、画像希望の端末細胞に動物を回転させます。これを行うには、慎重にゆっくりとカバースリップ（ 図1Eおよび1G）の下に幼虫を転がり、幼虫の長軸に鉗子垂直な端にカバースリップを押してください。 </li><li>適切な端子セルを選択すると、一貫性のある結果を得るために重要であると変異体間の比較。体脂肪ブランチ（FB）端子細胞が簡単に正中線に横背トランクに隣接発見されています。横グループG端子細胞は（LG）を簡単に発見されたと腹側正中線（ 図1H）のちょうど横に位置しています。注：ほとんどの前方（Tr1部）と後部（Tr10を）セグメントにおける端末セルの配置が他のセグメントから発散です。我々は唯一のセグメントTr2を-Tr9の、端末細胞を分析する。背ターミナル細胞は他の気管の端末細胞よりステレオタイプの分岐パターンを持っている。これは、付加的、非細胞自律的な信号に依存することが、分析に含めるかどうかを決定する際にこれを考慮すべきである。 </li><li>その他の端末のセルが識別されたら、所望の倍率を使用してイメージをキャプチャ、典型的には10X又は20X（ 図2A）が最適である。注：変数分岐パターンに起因するが、できるだけ多くの枝と枝のヒントとして含める画像をキャプチャしよう。 </li><li>ステージを移動させずに、蛍光のスイッチをオフにし、同じセルと焦点面（ 図2B）の明視野画像をキャプチャするために透過光をオンにします。ルーメンは暗くターミナルセル空間内対照として視覚化されます。末端細胞の枝やルーメンを定量化することを計画している場合は、各端末のセルの複数の焦点面に複数の画像を収集しています。 </li></ol> 5。 ImageJのを使用してターミナル細胞形態の分析と定量<ol><li> ImageJの（用いた蛍光と明視野画像を開き<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ）NeuronJプラグイン（ <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/を</a> ）。 </li><li> &quot;追加トレーシング&quot;ツールを使用して、手動で端末全体の細胞の枝や内腔をトレースします。 </li><li> &quot;ラベル·トレーシング&quot;ツールを使用して、名前の変更およびrトレース内の特定の指定を各ラインを割り当てるecolor。 </li><li> &quot;パラメータ設定&quot;ツールを使用して、6-10ピクセルから線幅を調整（複合顕微鏡に接続されたデジタルカメラから得られた512×512の画像のために。高いか低い解像度のカメラでは、ピクセル幅が適切にスケーリングする必要があります）、すべてを使用してその他のデフォルト設定、および &quot;OK&quot;を選択します。その後、画像を取るために &quot;スナップショットの作成&quot;ツールを使用します。オリジナルと並べて表示することができるトレースのスナップショットを取得するには、 &quot;トレースを描く&quot;を選択します。 </li><li> &quot;測定トレーシング&quot;ツールを選択して、トレースタイプ（ すなわちステップ5.3で割り当てられた固有の名称に基づいて測定するためにどの枝）を選択します。次に、 &quot;RUN&quot;をクリックしますと &quot;クリア以前の測定&quot; &quot;トレースの測定値を表示する&quot;を選択します。これは、名前、ラベルの長さ（ピクセル単位）、およびイメージの他のデータを含むスプレッドシートを生成する。このデータは、さらに、統計のためのMicrosoft Excelスプレッドシートとして保存することができます分析。 </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
<li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li>
<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。

ここで説明した熱定着方式は、撮像ショウジョウバエの幼虫の気管末端細胞の迅速かつ便利なツールである。ここでは、野生型細胞の分岐とルーメンパターンを調べるためにこのテクニックを使用しています。 息気管特異的プロモーターによって駆動GFPを発現する気管細胞は熱固定後の幼虫のクチクラを通じて簡単に可視化することができる。特定の分岐個別端末のセルのパターンと同様に、空気で満たされた管腔のものは、迅速に可視化し、この方法を用いて測定することができる。この技術はまた、第1及び第2齢幼虫を行うことができる。蛍光タンパク質の発現が容易に破壊することができるようにしかし、注意が、小さい動物を固定で撮影しなければならない。 ここに示した方法では、単一の気管細胞で発現GFPをモザイク動物の分析が記載されている。ただし、同じ技術がnumbe下気管細胞の分析に適用可能である実験操作のR。例えば、遺伝子発現をRNAiの導入遺伝子又は修飾されたタンパク質の発現によって分子のアプローチによって、気管システム全体または個々の細胞における改変された動物は、また、この方法で検査すること...

セル形状は、組織または器官の一部として、個々の生体内の細胞、ならびに細胞機能の機能にとって重要である。分岐管形成および（lumenogenesis）：我々は、細胞の形態の2つの保存種類の制御に関与する分子機構を調べるためにショウジョウバエ気管末端細胞、昆虫呼吸器システムの構成要素を使用する。端子細胞は、機能が内部組織1に酸素を提供し、標的組織内のローカル2酸素レベルによって制御されるFGFシグナル経路に依存する精巧な分枝状形態を有するようにすること分岐状のチューブネットワークの先端に配置されている。ターミナル細胞の枝には、各ブランチを介して実行してガスを充填した細胞内腔と、細い管である。遺伝子解析がショウジョウバエにおいて実行される際の容易性と共に端末細胞の別個のセルラーアーキテクチャでは、これらの細胞の優れたモデルfを行うまたは、細胞の伸長のメカニズムを調査して分岐し、細胞内の管形成。端末細胞は、分枝状細胞分化、伸長、および成熟2-4に至るシグナル伝達経路のいくつかを理解するのに有用なモデルを証明している。公正このシステムを用いて、細胞形態形成変異体のための順遺伝子スクリーニングは、細胞形状5,6を制御するメカニズムについての洞察を得行われている。インテグリン媒介接着は分岐安定8に必要であること、、例えば、これらの画面には、特定のRabGAPが管腔形成とポジショニング7における細胞骨格の極性と小胞輸送に必要とされることが明らかになっていると、その上皮PAR-極性タンパク質が必要な偏光膜輸送を規制分岐と管腔形成9の両方に。端末細胞における他の研究は、非対称アクチンの蓄積と微小管の組織細胞の伸長およびlumenogenesisに必要であることが示されている<s&gt; 10まで。このように、多様な、保存された細胞生物学的メカニズムは、端末細胞形態形成に貢献しています。 ここでは、急速に、端末セル分岐と管腔形成の分析にそのままサード齢ショウジョウバエの幼虫を修正する方法について説明します。このプロトコルはまた、第1及び第2齢動物で行うことができる。この手法の鍵は、遺伝的に直接、そのまま動物の幼虫のクチクラを通じて蛍光タンパク質発現によって標識されているターミナル細胞を可視化する機能です。この手順は、このような抗体染色などの任意の定着後の操作は、細胞を観察する必要がないので、よく遺伝子または薬物スクリーニングを含む、ハイスループット分析に適している。蛍光タンパク質の発現は、細胞質で満たされた分岐の構造を明らかにする。管形成は、並列周囲を埋める流体と対照ガス充填管腔を識別する明視野顕微鏡を使用して監視することができる編組織。 このプロトコルに含まれているそれ以外の場合は未標識動物における蛍光タンパク質で標識されたホモ接合変異体端末細胞を産生するためのMARCMシステム11に基づいて、遺伝的モザイクを生成する方法である。端末細胞は、比較的遅い開発におけるそれらの複雑な構造を詳しく説明するため、これは必要であり、遺伝的モザイクは、以前の開発における他の組織における遺伝子要件のバイパスを可能にする。 。MARCMクローンを生成するには、気管がここで説明息気管固有のドライバ（BTL）12を用いて標識していると、 ショウジョウバエの X染色体のためのプロトコルであり、他の染色体のために、同様の手順である染色体に適した遺伝試薬で、使用することができます検討した。ここでは、気管細胞質局在化GFPの発現によってラベル付けされますが、手順はそのようなDsRedのような他の蛍光タンパク質の発現でも同様に動作します。 さらに、我々はニューロンの分岐パターン13を特徴付けるために開発された方法に基づいて、端末細胞の分岐パターンと管腔形成を定量化する方法が含まれている。定量的なこの種のデータは、目の肥えた正確な分岐またはlumenogenesis過程における遺伝子の役割だけでなく、さまざまな変異体9との間の直接比較を可能に重要なことができます。

<table><tbody><tr><td>Student Dumont #5 鉗子</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td></tr><tr><td>100% Glycerol</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>フライストック</td><td></td><td></td><td>遺伝子型:w FRT19A浴槽:GAL80 FLP122;Btl-GAL4、UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>フライストック</td><td></td><td></td><td>遺伝子型:y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

の検討<em&gt;ショウジョウバエ</em光学顕微鏡で&gt;幼虫気管ターミナルセル

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

セル形状は、細胞の機能にとって重要である。しかし、細胞の形態の重要性にもかかわらず、少し特定の形状を生成する方法を個々の細胞について知られている。 ショウジョウバエ気管末端細胞は細胞の形態を生成するために必要な遺伝子の役割を識別し、解明するための強力な遺伝モデルとなっている。端末細胞は、分岐筒ネットワークの構成要素は、内部組織に酸素を供給するように機能することを気管系である。ターミナル細胞は、彼らは二つの異なる携帯電話のアーキテクチャを持っているとして、セル形状の問題を調査するための優れたモデルです。まず、端末細胞は、複雑なニューロンと同様の精巧な分枝状の形態を有し、第二、端末のセル枝は細い管として形成され、膜結合型細胞内腔を含んでいる。端末セル枝番号、分岐組織と個々のブランチ形状の定量分析を、特定の遺伝子メカの役割に関する情報を提供するために使用することができる分枝状細胞の意思でanisms。これらの細胞における管形成の分析は、例えば脊椎動物の脈管構造のような他の管状ネットワークに共通の細管形成の保存メカニズムを明らかにすることができる。ここでは、迅速に、画像を固定するために使用することができる技術を記述し、 ショウジョウバエの幼虫内でも分枝パターンと端子細胞における管形成を分析する。これらの技術は、野生型および変異動物細胞内の端末、または遺伝子モザイクを分析するために使用することができる。このため、プロトコルの高効率化のため、それはまた、遺伝よく、RNAiのベース、またはショウジョウバエ気管系における薬物の画面に適している。

結果を図2に示す。や枝のそれぞれを介して実行してガスを充填した細胞内腔;単一横グループ（LG）ターミナル電池は広範囲細胞内分岐（GFPによって可視化）を示しています（明視野顕微鏡による可視化を、B）。これらの画像は、モザイクL3幼虫から収集セクション1及び2に記載MARCMシステムを用いて生成され、熱が固定され、結像などのセクション3及び4に記載されている。パネルC＆Dは、A＆Bパネルに示されている画像のそれぞれの枝のようにセクション5で説明NeuronJ生成されたトレースと、内腔を示すE＆F幼虫の脂肪体（FB）枝の位置を示しセクション3及び4に記載の撮像のために調製。この例では、動物はモザイクではなく、GFPが全体気管システム全体で表現されることに注意してください。パネルG、Hはあまりにも長い時間のために固定熱だったGFP標識末端細胞の一例を示している。 GFPは、びまん性である（G）、BRANCHEsが壊れており、内腔の部分は、もはやガスが満たされていない、ので、明視野像で休憩として現れる。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

ここでは、気管内端末細胞の光学顕微鏡分析のための方法を提案する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫。この方法は、動物全体の支店および内腔の形態の迅速な検査を可能にし、個々の変異体または端末細胞の発達に影響を与える変異の画面の分析に有用であろう。

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

この手順の全体的な目的は、気管末端細胞における分岐および管の形態をイメージングするため、無傷のショウジョウバエ幼虫を迅速に固定することです。これは、まず遺伝的モザイク個体において、蛍光タンパク質で標識されたホモ接合体の末端細胞を作製することで達成されます。手順の第2ステップでは、モザイク幼虫を回収し、熱を用いて固定します。第3のステップは、固定した動物におけるラベル付けされた末端細胞のイメージングであり、GFP発現を用いて分枝を、明視野顕微鏡を用いて管を観察します。最終ステップは、末端細胞の形態の定量化です。最終的に、これらの結果を用いて、野生型および変異型の末端細胞の異なる細胞形態を区別し、分類することができます。化学固定などの既存の技術に対する本手法の単純な利点は、極めて迅速であるため、気管末端細胞の高スループット解析に使用できることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、L3幼虫を選別し、形態を保持するために迅速に固定することに注意と配慮が必要であるため、苦労することがあります。モザイクフライを作製するためには。解析対象の変異を持つ雌を用いてMark M法を実施します。新鮮な酵母ペーストを塗布した産卵前バイアルに交配セットを組み、25 °Cで1時間産卵させます。その後、ハエを産卵前バイアルから新鮮な酵母ペーストを含む新しいバイアルに移し、25 °Cで6時間産卵させます。6時間後、成虫を保存用の産卵前バイアルに戻し、直ちに後続の実験に使用します。回収した産卵バイアルを循環水槽に入れ、38 °Cで45分間ヒートショックを行います。その際、すべての胚に適切にヒートショックが加わるよう、培地の表面が水位よりも下になるようにしてください。その後、ヒートショックを与えたバイアルを25 °Cで4〜5日間、3齢幼虫になるまでインキュベートします。精密ピンセットを用いて、徘徊行動を開始させます。バイアルの壁面から徘徊している3齢幼虫をそっと取り出し、小型プラスチックプレートに入れた冷却済みの100% glycerolに配置します。蛍光光学系を備えた高倍率解剖顕微鏡を用い、10倍または20倍の倍率で幼虫を観察します。蛍光標識された気管細胞のモザイク発現を示す幼虫を特定します。次に、精細ピンセットを用いてそれらの個体を慎重にピックアップし、白いガラス製顕微鏡スライド上の新鮮な100% glycerolの一滴の中に配置します。顕微鏡と同じ部屋であれば、一滴の中に複数の個体を配置することが可能です。動物が停止するまで、ガラススライドを70 °Cのヒートブロックに置きます。通常、これは20秒以内に起こります。最初は動物がもがきますが、次第に硬直して伸長します。死後、長時間さらすと末端枝に熱損傷が生じ、ルーメンも損傷するため注意してください。GFP信号が弱まり、拡散します。加熱固定のタイミングは非常に重要であり、固定しすぎると細胞が損傷し、分析結果を誤認させたり解析を困難にしたりする可能性があるためです。したがって、サンプルをヒートブロックに配置し、細胞の動きがちょうど止まった時点で固定を終了させ、それ以上の加熱は避けてください。次に、精密ピンセットを使用して、固定したすべての幼虫を互いに平行になるように慎重に配置します。その後、幼虫の上にマイクロカバーガラスを静かに載せ、気泡が入らないようにします。カバーガラスが完全に平らでない場合がありますが、問題ありません。その後30分以内に、幼虫のイメージングを行ってください。熱固定した末端細胞は急速に分解し、GFPシグナルが非常に拡散するためです。次に、スライドを複合実体顕微鏡のステージ上に設置します。5倍の対物レンズを用いて、動物の背面で前方から後方に向かって走る2本の平行な背側主幹（dorsal trunk）を確認します。次に、これら2本の背側主幹の間に位置する2つの背側終端細胞を確認します。これにより、解析に適したセグメントを特定することができます。方向を定めた後、ピンセットでカバーガラスの端を慎重に押して動物を回転させ、目的の末端細胞を撮影します。動物の長軸に対して垂直にこの操作を行うことで、幼虫をゆっくりと転がることができます。一貫した結果を得て変異体間で比較を行うためには、適切な末端細胞を選択することが不可欠です。脂肪体分枝末端細胞は、背側幹の隣、正中線より外側で容易に見つけることができる。側方群G末端細胞は容易に見つけることができ、最も前方の節および後方の節において、腹側正中線のすぐ外側に位置している。末端細胞の配置は、他の節とは異なっている。これらのセグメントを調べるのではなく、細胞とセグメントに焦点を当てる必要があります。TR 2から9の背側末端細胞は、他の気管末端細胞よりも定型的な分岐パターンを示します。これは追加の非細胞自律的なシグナルに依存している可能性があり、解析に含めるかどうかを決定する際に考慮すべき点です。目的の末端細胞を特定したら、分岐パターンが多様であるため、10倍または20倍の倍率で画像を撮影します。ステージを動かさずに、できるだけ多くの分岐と分岐端を含むように撮影してください。その後、蛍光光を消し、透過光を点灯させます。同一の細胞および焦点面の明視野像をキャプチャするため、終末細胞腔内のルーメンを暗いコントラストで描出します。終末細胞の分枝とルーメンを定量化するには、各終末細胞の複数の焦点面で複数の画像を収集します。細胞によっては、十分なデータを収集するのに1枚の画像で済むものもありますが、別の焦点面で最大3枚の個別の画像が必要な場合もあります。すべての分枝をキャプチャするには、neuron JプラグインをインストールしたImageJで蛍光末端明視野画像を開きます。「Add tracings」ツールを使用して、末端細胞全体の分枝とルーメンを手動でトレースし、「Label tracings」ツールを用いてリネームおよび再配色を行い、トレース内の各ラインに特定の名称を割り当てます（画像サイズは512×512ピクセル）。「Set parameters」ツールを使用して、ライン幅を6～10ピクセルに調整します。解像度の高いまたは低い画像に合わせて、適切にスケールを調整してください。その他の設定はデフォルトのままにして「OK」を押します。その後、「make snapshot」ツールを使用してください。画像を撮影するには、[draw Trace]を選択して、元の画像と並べて表示できるトレースのスナップショットを取得します。[measure tracings]ツールを選択し、該当するトレースを選択してください。特定の指定に基づいて測定するブランチを入力します。次に、display tracing measurementsを選択します。続いて、以前の測定値を消去し、runをクリックします。これにより、統計解析用に保存される画像の名称、ラベル、ピクセル単位の長さ、およびその他のデータを含むスプレッドシートが作成されます。GFPで可視化したMosaic L3幼虫の変異気管細胞を解析するために、概説したプロトコルに従った。明視野観察において、標識された単一の側群末端細胞（LG）は広範な細胞内分枝を示している。Neuron Jを用いることで、各分枝を走るガスで満たされた細胞内腔が明確に確認できる。分枝および管腔のトレースを作成した。この非モザイク個体において、脂肪体末端細胞（FB）が同定されている。GFPが気管系全体に発現していることに注目してください。このビデオを視聴することで、個体の発生後、生体内の気管末端細胞において画像を迅速に固定し、定量解析を行う方法について十分に理解できるはずです。この技術により、気管末端細胞を細胞形態形成の諸側面を理解するための重要なモデルとして利用する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、固定、包埋、切片、および後期のイメージングのためのプロセスについて説明...

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出典:Jeong, S. Visualization of the Axonal projection pattern of the Embryonic motor neurons in Drosophila.J. Vis. Exp.

ショウジョウバエにおける胚性運動ニューロンの軸索投影パターンの可視化

気道繊毛運動と繊毛生成されたフローをマウス気管を使用して可視化し、定量化するための簡単​​で信頼性の高い技術が記載されている。この技術は様々な要因が薬理学的薬剤、遺伝的要因、環境曝露、及び/又は粘液負荷などの機械的要因を含む、繊毛運動性にどのように影響するかを決定するために変更することができる。...

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免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

ショウジョウバエおよび哺乳動物の造血系は、 ショウジョウバエの造血を研究するための魅力的な遺伝モデル作り、多くの共通の特徴を共有します。ここでは、免疫組織化学のための主要な幼虫の造血器官の解剖と取り付けを示しています。また、循環血球と固着液晶セルを含む様々な幼虫の造血コンパートメントをアッセイする方法を記載しています。...

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親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

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