Name: 非侵襲的方法その場で女性アメリカンロブスターにおける交配の成功（の決定ロブスターのamericanus） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶ、アメリカンロブスター（Homarus americanus）の雌における非侵襲的な交配成功評価法。漁業による影響を受ける繁殖動態を理解し、持続可能な資源管理に貢献するための現場での簡易技術を紹介します。

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彼らの協力ははるかに高く評価されている - 著者は、そのボート我々はからサンプルを許可されたすべてのニューイングランドの商業lobstermanの複数形に感謝したいと思います。加えて、我々はリトルベイロブスターカンパニー（ニューイントン、ニューハンプシャー州）、私たちは彼らの施設でサンプリングを行うことが許さチャンプリンのシーフード（ポイントジュディス、RI）を感謝します。次のUNHの学生がこの研究を通して非常に貴重な支援を提供：ヘイリーホワイト、フランソワーズ·モリソン、サラHavener、オードラシャプー法、5月グロースを。このプロジェクトは、WHW（プロジェクト＃のR/CFR-11）と共同研究会へのUNHマリンプログラム付与するには、NHのSeaGrantからの補助金によって支えられている。

パートA：フィールドサンプリングテクニック 1。女性の測定<ol><li>各女性のロブスターは、甲長（CL）およびキャリパーのペアを使用して、最も近い1.0ミリメートルの第二の腹部のセグメントの幅を測定。 注：（雌は卵を運ぶ）腹部の幅は性成熟の指標であるので、第2腹節が測定される。また、（ステップ1.2参照）に保存生殖成長段階で、これらのデータと一致するように脱皮段階を確認するために有利であり得る。 </li><li>腹部の腹肢（ロブスター内の標準方法論のプロトコル）の1から小さな遠位部をクリップし、後に解剖顕微鏡9で観察するためのクリーンな海水で腹肢を保存する。 注：このステップはまた、女性が自分の卵10を押し出すために準備をしている指標である腹肢、上のセメント腺の存在を明らかに可能性があります。 </li></ol> 2。針INSErtion <ol><li> （、18 G、表1を参照）注射針を挿入〜45°（ 図1）〜尾に向かって角度のついた精液のレセプタクルに1cmの。 注：それは前に精液レセプタクル（ 図1）の下部にある精子の最高濃度に到達する精子のプラグを介してプッシュされるように完全な精子プラグが付いているロブスターでは、針は、挿入の間に多少の抵抗を満たすことがあります。 注：プラグの存在は、それ自体では、ロブスターが交尾している信頼性の高い指標である。いくつかの動物ではない精包が存在しない可能性があるため、ほとんど抵抗があってもよい、精包は、それがまだプラグに硬化していないか、またはそれが既に卵の一つ以上のクラッチを受精するのに使用されている可能性が小さい。 </li></ol><img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50498/50498fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50498/50498fig1.jpg" wid目= &quot;600PX&quot; /&gt; 図1。針の挿入やロブスター精液レセプタクルの眺め。精子サンプルを抽出するロブスターの精液レセプタクルに鈍先端が針を挿入。針の角度と深さは、両方の一貫性のあるサンプルを得るために重要である。右：解剖し、縦方向に分割されている精液のレセプタクルの眺め。精子が容器の下部（最深部）に位置している間、精子のプラグは、コンセントの上部または最も外側の部分を占めている。それは、この深さ以下のサンプリングはレセプタクルを穿刺し、血液で汚染されたサンプルをもたらすかもしれないことに注意することが重要である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50498/50498fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 3。精子プラグを貫通<ol><li>最初の挿入後に、（体軸に垂直な）ほぼ垂直に、針の角度を急勾配にし、非常にゆっくりと作業を開始下向きレセプタクルに。 </li><li>先端が尾の方に少し指摘されるような角度で傾いた針を保管してください。それが最終的にマトリックスに浸透するまで、この場合、針の先端は、プラグの上部を圧縮している。 </li><li>抵抗をもう一度感じられるまで徐々に下方向に針をプッシュし続ける - これは、容器の底部にあり、どこでサンプルが採取されている。 </li></ol> 4。精子の取り外し<ol><li>レセプタクルの底からのサンプル（しばしば固体プラグ材料、液状精子と他の流体）を外し、ラベルされた2.0ミリリットルのプラスチックチューブにサンプルを堆積させる。 </li><li>冷たい海水〜0.1〜0.5ミリリットルとレセプタクルをフラッシュします。 </li><li>同じチューブ内の流体と場所の約0.3ミリリットルを削除します。 </li><li>氷上ストア精子サンプル彼らは実験室で検査することができるようになるまで。 パートB：ラボでの精子サンプルの検討 注：個々のLの精液コンセントから取り外しサンプル<html> obstersは精子細胞が存在するか存在しないかどうかを決定するために検討すべきである。 </li><li>各プラスチック製のチューブ、カバーガラスでガラススライド上の場所、および複合顕微鏡で100倍の視野から〜流体の50μLを削除します。 </li><li>としてサンプルスコア：希少数多く、または存在しない精子（本研究では、実際の精子数は 、 図2を定量化しなかった）。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50498/50498fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50498/50498fig2.jpg" width="600px" /> 図2。ロブスター精子サンプル画像。40X倍率の複合顕微鏡で見たときに、女性の精液コンセントから取ったロブスター精子サンプルの画像。左の画像は、他の（右）スパースサンプル（スケールバー= 10μm）を示しているが、多数の精子が含まれていたサンプルを示しています。。JPG「標的= &quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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</ol>

著者らは、利害の衝突を宣言していません。

この動画と紙輪郭と雌ロブスターが正常交配しているかどうかを決定するための方法を実証する。このアプローチは、ユーザーの様々な海でのロブスターの大規模なサンプリングのために使用できることが十分に単純である。この方法は、交配の際にオスからメスのロブスターに渡される精液の容器に精包の存在を検出することに基づいています。これら精包は、部分的に、それらが容器内に堆積された直後の精子プラグに硬化するため、精子のプラグの存在はまた、交配の成功の指標である。この研究、ならびにその後の大規模な研究では、精子プラグのほとんどが精子それら11に関連付けられていたことを決定した。プラグの存在が交尾活動の信頼できる指標でありながら、しかし、その不在ではありません。 このサンプリング方法は、産卵のた​​め女性のロブスターの能力にマイナスの影響を被る場合、我々は完全に確信することはできませんが首尾よく彼らの卵のクラッチを受精さdは、損傷が精包またはレセプタクルのいずれかに最小限であることを示唆している、この精子の採取プロトコルへの側面があります。まだそこに卵の受精クラッチを押し出すいくつかの...

<html>アメリカンロブスター（ ロブスターのamericanus）は、北大西洋（〜3.9億ドルかけて評価され、2011年に56,000 MT、）1の中で最も生産的な漁業の一つです。しかし、野生の個体群におけるこの種の生殖ダイナミクスに関する理解の一般的な不足があります。積極的に再生に参加する人々の数とサイズを含む生殖出力のより正確な推定値を、生成することは、資源評価プロセスを改善することがあります。イセエビ2、ワタリガニ3、キングカニ4、石のカニ5、およびズワイガニたとえばによる精子の制限のため、完全な生殖能力を達成することを防止することができる女性はを含むいくつかの商業的搾取の海洋甲殻類の懸念として同定されている6。全体的な目標は、精子の制限が同様にアメリカのロブスター漁業のある領域に要因になるかどうかを判断することです。 NT &quot;&gt;（目に見えて無傷で、最近になって押し出さ卵）抱卵雌のロブスターと関係のないタグ付けの研究を行いながらロブスターの潜在的な精子の制限の問題の最初の兆候が観察された。〜これらの動物の15％が低下したことを示した漁師からレポートを奪還彼らの卵のクラッチわずか1〜2ヶ月後。作業仮説は、いくつかのロブスターは、結果として、7 &#39;落ちた&#39;、受精とされていなかった。その後の研究の予備的データはロブスターがあるという事実を確認した卵を運んでいたということでした彼らが成功して交配しておらず、これらの未受精卵にのみ〜1ヶ月8用に運ばれていても、卵を押し出しているため、自然集団における未受精卵を運ぶ人の女性の観察を考えると、我々は精子の制限はに貢献するかもしれない程度を決定しようとした性的に成熟したロブスターによる再生の最大下のレベル。この目標を達成するために、技術がspermatoを検出するために開発されました交配中に男性が堆積phore。 本論文では、ビデオは、女性のロブスターの交尾の成功を確認するために開発された非侵襲的な、簡単な方法を説明します。技術は海で、いずれかの研究や商業漁船に乗って迅速かつ確実に利用することができる。このサンプリング方法の詳細だけでなく、いくつかの代表的な知見は、技術の適用を例示するために提示される。

<table><tbody><tr><td>ノギス</td><td>Mitutoyo Digimatic</td><td>500-196-20</td><td>http://www.globalindustrial.com</td></tr><tr><td>3 ml Luer-Lokシリンジ</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309585</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Monoject アルミニウム ハブ 鈍い針、18 G x 1</td><td>ウェブスター獣医</td><td>8881202348</td><td>www.mywebstervet.com</td></tr><tr><td>2.0 ml プラスチック貯蔵チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>wu-06333-72</td><td>http://www.coleparmer.com</td></tr><tr>氷<td></td><td></td><td></td><td>付き発泡スチロールクーラー</td></tr><tr><td>複合光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BHシステム</td><td>http://www.olympusamerica.com</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td></td><td></td>付きガラス側面 <td>75 mm x 25 mm、厚さ1 mm</td></tr><tr><td>使い捨てチップ</td><td></td><td></td><td></td>付きピペッター</tr></tbody></table>

非侵襲的方法<em&gt;その場で</em&gt;女性アメリカンロブスターにおける交配の成功（の決定<em&gt;ロブスターのamericanus</em&gt;）

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

北西大西洋で最も生産漁業の1であるにもかかわらず、多くのアメリカのロブスターの自然な生殖ダイナミクスについて不明である。悪用甲殻類の個体数（カニやエビ）での最近の研究は、成熟したメスによる精子の制限により、完全な生殖能力を達成することができない事情があることを示唆している。アメリカンロブスター漁業の異なる領域にこの可能性を検討するために、信頼性があり、非侵襲的方法は、海上で女性のロブスターを大量にサンプリングするために開発されました。この方法は、精子プラグの有無を判定し、精子の存在について調べることができる試料を撤回する雌の精液容器に鈍い先端が針を挿入することを含む。制御一連の研究は、この技術の信頼性をテストするために、ドックで、実験室で行った。こうした努力は、294の女性ロブスターを確認するために、サンプリングを伴うことプレゼンスOFA精子プラグは、信頼性の高い容器の中の精子の指標、したがって、交配した。本論文では、方法論とサンプリングされた合計の女性のサブセットから得られた結果の詳細を示します。ジョージの銀行とCape Annのマサチューセッツ（甲長サイズ範囲= 71〜145ミリメートル）からサンプリングされた230の女性ロブスターのうち、90.3％が精子陽性であった。一部の女性では精子の不在のための潜在的な説明は次のとおりです。未熟さ（生理学的成熟がないこと）、卵のクラッチを受精するために使用された後の精子のプラグの故障、と相手活性の欠如を。調査は女性のロブスターの交尾の成功を調べるため、この手法は、自然集団における生殖活動を文書化する分野で使用可能な信頼性の高いプロキシであることを示している。

<html>ここに報告されたデータは沿岸と沖合の場所の両方から発信され、女性ロブスターのサブセットでした。沿岸グループはCape Annの、マサチューセッツ州に近い沿岸海域で捕獲され、検査のための実験室にクーラーに輸送された44ロブスターで構成されていた。 186 offshoreロブスターの合計は、ジョージ銀行でキャプチャされ、ニューハンプシャー州における商業holding施設でサンプリングした。 精子サンプルは、すべての動物から得て、すぐ上に記載した方法に従って、精子の有無を調べた。このサブセット内のすべての人の女性の90.3％の合計は、その独創的なコンセントで精子を持っていた。驚くべきことに、精子を欠いていたものは、サイズ範囲の小さい方の端（ 図3）である必要はありませんでした。 ighres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg...

アメリカンロブスター漁業として利用甲殻類漁業への漁業による変化、潜在的に交尾の成功が低下する、生殖ダイナミクスに影響を与える可能性があります。この研究の目標は、生理学的または機能的に成熟したことが女性のロブスターの交尾の成功を確認するための非侵襲的方法を開発することでした。

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

アメリカロブスターは、カナダの大西洋岸からニューイングランドに至るその地理的分布域全体において、象徴的な存在となっています。多くの地域において、米国東部で単一種として最大規模の漁業対象となっています。この漁業が持続的に成功しているのは、抱卵個体群を保護することを目的とした生物学的規制を含む、さまざまな管理策によるものです。これらの規制には、最小および最大サイズの制限、抱卵雌個体の保護、および実績のある親魚とされるVノッチ（V字型の切り込み）のある雌個体の採取禁止が含まれています。ロブスター漁業の将来は、一部にはロブスターの交配システムの成功に依存する、新たな加入個体の健全な供給にかかっています。しかし、世界中の他の甲殻類漁業と同様に、この漁業が激しく利用されているという性質は、本種の繁殖動態に影響を及ぼす可能性があります。したがって、本研究の目的は、性的に成熟した雌ロブスターの交尾成功を確認するための、簡便で非侵襲的な手法を開発することでした。ロブスターの雌雄は、左図に示す腹面を確認することで最も明確に判別でき、雌は主に、平らで羽状の第1対の PLE pods によって特徴づけられます。また、雌は楕円形の受精嚢を持っており、そこに雄から受け取った精包を貯蔵します。右側にオスが示されており、やや円錐形で硬化した第1腹肢によって識別できます。これらの交接肢は、精包をメスの受精嚢へ転送するのを助けます。また、このSPOメタファーが押し出されるオスの生殖孔も示されています。求愛過程において、オスのロブスターとメスのロブスターは、化学的に媒介されるコミュニケーションや巣の共有を含む複雑な行動を示します。巣の共有行動は、メスの脱皮前後 both に発生し、オスによる配偶者ガードであると解釈できます。交尾は通常、メスが脱皮した後の1時間以内に起こり、非常に短時間で終了します。オスは、精嚢（S SPM）の内容物を受精嚢に転移させるため、脱皮したばかりのメスを仰向けにします。ロブスターのメスは、交尾で得た精子を2年以上保存することができ、その後、卵塊を産出します。卵はメスの腹面にある腹脚に付着します。卵の発達には通常9か月から11か月かかり、海水温に強く依存します。卵は春と夏にプランクトン幼生として孵化し、いくつかの幼生期を経て、稚魚として海底に定着します。ここで述べる方法は、商用のロブスター船やその他の海上調査プラットフォームに乗船しながら、多数の雌のロブスターから精子サンプルを得るための手法を提示するものです。鈍端針を雌の精儲嚢に挿入し、精包とその中の精子の方向を一部採取します。採取した精子サンプルは、その後ラボに保管し、後で検査することが可能です。精儲嚢の構造により、この手法に伴う死亡例は認められていません。フィールドサンプリングに必要な備品には、サンプルを低温に保つための氷を入れたクーラー、2 mLのサンプルバイアルが含まれます。本研究では、プラスチック製のエッペンドルフチューブ、3 ccシリンジに装着した18ゲージの鈍端針、および冷却した清浄な海水を使用しました。滅菌状態が理想的ですが、必須ではありません。また、必要に応じて、手節の長さ、腹部の幅、および鉗部の寸法など、ロブスターの形態測定学的特徴を記録するためのキャリパーが必要です。これらの測定値は、サンプルチューブの識別番号とともに、あらかじめ印刷されたデータシートに記録します。サンプラーは、サンプリング日、サンプリング場所、商業用トラップによる捕獲方法などの詳細も記録する必要があります。例えば、キャリパーを用いて各ロブスターを1mm単位で測定します。甲長（carapace length）は、眼窩の後方から甲殻の末端までを背面から測定してください。成熟度の指標を推定する場合、腹部幅などの追加測定が有用なことがあります。その後、ノギスを用いて標準頭胸甲長を測定します。次に、個体を腹側が上になるようにして、腹部幅を測定します。貯精嚢から精子サンプルを採取するには、雌のロブスターを腹側を上にし、腹部を自分側に向けて保持します。シリンジの針を精儲嚢に挿入します。精包が存在する場合、非常に硬い精栓があります。慎重に穿刺し、シリンジの中身をあらかじめラベルを貼ったチューブに空にします。その後、シリンジに少量のきれいな海水を満たし、精儲嚢内に注入します。これにより、硬いプラグから精子を分離させることができます。次に、プランジャーを再び上げ、この追加サンプルを同じサンプルチューブに注入します。一貫したサンプルを回収するためには、針の角度と深さの両方が非常に重要です。この画像では、精管受精嚢が解剖され、垂直に分割されています。精栓が受精嚢の上部を占めており、精子は受精嚢の最深部である底部に位置しています。受精嚢の深さは雌の個体サイズによって異なりますが、概ね1 cmであり、精子サンプルを採取するには、硬化した精栓を針で貫通させる必要があります。容器の底にある殻のような物質を突き破らないように注意してください。これから、研究室でのサンプリング工程をよりゆっくりと示します。本手法を利用される方は、野外でのサンプル採取を試みる前に、まず研究室内で練習することをお勧めします。繰り返しになりますが、ロブスターの腹側を上にし、腹部を自分側に向けて保持してください。鈍端針を用い、腹部方向に向けて45度の角度から刺入し、精嚢を貫通させて精子栓の有無を確認します。プラグがある場合、一定の圧力をかけたときにここで抵抗が感じられます。針をわずかに回転させながら、貫通を促します。針に示されている黒色のリファレンスマークを目安に、約1cm挿入して精子プラグを貫通させます。シリンジの中身をサンプルチューブに入れます。次に、シリンジに少量の冷たく新鮮な海水を取り込み、精管受容器を洗浄し、ロブスターを替えるごとにその内容物を再びサンプルチューブに排出します。コンタミネーションを防ぐため、シリンジを十分に洗浄してください。針を拭き、その後、シリンジに液体を満たして空にする操作を数回繰り返し、サンプル物質が完全に洗い出されていることを確認します。別のロブスターをサンプリングする前に、精子の処理および同定において、シリンジと針を数回使用した後は交換することをお勧めします。200 µL ピペット、使い捨てピペットチップ、顕微鏡スライド、およびカバーガラスを用意してください。精液サンプルのチューブから、液体成分を約200 µL採取します。これを適切にラベルを貼った顕微鏡スライドに滴下し、カバーガラスを被せます。標準的な複合光学顕微鏡を用い、100倍の倍率で精子の量を測定します。顕微鏡スライド上の精子は、垂直方向や側方向など、さまざまな向きで観察される場合があります。これらのサンプル画像に見られるように、精子の存在量は、「多い」、「少ない」、または「なし」といった定性的な記述を用いて表現することを推奨します。私たちは、海上の多くの地点や、港でのロブスターのサンプリングにおいて、この手法をうまく活用してきました。ここに示した結果は、商業的な保持施設でサンプリングが可能であった、ジョージズバンクで捕獲された沖合のロブスターによるものです。これらの雌の合計84%に、受精嚢内に精子が含まれていました。驚くべきことに、精子が見られなかった個体はサイズ範囲の中間に位置しており、より小型で未成熟である可能性のある個体ではありませんでした。本手法は、受精嚢内の実際の精子量を定量化することを目的としたものではありません。むしろ、本手法は、メスのロブスターが抱卵に成功したかどうかを海上で判定できる非侵襲的な方法を提供します。ロブスターの繁殖成功に関する知見が深まるほど、本種の乱獲による影響をより正確に把握でき、ひいては、この価値ある海洋資源を適切に管理することが可能になります。

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このプロトコルの目標は、Lymnaea stagnalisの胚と幼虫のハイスループットなカプセル化解除のための一連の方法をユーザーに提供することです。これは、全体のマウントin...

全体のマウント<em&gt;その場で</em腹足類軟体動物のための&gt;ハイブリダイゼーション法<em&gt;モノアラガイstagnalis</em

ここでは、分離し、構造、嗅力海ヤツメウナギの推定フェロモン化合物の行動応答を評価するためのプロトコルを提案する.

バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定

ここで時間の長い期間にわたって動物を個別に追跡するためのプロトコルを提案する.コンピュータ...

Cohoused 水生動物の長期のビデオ追跡: ノルウェー オマール海老 (アカザエビ norvegicus) の毎日の歩行活動の事例

このプロトコルでは、ant Vollenhovia...

誘導と近親交配アリ、 Vollenhovia Emeryiを使用しての評価

この記事では、少年の太平洋ヤツメウナギやアメリカのウナギのマイクロ音響タグを移植するための手順を示します。我々...

少年太平洋ヤツメウナギやアメリカのウナギの新しいマイクロ音響タグの注入

このプロトコルの目的は、胚を犠牲にすることなく、胃形成中に海アネモネネネメテラステッラベクテンシスを遺伝子入力することです。...

初期開発におけるアネモネのジェノタイピング

精子は、卵母細胞を受精させるために卵管を正常にナビゲートしなければならない。ここでは、...

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

淡水イガイの保全は、生殖パターンと種のプロセスを監視に依存しています。本研究では、ギルの内容をサンプリングし、幼虫の発達を特徴付け、収集されたデータのデジタルリポジトリを提供するための非致命的なプロトコルを標準化する。このプロトコルデータベースパッケージは、イガイの研究者が侵略種を回収する上で重要なツールとなります。...

淡水ムール貝の生殖状態と幼虫発達を特徴付けるための非致死的方法の標準化(ビバルビア:ユニオンダ)

熱的な挑戦の間に心拍数を測定する急性環境変化の結果として生物の生理学的応答への洞察を提供する。モデル生物としてアメリカのロブスター(ホマルス・アメリカヌス)を使用して、このプロトコルは、インピーダンス・ニューモグラフィーの使用を、後期無脊椎動物の心拍数を測定するための比較的非侵襲的で非致死的なアプローチとして記述する。...

後期無脊椎動物における低侵襲性心拍数測定のためのインピーダンス肺撮影

カエノラブディティス・エレガンスにおける胚の生存率とひなサイズの測定

学ぶ、アメリカンロブスター（Homarus americanus）の雌における非侵襲的な交配成功評価法。漁業による影響を受ける繁殖動態を理解し、持続可能な資源管理に貢献するための現場での簡易技術を紹介します。

非侵襲的方法

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