半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動

本プロトコールでは、まず、すべてのtrans A TRを含むEベースの餌を、適切な遺伝子型の幼虫に与えます。各幼虫を固定し、生理食塩水中で解剖した後、生理食塩水を2 mMカルシウムリンガー液に交換し、LABA標本を顕微鏡ステージ上に設置します。解剖されたLABAの動きをCCDカメラでビデオ録画します。神経系を局所的に照射することにより、同一の不活性標本の動きをモニタリングしながら、特定のタイミングで一部のニューロンの神経活動を摂動させることができます。

こんにちは。Dr.A研究室のTegaです。こんにちは。同じくDr.A研究室、眼科レベルのKosakaです。

運動能力は、運動回路を研究するための有用なモデル系です。本プロトコルでは、高度に発達した遺伝学的手法を用いることで、運動レベルをモニタリングしながら運動ニューロンを光遺伝学的に操作します。共焦点顕微鏡のレーザーを使用することで、ニューロンのサブセットを刺激し、ニューロンへの時空間的な摂動に対する運動反応を解析することが可能です。

それでは始めましょう。標準的な生餌を含むプラスチックバイアル内で、K64 US CHR2またはK64 US NPHRのショウジョウバエ系統を維持します。適切な濃度のTL溶液を酵母ベースの培地に加え、よく混ぜ合わせます。この酵母ベースの培地をリンゴジュース寒天培地に塗布します。

バイアルからSLAの2番目または3番目のコロニーをピックアップします。TRを含む酵母培地プレートにコロニーを接種します。TRを暗所に保持するため、プレートをアルミホイルで覆います。25 °Cで適切な期間、コロニーを培養します。

これは、同一の未処理試料を可視化するためのCCDカメラです。SEMAデタッチメントを用いて、CCDカメラを汎用の共焦点顕微鏡に取り付けます。A TRAロビーを採取し、水で洗浄します。

体内の残留食物を除去するために、幼虫をCガード冷皿の上に背側を上にして置きます。頭部と尾部を昆虫ピンで固定します。カルシウムフリー正常生理食塩水を加えます。

マイクロ鋏を用いて、尾の近くに小さな切開を加えます。背側正中線に沿って縦方向に切開します。腹側神経索および末梢神経を損傷しないよう注意してください。

解剖した体壁の各隅で、ヘッドピンを用いて小さな側切開を加えます。脳と腹側神経索を除く内臓を取り除きます。生理食塩水を2 million model calcium ringer solutionに交換します。

共焦点顕微鏡に高倍率のドライ対物レンズを取り付け、試料を顕微鏡ステージ上に設置します。共焦点顕微鏡を用い、赤色レーザーで解剖試料の透過画像を取得して、腹側神経索の位置を確認します。透過画像上で関心領域（ROI）を指定します。この際、ズームモードを使用すると、特定の関心領域を決定するのに有用です。

顕微鏡のフィルターセットを変更し、488 nmまたは559 nmの光で照射します。ハロゲンランプで標本を照らし、体壁を可視化します。共焦点顕微鏡に取り付けられたCCDカメラで標本をモニターします。

体壁の動きを再現し、同一の無傷の個体標本において蠕動運動をモニタリングしながら、神経活動を一時的に操作するためにレーザービームのみを切り替えます。この蠕動運動はCCDカメラによって観察および記録されます。本実験では、モーターニューロンにCHL2を発現させています。腹側神経索の1つまたは2つの分節を照射すると、その分節のモーターニューロンが活性化され、その結果、対応する体壁分節の筋肉収縮が誘導され、腹側神経の他の分節を刺激します。

低温は他の体節の収縮を誘発します。腹側神経索の数セグメントを黄色レーザーで刺激した際、運動ニューロンにおいてNPHLが発現しました。伝播波は、体壁の対応するセグメントで停止しました。

その後、レーザー照射を停止すると、停止していたセグメントから波が再開しました。本プロトコルでは、運動中の同一の不活性円形レベルにおいて、レーザーを用いて神経活動の光遺伝学的摂動を行う手順を解説します。十分な刺激を得るためには、この解剖操作中に腹側神経索および末梢神経を損傷させないことが重要です。

共焦点顕微鏡における照明強度は、レーザー出力、走査速度、または繰り返し回数を変更して調整する必要があります。以上でプロトコルの全工程となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。