ザ卵で CAMアッセイ

ザ

この手順の全体的な目標は、肉腫、細胞、または移植片の行動を研究するために、ひよこチョールトニックメンブレンまたは CAM アッセイを実行することです。これは、孵卵3日目に最初に卵の殻に窓を作ることによって達成されます。インキュベーション9日目の第2ステップでは、腫瘍材料を調製します。

次に、上皮層を取り除いた後、腫瘍をCAMに追加します インキュベーション16日目の最終ステップでは、CAMを撮影し、採取し、組織学的評価のためにホルマリンに固定します。最終的には、古典的なhおよびd組織学および免疫組織化学を使用して、肉腫、細胞増殖および浸潤血管新生、および宿主反応を実証します。ゼノグラフトのような既存の方法のこの技術の主な利点は、ほとんどのモデル、それは学ぶのが簡単で、比較的安価であることです。

また、非常に短期間で無数の転移関連活動を研究することができ、倫理委員会は必要ありません。この方法は、腫瘍の生存に対する腫瘍宿主の相互作用の影響、腫瘍微小環境の再構成、間質細胞の動員など、肉腫研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、患者自身の資料を研究できるため、肉腫の個別化治療にまで及びます。

この新しい技術は、SARのニューロン新生に関する新たな知見を提供してくれます。また、一般的な発がんなどの他のシステムにも非常に適用できます。まず、滅菌メスを使用して腫瘍サンプルを1立方ミリメートル以下の小片に切断し、石灰化した領域をすべて取り除きます。

次に、サンプルを秤量し、2〜4グラムの組織を解離チューブに移します。2.5ミリリットルのコラゲナーゼ2溶液と2.5ミリリットルのDN a溶液で組織を消化します。組織を処理した後、解離H腫瘍プロトコルに従って、得られた懸濁液を150ミクロンの細胞ストレーナーを通してろ過します。

次に、懸濁液を適切な遠心力、たとえばGの100〜500倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。ピペットで上清を慎重に取り除いた後、ペレットを10ミリリットルの赤血球溶解液でインキュベートし、室温で緩衝し、時折tationします。10分後、懸濁液を再度回転させた後、反応を停止するために25ミリリットルの培養培地を加え、ペレットは白く、上清を捨て、細胞に5ミリリットルの培地を加え、次いで70ミクロンの細胞ストレーナーを通じて懸濁液を濾過します。

自動セルカウンターを使用して、開発中のミリリットルあたりの生細胞数を決定します。3日目、卵の先端に18ゲージの針を挿入し、2ミリリットルのアルブミンを取り除き、OVO絨毛膜オールトニックメンブレンまたはカムのレベルを下げます。次に、シェルのマークされた上側に半透過性の粘着フィルムを貼り付けて、ウィンドウを切断するときにシェル粒子がカムにこぼれるのを防ぎます。

次に、卵の表面に小さなすべてで導入穴を開けます。シェルを開けるときにカムを損傷しないことは、手順の最も難しい部分です。片手で水平に持ち、もう片方の手で卵を持ちながら、鋭利なハサミを使用します。

次に、滅菌された鋭利な先のとがった手術用ハサミを使用して、シェルの1センチ四方の窓を切ります。脈動する心臓と胚の隣接する血管が卵黄の表面に見えるはずです。未受精卵や死んだ胚をすべて取り除きます。

次に、窓をより半透過性の粘着フィルムで密封します。腫瘍懸濁液を再びスピンダウンした後、ペレットを冷却した細胞外マトリックスゲルに、ゲル100マイクロリットルあたり6個の細胞に1回ずつ再懸濁します。この溶液を溶ける氷の上に置いてください。

次に、層流下で、滅菌手術用ハサミを使用して、半透過性接着剤フィルムの一部を切り取ります。滅菌ガラス棒でカムに軽く触れて、上皮細胞層を除去します。次に、細胞ECMゲル懸濁液を25マイクロリットル滴4滴カムに加え、アプリケーション間でECMゲルを重合させます。

このようにして、がん細胞を含む付着性プラークが作成されます。次に、シェルウィンドウを半透過性の粘着フィルムで再度シールします。適切な実験インキュベーション期間の後、手術用ハサミを使用してシェルウィンドウを拡大し、低く切りすぎないように注意してください。

次に、ピペットを使用して、接種された材料を含むCAMセクションに300〜500マイクロリットルのPBSを追加します。次に、実体蛍光顕微鏡でカムを撮影します。その後、滅菌ハサミを使用して、シェルに横たわっている境界でメンブレンを切断し、収穫したカムをPBSまたは緩衝ホルムアルデヒドで満たされた滅菌ペトリ皿に入れます。

次に、カムの上部と下部の両方を、フィルターの有無にかかわらず撮影します。この最初の図では、腫瘍移植片がカムに付着します。ここでは、乾燥したわずかに隆起したプラークを示す患者材料からの単一細胞懸濁液を、これら2つの画像で観察することができます。

カムの切除後に発生する膜の顕著なしわが示されています。SAO 2 ラインは CAM 上に広がるプラークを形成し、7 日目から表面がはっきりと増加します。接種後もGFPシグナルは強く残っており、生存細胞を示しています。

SW 1 3 53細胞を含むこれらのプラークは、表面の減少を示し、収縮したカムを有する傾向があり、その結果、しわのある膜が生じる。7日目から収穫した後、出血が頻繁に観察されます。DSRシグナルは、多くの細胞分裂後に蛍光プローブが希釈されるとともに、また出血が発生すると減少します。

ほとんどの場合、CAMの血管反応は、新しい曲がりくねった血管がサンプルに入るときに観察されます。たとえば、矢印で示される分岐と、矢印で示されるこの点状の出血のアスタリスクで示される吻合も、プラーク全体で観察できます。SAOの2つのセルがカムの血管に平行に移動することに注意してください。

この血管反応は、カムを切除した後、グラフトまたはプラークを囲む曲がりくねった血管を示す下部のビューで視覚化できます。CAMの血管反応は、腫瘍移植群と単一細胞懸濁基で観察されます。組織学的証拠は、SAOの2つの細胞が細胞外マトリックスゲルの全体積にわたって単一の細胞外観を維持し、プラークの厚さと直径の増加を引き起こすことを示しています。

腫瘍細胞は、ここで矢印で示されているように、カムの中胚葉層に浸潤し、それによってカムの内胚葉層と真皮層との間の距離が開口部のジッパーのように拡大します。二重矢印で示されているように、SW 1 3 5 3細胞および患者の意識肉腫の単一細胞懸濁液の成長パターンは、細胞外マトリックスゲルの広がりに細胞の島でより密集しています。矢印で示されているように、異所性の成長部位に耐えられず、元の肉腫腫瘍の本質的な特徴と免疫組織化学的特性がカムで維持されていることを発見しました。

さらに、矢印で示され、血管内に見られる濃いピンク色の青い有核ニワトリ赤血球の出現によって証明されるように、腫瘍移植片は血行再建術を受けましたKI67陽性細胞とKI67陰性細胞の細胞計数は、両方の細胞株について4日目から細胞の総数の着実な増加を示しています。この日を境に、接種後7日で細胞総数は安定し、KI67陽性細胞の数と細胞総数は減少し始めます。カムの近くではKI 67陽性細胞の割合が高く、プラークの表面ではKI 67陰性細胞の割合が高くなります。

マスターすると、cam SA技術を使用して、適切に実行すれば、3日間にわたる14時間のスプレッドで50倍を分析できます。追加のhおよびe染色と評価を行うことができ、この手順に続いて10条件あたり3時間かかります。インフルエンザ標識がん細胞の血管外漏出や化などの追加の問題に対処するために、ライフスタイルイメージングなどの追加の方法を実行できます。

したがって、この新しい技術の開発により、前臨床検査の分野の研究者は、肉腫患者の新しい予後および治療因子を探求することができます。このビデオを見た後、cmaaに腫瘍材料を適用する方法と、顕微鏡的および顕微鏡的観察を腫瘍宿主の相互作用の理解を深めるために顕微鏡的および顕微鏡的観察をどのように変換するかについて十分に理解しているはずです。