Name: カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる 2 +とスフィンゴミエリナーゼ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 25 s
Description: 学ぶ 細胞膜修復の動態をFM1-43蛍光染色とライブイメージングで解析する方法。カルシウムとスフィンゴミエリナーゼの役割を定量的に評価し、膜修復のキネティクスを正確に測定できます。

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1。 ASMの転写サイレンシング<ol><li>シード1.5×10 35mmのガラスボトムディッシュ（MatTek社製）上のDMEM増殖培地（10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM高グルコース、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）2ml中の5 HeLa細胞および5％CO 2インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、増殖培地をオフ吸引し、siRNAトランスフェクション混合物を添加する前に2ミリリットルのDMEMを減少血清培地（4％FBSを含むDMEM）、少なくとも1時間に交換してください。 </li><li> siRNAのオリゴトランスフェクション混合物のための4のチューブを準備します。チューブAとCに、トランスフェクトされる35mmディッシュあたり、血清および4μlのトランスフェRNAiMAXトランスを減少させた250μLのOptimemを追加。チューブBは、オプティメム250μlのを追加し、血清およびトランスフェクトされる35ミリメートル皿あたり制御メディアGC含量のオリゴ（対照siRNA）を8μlの（160ピコモル）、減少した。チューブDでは、追加のOptimem250μlの35ミリメートル皿Tあたり、SMPD1オリゴ（siASM）の血清および8μL（160ピコモル）を削減Oトランスフェクトする。室温で5分間チューブをインキュベートする。 </li><li>チューブAおよびBは、トランスフェクションのためのコントロールのsiRNA複合体、およびASM siRNAのための管CおよびDを形成する。 20分間室温で反応をインキュベートする。 </li><li>それぞれ35 mmのガラスボトムディッシュにコントロールsiRNAとASMのsiRNAトランスフェクション反応にゆっくりと混合物は、滴下して、追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 24時間のトランスフェクション後に、静かに、メディアをオフに吸引し、新鮮なDMEM増殖培地と交換してください。効率的なASMのノックダウンのために、料理はさらにライブイメージング前に約31時間（合計55時間）、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする必要があります。 </li></ol> 2。ライブ顕微鏡用試薬の調製<ol><li> Ca 2 +およびMg 2 +なしで冷たい1×PBS中100 NG /μLの濃度で組換え孔形成毒素ストレプトリジンO（SLO）の溶液を調製する。これらのアッセイにおいて使用されるSLOはconstitutivelある親切に博士ロッドTwete​​n、オクラホマ大学が提供する活動のための還元剤は必要ありませんYアクティブシステイン変異体。毒素は、E.で発現された大腸菌 BL21 DE3、以前に16記載されているように、ネイティブな条件下で精製。 </li><li> 25 mM溶液を作成するために、DMSOに再懸濁FM1-43凍結乾燥粉末：FM1-43のストック溶液を調製する。 </li><li>溶液Aを準備します。4μmの最終濃度にCa 2 +を冷DMEM中でFM1-43のストック溶液を希釈（1.5ミリリットルをマテック皿のあたりに必要とされている）と、必要になるまで氷上で保存する。 </li><li> B液を準備します。4μM（マテックディッシュ当たりに必要な1.5ミリリットル）の最終濃度になるようにCa 2 +および10のEGTA（Ca 2 +を含まないDMEM）なしで冷たいDMEM中でFM1-43ストック溶液を希釈し、まで氷上に保存する必要としていました。 </li><li>事前暖かい（37℃）エッペンドルフチュー​​ブ内の溶液Aと溶液Bを1ミリリットルずつ。 </li><li>のCa 2 +、およびCを含むDMEMのアイスソリューションを保つ2 +を含まないDMEM中。 </li></ol> 3。 FM1-43の処理されたSLOに流入し、未処理細胞の生細胞イメージング<ol><li> 、砕いた氷でMサイズの浅い金属製の容器を埋める氷を持つ大規模なガラス容器に、それを反転させ、露出した金属容器の底面のみを残して、追加の氷を加える。でも、熱転写を可能にするために露出した金属底に湿ったペーパータオルを置きます。 </li><li> 1コントロールsiRNA処理マテック皿（ サンプル1）を取り、冷たい湿ったペーパータオルの上に置きます。優しくすべてのメディアをオフに吸引し、寒さのCa 2 +を含まないDMEMで3回洗う。最後の洗浄の後、皿にすべてのメディアをオフに吸引除去する。 </li><li>のCa 2 +の存在無しSLO創傷（ サンプル1）と細胞内の画像細胞関連FM1-43に、35 mmのガラスボトムディッシュの中心ガラスカバースリップに冷溶液Bの180μLを加え、5インキュベート氷上分（ 表1）。 </li&gt; <li> 37℃に加熱し、（温度、湿度、CO 2レベルを維持する）環境室を搭載した共焦点顕微鏡のステージ上マテック皿を置きます。 40X、NA 1.3の対物レンズ（ニコン）を通して見て画像化される細胞のフィールドを検索します。可能な場合、熱ドリフトを補正するためにPerfectFocusまたは類似のデバイスをオンにします。 </li><li>そっと35-mmディッシュの側に予熱溶液Aの1ミリリットルを加え、環境室（ 表1）のカバーを交換してください。 </li><li> （ULTRAVIEW近所パーキンエルマースピニングディスク共焦点顕微鏡システムにおいてVolocity）適切なイメージングソフトウェアを使用して、すべての3秒1コマで4分間の画像を取得する。 FM1-43の励起は488nmのバンドパスダイクロイックフィルタとを用いて488nmのレーザー線を用いて達成され、発光判別は527（W55）発光フィルターを使用することによって達成される。レーザパワーレベルとカメラの感度は、100ミリ秒の画像露光を達成するように設定されている。 </li><li>繰り返します3.2〜3.6は、そのステップ3.5溶液Bである（ 表1）を追加する必要がありますを除いて、Ca 2 +の非存在下ではありませんSLO創傷（ サンプル2）を対照siRNA処理細胞でFM1-43を検出するには、手順。 </li><li>プレゼンス（ サンプル3）またはCa 2 +が存在しない場合（ サンプル4）の中心ガラスカバースリップにSLOを含有する冷溶液Bの180μlを添加するのいずれかでSLOを負傷したコントロールsiRNAで処理した細胞へのFM1-43の流入を測定するには35 mmのガラスボトムディッシュ、ステップ3.3のように氷上で5分間インキュベートする。繰り返します3.6を通じて3.2ステップ、ステップ3.5（ 表1）で溶液AまたはB液のいずれかを追加し調整します。 </li><li>原形質膜修復におけるASMの役割を決定するには、手順は、すべての条件（ 試料5-8）（表1）のためのASM siRNAで処理した細胞を使用して3.2から3.6を繰り返します。 </li><li>上の細胞外組換えスフィンゴミエリナーゼ（SM）の役割を決定するために、（FM1-43の流入における阻害によって反射された）、細胞膜修復の動態は、（ サンプル9月10日 ）、SMが追加されたステップ3.5（0〜50μU）に溶液Aのどちらか、または溶液Bとし、生細胞の間に細胞に添加されている1ミリリットル（ 表1）の総体積で撮像。 </li></ol> 4。細胞へのFM1-43流入の定量化<ol><li>ムービーが取得された後、画像解析ソフト（Volocityスイート、PerkinElmer）を用いFM1-43の細胞内蛍光強度を測定する。フィールド内の各細胞の細胞質ゾル領域に関心領域を描画し、動画の全フレームを通じて平均FM1-43の蛍光強度を測定するためにソフトウェアツールを適用する。 </li><li>初期FM1-43染色の変動を調整するには、各ビデオのためのデータは、経時的な蛍光強度の増加倍数として表現さ​​れ、それぞれの異なる条件に対してプロットされている。個々の時点あたりの蛍光の倍増加セルは、F Tは、特定の時点での平均蛍光であり、F 0が t = 0（ 図1-2）での平均蛍光であるF T / F 0として計算される。 </li></ol>

<ol><li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeilbrunn%2C+L+%22The+dynamics+of+living+protoplasm%22">The dynamics of living protoplasm</a>. , Academic Press. (1956).</li>
<li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChambers%2C+R+%22Explorations+into+the+nature+of+the+living+cell%22">Explorations into the nature of the living cell</a>. , Harvard University Press. (1961).</li>
<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
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<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717(2011).</li>
<li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-dependent+cytolysins%2C+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li>
<li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li>
<li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 Forthcoming.</li>
<li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin%2C+lysenin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言します。

機械的損傷と、細胞膜の修復に関する初期の研究では、ガラスビーズ、マイクロピペット、せん断、傷や削れを落とすに至るまで、負傷した細胞の多様なメカニズムに依存していました。すべてのこれらのアッセイの読み出しは、定性的ではなく定量的であり、修復機構の動力学に関する正確な情報を与えなかった。損傷のこれらの形態の後に原形質膜を再シールする細胞の能力は、細胞質内の細胞外液に添加トレーサーの有無によって、膜不浸透性色素、サイトゾル酵素の損失、ATPレベル、または長期の浸透を測定した細胞生存。これらのアッセイのいくつかは、定量的に行うことができるが急速に単一細胞レベルで再シールの動態を評価しながら、これらの研究における1つの大きな障害は、創傷イベントを同期させるのが困難であった。 筋線維のUV-レーザー傷害の開発および使用follo親油性色素FM1-43の流入を検出することによって結婚これらの研究17,20における大きな進歩だった。代わりに削れやけがの類似の機械的手段によって、全細胞集団に与えた総ダメージのため、これらのアッセイは、単一細胞分析を可能にした細胞を創傷に複数の定...

これは、機械的損傷後の血漿膜修復は、Ca 2 +依存性プロセスであること1,2数十年前から知られている。その後の研究は、傷口を通してのCa 2 +流入は、3,4を再密封するために必要とされる傷害の部位で細胞内小胞のエキソサイトーシスの積極的なプロセスをトリガすることが示された。細胞の細胞質内にロード蛍光色素の損失の速度は、修復の速度を評価するために使用され、再封が損傷後5 &lt;30秒以内に完了したと結論された。二つのモデルは、最初は、細胞膜修復にエキソサイトーシスのための要件を説明するために提案された。病変を通じてのCa 2 +流入は、そのだろう大規模な「パッチ」を形成、細胞内小胞の最初に同型の融合を引き起こすことが示唆さ1）「パッチ」モデル、次いで、創傷6と、その膜を提案しADDE 2）張力低減モデルを再シールするために原形質膜に適用すること創傷の近傍におけるCa 2 +依存性エキソサイトーシスによって7日間二重層の再封を容易にする、原形質膜の張力を減少させるであろう。原形質膜修復におけるCa 2 + -誘発さエキソサイトーシスの役割は、リソソームが損傷菌におけるそれらのエキソサイトーシスおよび原形質膜の修復を促進するのCa 2 +センサー分子、シナプトタグミンVIIを含有することを示す研究によって補強された8,9,10,11 。 しかしながら、追加の証拠は、単独で、エキソサイトーシスは、形質膜の修復を促進するのに十分ではなかったことを示した。原形質膜上の機械的な涙液に加えて、細胞損傷の頻繁な形態は、細菌12,13又は14,15免疫細胞によって産生さ孔形成毒素による透過性である。機械的な涙とは違って、孔形成タンパク質は、細胞膜は、膜「パッチ」を適用するか、削減するだけで再密封することはできない、安定した、タンパク質が並ぶ細孔を形成する上で自分自身を挿入膜張力をING。興味深いことに、研究は、哺乳類細胞は孔形成タンパク質を用いて透過処理した後に、それらの原形質膜を修復するための効率的な機構を有することを明らかにし、このプロセスは、細胞外Ca 2 + 12の存在を必要とする。機械的な傷5で観察されたので、この発見は、細胞表面から貫通孔の除去にも迅速なプロセスであったかどうかという疑問を提起した。プロセスは、細胞外Ca 2 +を必要とし、約30秒以内に完了する：驚くべきことに、我々の最近の研究では、孔形成毒素で透過処理した細胞の再シールは、機械的創傷の修復に非常に類似した性質を有することが明らかになった。より詳細には、このプロセスを調査し、我々は最近、リソソームのCa 2 +調節性エキソサイトーシスに加えて、原形質膜の修復は、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ（ASM）の放出によって引き起こさ必須であるエンドサイトーシスの急速な形態を含むことを学ん目のためだけでなく、貫 ​​通孔のEの除去だけでなく、機械的な傷16の補修用。 孔形成タンパク質との透過処理後の細胞再密封の動態を決定するために、我々の研究室では、レーザー損傷孤立筋繊維17の再シール性を評価するために以前に使用されていたライブイメージングの方法論を適応。このアッセイは、安定して蛍光強度が増加した脂質二重層の外側のリーフレット中にインターカレートする親油性色素FM1-43の特性に依存する。ときに、原形質膜二重層を形質膜損傷および修復18,16,19,20を検出するための感度の高いアッセイを提供し、細胞内膜への細胞外の色素アクセスして破壊される。孔形成タンパク質との透過処理後の細胞の再シール性の評価のためにこのアッセイを適合させるために、我々は、膜コレステロール21に結合する細菌毒素ストレプトリジンO（SLO）、4℃で細胞をプレインキュベートした。同期セル透過化は、その後容易に貫通孔の形成をもたらすコンフォメーションの変化をオリゴマー化および活性化する加熱された顕微鏡ステージ、媒体を温めるために氷から細胞を移動させることによって達成することができる。このアプローチの利点は、レーザー創傷を用いて以前に公開されたアッセイの上に、多数の細胞は、細胞集団のより良好なサンプリングを提供し、顕微鏡視野内で同時に分析することができることである。孔形成毒素との機械的損傷および透過後に見られる細胞の再シール工程の間の機構的類似点を考えると、我々はここで説明するアッセイは、細胞膜修復の基本的なプロセスに関与する因子を解剖するために、非常に汎用性と強力な方法を提供する。一例として、我々はそれが修復過程ののCa 2 +依存性および非依存性の手順を識別するために、このアッセイを使用することが可能であることを示している。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>HeLa 229細胞株</td><td>ATCC</td><td>CCL2-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose </td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose No Calcium</td><td>Invitrogen</td><td>20168</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Optimem Reduced Serum</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>制御培地 GC含量 RNAi オリゴ</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td></td></tr><tr><td>SMPD1 RNAi オリゴ</td><td></td><td>HSS143988</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 熱不活化</td><td>Gemini-Bioproducts</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>セレウス菌 Bacillus cereus</td><td>Sigma</td> S7651 由来のスフィンゴミエリナーゼ<td></td><td></td></tr><tr><td>35mmガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material</strong</td></tr><tr><td>>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td>C9100-50</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraViewVoX</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア解析ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity Suite</td><td></td></tr><tr><td>環境チャンバー</td><td>病理学デバイス</td><td>LiveCell システムチャンバー</td><td></td></tr></tbody></table>

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

原形質膜の損傷が頻繁なイベントであり、創傷は急速に細胞の生存を確実にするために修復されなければならない。のCa 2 +の流入は、30秒以内〜原形質膜上に機械的な創傷の修復をトリガする重要なシグナル伝達事象である。最近の研究では、哺乳動物細胞はまた、細孔が細孔エンドサイトーシスに続いてリソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼのエキソサイトーシスを伴うのCa 2 +依存性プロセスでの毒素の形成に透過処理後に原形質膜を再シールすることを明らかにした。ここでは、毒素ストレプトリジンOにより透過性細胞の再シールは、Ca 2 +流入にも迅速かつ依存していることを示すために使用される方法について説明します。アッセイデザインは、損傷事象および撮像により原形質膜の完全性を復元し、親油性色素FM1-43は細胞内膜に到達することによって程度を定量化する細胞の能力の正確な速度論的測定の同期を可能にする。このライブアッセイALSoは外因的能力の評価は、それらの感受性形質膜を修復する細胞の能力を反映して、FM1-43の流入を抑制するために、例えばスフィンゴミエリナーゼのような可溶性因子を添加することができる。このアッセイは、私たちは、酵素の細胞外のほかは、Ca 2 +が存在しない場合に透過性細胞の再シールを促進するため、スフィンゴミエリナーゼは、カルシウム2 +依存性エキソサイトーシスの下流で作用することを初めて示すことができました。

リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼで枯渇細胞における細菌スフィンゴミエリナーゼ（SM）レスキュー形質膜修復の低濃度。 FM1-43画像化アッセイを用いて、我々は、以前のCa 2 +の存在下での創傷のリソソーム酵素ASM欠損とSLOに曝露された細胞は、原形質膜の欠陥は、組換えヒト酵素19の細胞外添加によりレスキューされていることを示した。ヒトリソソームASMは、最適な低pHを持っているので、我々は再密封も中性pHで完全にアクティブになっている、 セレウス菌 （シグマ）から精製されたSMの追加回復させることができたかどうかを調べた。以前に示されているように、セルコントロールsiRNAまたはASMのsiRNAオリゴで処理し、Ca 2 +の（修理のための条件ではない許容）が存在しない場合にSLOにさらさ均等ASMの枯渇が毒素（ 図1Aに対する感度と干渉しないことを示し、透過処理した）。興味深いことに、完全な救助OSLOへの暴露後に再密封するためのASM欠損細胞の能力fをμU/...

親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca 2 +、スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

この手順の全般的な目的は、生細胞イメージングにおいて親油性色素FM 1 43を利用し、細胞膜からの除去効率が低い毒素の正確なキネティクスを測定することである。これはまず、4 °Cで毒素をあらかじめ結合させることで達成される。次のステップでは、ディッシュを加温顕微鏡ステージへ移動させ、細胞を可視化できる焦点面を探す。次に、適切に予熱した培地を加え、直ちにイメージングを開始します。最後のステップは、細胞内のFM 1-43蛍光を分析および定量化することです。最終的に、この高感度なアッセイを用いることで、形質膜修復に必要なカルシウム、フィンガリン、ミエリン、およびその他の因子の要件を評価することが可能です。レーザー損傷などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、このSLL透過性アッセイによって、細胞化が誘発された後にサイズが非常に均一な形質膜病変を同期的に形成できることです。親油性染料の流入をライブタイムラプスイメージングで観察することで、形質膜の再封鎖のキネティクスを、高感度かつ非常に再現性の高い方法で正確に決定できます。このアッセイは、形質膜損傷の他の手法に伴うばらつきを排除し、カルシウムやリコンビナントF-measeなどのさまざまな薬剤が形質膜修復に及ぼす影響を決定するのに最適です。35 mmガラスボトムディッシュ内のDMEM成長培地で培養したHeLa細胞において、酸性スフィンゴミエリンまたはSMシードの転写サイレンシングの手順を開始するには、5% 二酸化炭素インキュベーター内で37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、siRNAトランスフェクション混合液を添加する少なくとも1時間前に、成長培地を吸引して除去し、2 mLのDMEM低血清培地と交換します。細胞をインキュベーターに戻し、siRNAオリゴトランスフェクション混合液用のチューブを4本準備します。記載されている試薬量は、トランスフェクションを行う35 mmディッシュ1枚あたりです。チューブAおよびCに、250 µLのOpti-MEM低血清培地と4 µLのLipofectamine RNAiMAXを添加します。チューブBに、250 µLのOpti-MEM低血清培地と8 µL（または160 pmol）のコントロールを添加します。チューブDに、250 µLのOpti-MEM低血清培地と8 µL（または160 pmol）のASM1 siRNAを添加します。これらのチューブを室温で5分間インキュベートします。次に、チューブAとBを混合して、コントロールS、irna、およびチューブCとDのトランスフェクション複合体を形成します。A SMS irnaについては、反応液を室温で20分間インキュベートします。20分後、各トランスフェクション反応混合液を、それぞれの35 mmガラスボトムディッシュにゆっくりと滴下し、37

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生物学

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治癒損傷した細胞の処理は細胞膜の損傷部位に特異的なタンパク質および細胞内コンパートメントの輸送を伴う。このプロトコルは、これらのプロセスを監視するためのアッセイを説明しています。...

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2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

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L-012、化学発光のルミノール アナログを視覚化し、マウス切除創傷モデルで生成される活性酸素種 (ROS) を定量化を利用した、非侵襲的生体内でイメージ投射は、効率的でコスト効果の高い、プロトコルについて述べる.

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生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

学ぶ 細胞膜修復の動態をFM1-43蛍光染色とライブイメージングで解析する方法。カルシウムとスフィンゴミエリナーゼの役割を定量的に評価し、膜修復のキネティクスを正確に測定できます。

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる

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