Name: 筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶiPSC由来筋原性前駆細胞の移植法。マウス筋肉再生モデルでin vitro評価、筋肉内・動脈内移植、免疫蛍光・組織学的解析により移植効果と機能改善を測定する細胞治療アプローチを解説。

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著者らは、ジュリオ・コス、マルティナ・ラガッツィ、そして研究室全体に有益な議論と支援をしてくれたことに感謝し、ジェフ・チェンバレンがMyoD-ERベクターを親切に提供してくれたことに感謝している。生きた動物を含むすべての実験は、関連するすべての規制機関および機関機関、規制およびガイドラインに従って完了しました。著者の研究室での研究は、英国医学研究評議会、欧州共同体第7フレームワークプロジェクトオプティステムとバイオデザイン、イタリアのデュシェンヌ親プロジェクトによってサポートされています。

1. 筋原性及び生着ポテンシャルの評価
<ol><li>
インビトロ: MyoDによる分化<ol>
<li>タモキシフェン誘導性MyoD-ERレンチウイルスベクターを用いて導入された安定した細胞株を生成し、感染の多重度を刺激する(MOI; 例えば1、5および50)手順の効率の結果として1.1.9(MyHC)に記載の染色を使用する。</li>
		<li>3.5cmの皿に1%のマトリゲル1mlを塗り、37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>プレートを培地で2回洗浄し、3.5cm組織培養皿に1x5 MyoD-ERを導入し、37°Cで培養培地でインキュベートします。</li>
		<li>細胞が1〜2日で合流しに達し、成長培地に1μM 4OHタモキシフェンを加えると期待してください(1回 の用量)。</li>
		<li>24時間後、1 μM 4OHタモキシフェン(2nd および最後の用量)を添加した分化培地で成長培地を交換してください。</li>
		<li>1日おきに新鮮な分化培地で培地の半分を交換してください。</li>
		<li>毎日のミオチューブ形成のための培養を調べます。</li>
		<li>1週間(分化培地で5日)後、PBSでプレートを軽く洗い、RTで5分間パラホルムアルデヒド4%で固定します。</li>
		<li>ミオシン重鎖(MyHC)に対する抗体による免疫蛍光染色を行い、ミオチューブの存在を確認します。核染料を用いたカウンターステイン(例えば、ホークスト)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>分化の効率は、MyHC陽性細胞内の核の割合として評価される:効率が>50%であれば次のステップに進む。
<ol start="2"><li>
インビボ: 急性筋肉再生モデルにおける生着 筋再生に対するMyoD-ER IDEMの 生体内 寄与を評価するために、細胞は以前に緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするベクターコードで標識され、組織内部でそれらを追跡することを可能にする。その後、MyoD-ER GFP IDEMを成人マウスの筋肉に注入し、以前はミオトキシン(例えば 心筋毒)で負傷した。異種(HIDEMなど)または遺伝的に操作/補正された細胞に対する免疫拒絶反応を避けるためには、免疫不全または免疫抑制マウスのいずれかを使用することが必要です。<ol>
<li>10 mg/ml タモキシフェン(リポロジブ型)の腹腔内注射で動物を退行し、移植前に1 μM 4OH-タモキシフェン(水性形態)を成長培地に添加する退却細胞を24時間前に移植する。</li>
		<li>動物施設の外科的処置を調節する具体的なガイドラインに従って、麻酔と鎮痛をマウスに投与する。</li>
		<li>100 μM のカーディオトキシン (CTX; ナジャ モサムビカ モサムビサから 25 μl を注入します。;注意:潜在的に有害な物質) チガイアリス前筋肉 (TA)の筋肉。</li>
		<li>タモキシフェンとCTXで動物を治療した24時間後、トリプシン化とカウントによって細胞を取り外す。</li>
		<li>232 x gで細胞を5分間遠心分離します。</li>
		<li>Ca2+およびMg2+フリーPBSで細胞ペレットを洗浄し、遠心分離機を使用してCa2+の細胞ペレットを徐々に再中断し、Mg2+フリーPBSを最終濃度106 細胞/30μlに再中断します。</li>
		<li>29または30G針の注射器を使用して、以前に負傷した筋肉に30μlの細胞懸濁液を注入します。筋肉から針を取り除きながら、特に注意を払ってください。針のトラックを通して細胞の懸濁液をこぼさないように、ゆっくりとそれを行います。対側TAを移植し、それをコントロールとして使用しないでください, Ca2+の30 μlを注入 - と   Mg 2+- フリーPBS移植されたものの条件を複製します.</li>
		<li>タモキシフェンで6日間動物を治療し、鎮痛(例えばカルプロフェン)を2日間投与する。</li>
		<li>移植後14日後から筋肉を外植する。プロトコル 4 および 5 で詳細に説明されているように、サンプルを処理して分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 筋ジストロフィーのマウスモデルにおける移植
この移植アッセイは、筋ジストロフィーのマウスモデルにおけるIDEMの生着の程度を評価することを可能にする。動物は、以下のように扱い、この疾患表現型の機能的改善について評価することもできる。機能検査は移植後2週間から行うことができる。生着を強化するために、3x(すなわち合計3回の注射/筋肉)のために3週間ごとに移植前トレッドミル運動(プロトコル3に記載されている)および/または連続細胞注射を行うことを検討してください。
<ol><li>筋肉内移植<ol>
<li>10 mg/ml タモキシフェン(リポロプリド製剤)の3.5 μl/gの腹腔内注射で動物を退行し、移植前の一晩に1 μM 4OH-タモキシフェン(水性製剤)を加えて細胞を1μM/mlのタモキシフェン(リポロ溶性製剤)する。</li>
		<li>トリプシン法で取り外し、細胞を232 x gで5分間遠心分離します。</li>
		<li>Ca2+およびMg2+フリーPBSで細胞ペレットを洗浄し、遠心分離機を使用して、Ca2+およびMg2+フリーPBSのペレットを106細胞/30μlの濃度に再懸濁します。</li>
		<li>鎮痛を投与し、ポビドネヨウ素またはクロレキシジン系消毒剤を用いて動物の皮膚(任意)を消毒する。これはまた、 脛骨前 (TA)、 胃腸 症(GC)、および 四頭筋フェムリス (QC;特に 広大な間接的な)筋肉を局所化するのに役立ちます。</li>
		<li>29または30G針の注射器を使用して、30 μlの細胞懸濁液を筋肉に注入します。TAの場合、脛部に対して15°の傾斜を有する近位腱(頭蓋頭方向)の挿入部の下に針の5mmを挿入し、針を引っ込みながらゆっくりと細胞懸濁液を注入する(2mmの針を筋肉の内側に空にする)。GCおよびQCの場合、TAに関して詳述されているのと同じ手順を繰り返し、主な違いは、GCのアキレス腱のミオテンディナス接合部の上に2mm、QCの遠位腱の2mm上の針のコースラニア挿入である(大腿骨に対する15°の傾斜)。針のトラックを通して細胞の懸濁液をこぼさないようにするために、筋肉から針を取り除きながら注意してください。 トラブルシューティング:生着が低い場合は、3 x 105細胞/10 μlの若年性(1〜2週齢)マウス7を注射することを検討してください(この場合、タモキシフェンは皮下投与する必要があることに注意してください)。</li>
	</ol></li>
	<li>動脈内移植 プロトコルのこの部分は、MidEMおよびHIDEMの能力の評価を動脈循環で送達し、血管壁を横切り、注射部位に下流の筋肉の骨格筋再生に寄与することを可能にする。<ol>
<li>ステップ2.1.1で上述した動物および細胞を退却させる。</li>
		<li>トリプシン化によって取り外し、40 μmの細胞ストレーナーでフィルターを取り外す(タモキシフェンへの一晩の暴露が隣接する細胞からのミオチューブの融合および形成を促進する可能性がある場合に細胞懸濁液からクラスターを除去する)カウントし、5分間232 x gで細胞を遠心分離する</li>
		<li>Ca2+とMg2+フリーPBSで細胞ペレットを洗浄し、遠心分離機を使用して、Ca2+のペレットを再中断し、Mg2+フリーPBSを0.2インターナショナルで再中断します。 ヘパリンナトリウム(任意)の単位は、106細胞/50μlの最終的な細胞濃度に。細胞懸濁液の分布を可視化するために、溶液に10%パテントブルー染料(最終濃度:通常の生理食物またはCa2+およびMg2+フリーPBSで1.25mg/ml)を加える。</li>
		<li>特定の施設の動物施設での外科的処置を調節する指針に従って、麻酔と鎮痛をマウスに投与する。</li>
		<li>りんご領域(大腿骨またはスカルパの三角形とも知っている)を剃り、ポビドネまたはクロルヘキシジンベースの消毒剤で皮膚を消毒します。</li>
		<li>5-7 mmの切開を行い、大腿骨束を局在化する:静脈、動脈および神経(神経は動脈および静脈の内側に横たわっている)。</li>
		<li>束を鉗子で覆う結合性筋膜をそっと取り外します。</li>
		<li>その間に鉗子(または30G針)の先端を徐々に広げて、動脈から大腿静脈と神経を分離する。 トラブルシューティング:大腿静脈は壊れやすい:大腿動脈からの剥離中に鉗子でそれをつままないように注意してください。出血の場合は、滅菌ガーゼで血液を排出し、止血を容易にするためにマイクロコーテラーを使用してください。</li>
		<li>鉗子の一方の先端で動脈を持ち上げ、もう一方の先端で動脈をクランプします。</li>
		<li>30G針を装着した注射器で動脈を穿刺する。クランプされた領域の下流に50 μlの細胞懸濁液を注入し、約5μl/secの注入速度で注入します。 トラブルシューティング:注射前に注射器の細胞を慎重に再中断する:細胞の沈殿やシリンジ内の気泡形成を避けるために不可欠です。大腿動脈の直径は30G針よりわずかに小さい:針を挿入しながら動脈を切り捨てないように注意してください。特許青色染料は、注射の有効性を認識することを可能にする:正しく注入されれば、四肢全体が急速に水色に変わる。</li>
		<li>ゆっくりと針と鉗子を動脈から取り除き、四肢の血流を回復させる。</li>
		<li>必要に応じて出血や焼灼を避けるために、滅菌ガーゼで圧力を加えます。</li>
		<li>創傷を縫合し、麻酔から回復するまで動物を監視する。</li>
		<li>鎮痛を3日間投与し、創傷を毎日検査する(創傷感染の場合は、動物施設の職員とこれを議論し、必要に応じて抗生物質を投与する)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 移植性ジストローフ動物の結果対策:トレッドミル試験
細胞移植後2週間から、トレッドミル試験で処置されたマウスの運動能力の機能的改善を評価することが可能である。このテストは処置されたマウスの運動の許容度/持久力の評価を可能にする。マウスは、一連の連続した機械的刺激(5秒に1回)の後にトレッドミルを再び係合しようとすることなく、5秒以上休憩領域に横たわると疲労していると考えられる。ベースライン測定は、治療の約1ヶ月前に開始し、各単一の試験動物の改善を評価するために使用されます。この検査の後に、繊維の脆弱性、力の改善、生着、移植された細胞の分化、および移植された筋肉の形態学的改善を監視するための追加のアッセイが続く(議論参照)。
<ol><li>最初の測定前の運動に動物(通常3つのグループ:治療、未処理、および野生のタイプ/非ジストロフィーコントロール)を順応する:トレッドミルを10分間6m/minの速度に設定する。1 日おきに 1 週間繰り返します。 トラブルシューティング: 概日サイクルによるバイアスを避けるために、すべての測定値を1日の同じ時間に記録します。</li>
	<li>10°の傾斜で以前に設定されているトレッドミルに動物を配置します。</li>
	<li>6 m/minの開始速度でトレッドミルをオンにします(動物が運動を開始する気がない場合に備えて、穏やかな機械的刺激を提供します)。</li>
	<li>タイマーを開始し、2分ごとに速度を2 m/minに上げます。</li>
	<li>動物がトレッドミルを再び係合しようとせずに5秒以上休憩エリアに横たわるとすぐに、棒でそっと触れて運動の再開を刺激します(上記参照)。</li>
	<li>各動物の性能(時間と距離)を記録します。</li>
	<li>少なくとも 3 倍の週ごとまたは 10 日ごとに測定を繰り返します。</li>
	<li>移植後も同じ手順を繰り返します。</li>
	<li>各動物の測定値とベースライン性能を比較するパフォーマンスデータを分析します。ベースラインに対する平均モータ容量に対する割合としてグラフ内の値をプロットし、それらを一方向または双方向のANOVA検定で分析し、その後に適切な事後検定を行ってグループを比較することを提案します。</li>
</ol>トラブルシューティング:最低5歳、遺伝子型、および性に一致する動物/群を使用し、移植後に少なくとも3倍の測定を繰り返します。
4. 移植筋肉における細胞の生着と分化の評価
移植および制御筋肉は適切な時点で収穫される(短期生着分析には<2日、中期では2~3週間、長期分析では>1ヶ月)。移植した細胞がGFPで標識されている場合、新たに単離された筋肉の生着は、UV装備の実体顕微鏡下で直接蛍光によって評価することができる。
<ol><li>トラガチャントガムで、垂直軸に沿って配置し、新たに孤立した筋肉に沿って向きを与える(6%w/v)</li>
	<li>プレチルイセプアペンタンでサンプルを1分間脱水し、液体窒素で少なくとも2分間凍結し、すぐに-80°Cで保管してください。</li>
	<li>偏光スライド上の7μmの厚いセクションを得るためにクライオスタットでサンプルを処理します。スライド上の筋肉の大部分をサンプリングし、約8~10枚のスライドを30~40のセクション/スライドで収集します。分子生物学/生化学のアッセイを行うために1.5 mlの管に一連のセクションを集めることが推奨される。</li>
	<li>実験の設定に応じて、異なる免疫蛍光染色で細胞生着を評価する。例えば、Sgca-null/scid/bgマウスにおけるHIDEM移植の場合、染色切片:a)ラミンA/Cに対する抗体を用いて、移植されたヒト細胞核を検出する。b) 筋肉の全体的な構造を視覚化するラミニンに対する抗体;c)ジストロフィー動物に存在しないタンパク質のドナー由来復元を検出するSgcaに対する抗体。</li>
	<li>定量は、蛍光顕微鏡を用いて、筋線維の内外の筋部あたりのドナー核数およびドナー由来骨格筋線維の数を1セクション当たりにする。</li>
</ol>5. 筋組織病理学
組織病理学的解析は、移植された筋肉の形態構造の評価を可能にする。組織構造のアーキテクチャの改善は、細胞治療アプローチの結果として期待される。
<ol><li>4%パラホルムアルデヒドで4%の新しい筋肉を4°Cで1時間固定します。</li>
	<li>上昇ショ糖勾配(例えば 7.5-15-30%w/v)でサンプルを脱水します。</li>
	<li>最高のショ糖溶液で一晩筋肉を残します。</li>
	<li>サンプルをティッシュTek OCTに埋め込み、OCTが固体になるまでプレチルイコペンタンに入れ(サンプルの完全な浸漬を避ける)、少なくとも2分間液体窒素で凍結し、すぐに-80°Cで保管してください。</li>
	<li>上記のように7μmの厚いセクションを得るためにクライオスタットでサンプルを処理します。</li>
	<li>標準的な製造業者の議定書に従ってヘマトキシリンおよびエオシンまたはマッソンのトリクロームのセクションを汚す。</li>
</ol>ヘマトキシリンとエオシン染色は、次のような再生筋肉の特徴を計算することを可能にする: a) ミオファイバーの数;b) 断面積;c)中心核を含む筋繊維の数。マッソンのトリクロームは、画像の全面積から骨格筋線維によって占める総面積を差し引くことによって行われる繊維指数を計算するために使用される:結果として得られた領域は、主に筋肉の結合および脂肪浸潤を反映する。画像上のすべての分析は、測定ツールとセルカウンタープラグインとのImageJソフトウェア(NIH)を使用して行うことができる。

<ol><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li>
<li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meso-angioblast%3A+a+multipotent%2C+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li>
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<li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoangioblast+stem+cells+ameliorate+muscle+function+in+dystrophic+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs.</a> Nature. 444, 574-579 (2006).</li>
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<li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-mediated+transfer+of+a+human+artificial+chromosome+ameliorates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 3, (2011).</li>
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</ol>

F.S.T.は国際特許出願(いいえ。PCT/GB2013/050112) この記事で説明されている戦略の一部を含む。彼は彼の研究のためにプロミメティックとDWC Ltd.によって資金を受け取りました。

iPSCは自己再生の可能性を保ちながら無期限に拡張できるため、広範囲の細胞系統12に分化するよう指示される。このため、iPSC由来のステム/前駆細胞は、自家遺伝子および細胞治療の有望な源と考えられる13.著者らからの以前に発表された研究は、iPSCからのマウスおよびヒト筋原性前駆体の生成を、近球由来のMAB(IDEM)と同様の表現型を有し、筋ジストロフィー7のマウスモデルにおける筋肉再生に対するその効率的な寄与を報告した。
IDEM筋原性ポテンシャルを最大にするための前提条件は、細胞内の筋形成因子MyoDの発現である。タモキシフェン誘導性MyoD-ERカセットを用いたトランスダクションは、その発現を正確に一時的に制御し、その活性化を全培養中およびその後 インビボで同期させる利点を有する。筋肉あたりの細胞の単一投与に基づく移植戦略(または大腿動脈あたり)は、この記事で説明されています。しかしながら、反復細胞注射は、異なる細胞療法プロトコル8におけるMABの生着を増加させるに効果的...

メソアンジオ芽細胞(MAB)は、血管関連筋前駆腫が1〜3の球のサブセットに由来する。衛星細胞4 のような正規筋前駆体に対するMABsの主な利点は、動脈内に送達されたときに血管壁を横切る能力に存在し、したがって細胞療法プロトコルにおける骨格筋再生に寄与する。この特徴は、筋ジストロフィー1,5,6のマウスとイヌの両方のモデルで評価され、確認されている。これらの前臨床試験は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(EudraCT no.2011-000176-33;現在イタリアのミラノのサンラファエレ病院に行っている)のドナーHLA同一のMABの動脈移植に基づく第一次相I/II臨床試験の基礎を構築しました。体全体の筋肉を治療するために何十億もの細胞が必要な細胞療法アプローチの主なハードルの1つは、「薬効製品」(細胞)の限られた増殖性です。さらに、それは四肢ガードル型筋ジストロフィー2D(LGMD2D;で発生するので、筋ジストロフィーのいくつかの形態の影響を受ける患者からMABを得ることは不可能であることを最近実証されています;OMIM #608099)7.
これらの制限を克服するために、MAB様の幹細胞をヒトおよびマウスiPSCから導出するためのプロトコルが最近確立されている。この手順は、成人の筋肉由来のMABsに非常に類似した血管遺伝子シグネチャおよび免疫フェノタイプを有する容易に拡張可能な細胞集団を生成する。筋原性調節因子MyoDの発現に際して、マウスとヒトのIM(それぞれMidEMおよびHIDEM)の両方が末期骨格筋分化を受ける。この目的を達成するために、IDEMは、構成的にまたは誘導可能な方法で、MyoD発現を駆動することができるベクトルを用いてトランスミズムすることができる8-10。エストロゲン受容体と融合したMyoD cDNA(MyoD-ER)を含むレンチウイルスベクターが使用され、タモキシフェン(エストロゲン類似体)投与11で核転位が可能となる。この戦略は、高効率7で肥厚多核筋管の形成をもたらす。特に、IDEMは非腫瘍性であり、移植時に宿主筋肉の中で生着および分化することができ、異なるベクター(レンチウイルスまたはヒト人工染色体) を使用して遺伝的に矯正することができ、将来の自己治療戦略への道を開く。上記の出版物7に、IDEMの導出、特性評価および移植について説明した。本プロトコル論文では、筋肉再生のマウスモデルにおける移植の有効性をテストするために、IDEMの インビトロ 筋原性分化とそれに続く結果測定を評価するために実施されたアッセイについて詳述する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬</td></tr><tr><td>MegaCell DMEM</td><td>Σ</td><td>M3942</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>シグマ</td><td>D5671</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>シグマ</td><td>I3390</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>馬の血清</td><td>ユーロクロン</td><td>ECS0090L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>ロンザ</td><td>DE14801F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBSカルシウム/マグネシウムフリー</td><td>ロンザ</td><td>BE17-516F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Σ</td><td>G7513</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>P0781</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS(インスリン-トランスフェリン-セレン)</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸溶液</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ファー・イン・ソル</td><td>・ミード・ジョンソン</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ferlixit</td><td>Aventis</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>シグマ</td><td>01257-10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リノール酸</td><td>シグマ</td><td>L5900-10mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒトbFGF</td><td>Gibco</td><td>AA 10-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>成長係数を減らしたマトリゲル</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>356230</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ</td><td>T3924</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ナトリウムヘパリン</td><td>メインファーマ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>シグマ</td><td>T8154</td><td>有害</td></tr><tr><td>パテントブルー染料</td><td>シグマ</td><td>19、821-8</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>E-4884</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>TAABP001</td><td></td><td>有害</td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>シグマ</td><td>T5648</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-OHタモキシフェン</td><td>シグマ</td><td>H7904</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td><td>Addgene</td><td>26809</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9759</td><td>有害</td></tr><tr><td>ポビドンヨウ素</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トラガチャントガム</td><td>MPバイオメディカル</td><td>104792</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>VWR</td><td>24,872,323</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ティッシュテックOCT</td><td>サクラ</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>VWR</td><td>27,480,294</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>偏光ガラススライド</td><td>サーモ</td><td>J1800AMNZ</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>エオシン Y</td><td>シグマ</td><td>E4382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>シグマ</td><td>HHS32</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マッソンのトリクローム</td><td>バイオオプティカ</td><td>04-010802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス抗ミオシン重鎖抗体</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス抗ラミンA/C抗体</td><td>ノボカストラ</td><td>NLC-LAM-A/C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヘキスト33342</td><td>シグマフルーカ</td><td>B2261</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウサギ抗ラミニン抗体</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">MATERIALS AND EQUIPMENT</td></tr><tr><td>吸着性抗菌縫合糸 4-0</td><td>Ethicon</td><td>vcp310h</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>30 G ニードルシリンジ</td><td>BD</td><td>324826</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トレッドミル</td><td>コロンバスインストゥルメント</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>胸像顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMIL LED</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルランユニット</td><td>Harvad Apparatus</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>光ファイバーEuromecs(オランダ)</td><td>EK1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>温熱パッド</td><td>Vet Tech</td><td>C17A1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>メス</td><td>Swann-Morton</td><td>11REF050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>外科用鉗子</td><td>Fine Scientific Tools</td><td></td><td>5/45</td></tr><tr><td>高温焼灼器</td><td>Bovie Medical</td><td>AA01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">MEDIA COMPOSITION</td></tr><tr><td colspan="4">培地組成は以下に詳述されています。 HIDEMs growth medium: <ul> <li>MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li> <li>5% feth bine sem)</li> <li>2 mM グルタミン</li> <li>0.1 mM &beta;-メルカプトエタノール</li> <li>1% 非必須アミノ酸</li> <li>5 ng/ml ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)</li> <li>100 IU ml ペニシリン</li> <li>100 mg/ml ストレプトマイシン</li> </ul> あるいは、上記の試薬の一部が利用できない場合は、HIDEMsを以下で増殖させることができます。 <ul> <li>Iscoveの修飾ダルベッコ培地(IMDM)</li> <li>10% FBS</li> <li>2 mM グルタミン</li> <li>0.1 mM &β;-メルカプトエタノール</li> <li>1% 非必須アミノ酸(NEAA)</li> <li>1% ITS(インスリン/トランスフェリン/セレン)</li> <li>5 ng/ml ヒトbFGF</li> <li>100 IU ml ペニシリン</li> <li>100 mg/ml ストレプトマイシン</li> <li>0.5 &mu;M オレイン酸およびリノール酸</li> <li>1.5 &mu;M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li> <li>0.12 &mu;M Fe3+ (Ferlixit)</li> </ul> MIDEMs 増殖培地: <ul> <li>DMEM</li> <li>20% FBS</li> <li>2 mM グルタミン</li> <li>5 ng/ml ヒト bFGF</li> <li>100 IU ml ペニシリン</li> <li>100 mg/ml ストレプトマイシン</li> </ul> 分化培地: <ul> <li>DMEM</li> <li>2% 馬血清 (HS)</li> <li>100 IU ml ペニシリン</li> <li>100 mg/ml ストレプトマイシン</li> <li>2 mM グルタミン</li> </ul> </td></tr><tr><td colspan="4">表1.試薬、材料、装置、培地のリスト.</td></tr></tbody></table>

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

患者由来のiPSCは、将来の自家細胞療法プロトコルにとって非常に貴重な細胞源となる可能性があります。iPSC由来の筋芽幹細胞/前駆細胞は、ペリサイト由来のメソアンジオ芽細胞(iPSC由来のメソアンジオ芽細胞様幹細胞/前駆細胞:IDEMs)と同様に、異なる形態の筋ジストロフィーの影響を受ける患者から生成されたiPSCから確立することができる。患者固有のIDEMは、異なる戦略(レン チウイルスベクター、ヒト人工染色体など)で遺伝的に補正され、筋形成調節因子MyoDの過剰発現時に筋形成分化の可能性を高めることができる。この筋形成電位は、特異的分化アッセイを用いて インビトロで 評価され、免疫蛍光によって分析される。IDEMの再生電位は、急性および慢性の筋肉再生を示す2つの代表的なマウスモデルにおける筋肉内および動脈内移植時に 、生体内でさらに評価される。宿主骨格筋へのIDEMの寄与は、移植されたマウスにおける異なる機能検査によって確認される。特に、動物の運動能力の改善はトレッドミル試験で研究される。細胞の生着と分化は、移植された筋肉に関する多くの組織学的および免疫蛍光アッセイによって評価される。全体として、この論文では、細胞移植の有効性を分析するための移植方法とその後の結果尺度に焦点を当てて、IDEMの分化能力を評価するために現在利用されているアッセイとツールについて説明する。

報告された代表的な結果は、図1のワークフローに示されている主なin vitro/in vivoアッセイに従います。48時間4OHタモキシフェン投与後のMyoD陽性核は、培養中のMyoD-ER導入IDEM内で識別可能である(図2A)。その後、細胞は融合し、多核化されたミオチューブに分化する(図2B)。急性筋肉損傷のマウスモデルに筋肉内移植を行うと、IDEMが組織再生に寄与する(図3)。筋ジストロフィーのマウスモデルに対する遺伝子および細胞治療設定におけるIDEMの有効性は、トレッドミル運動耐性試験によって評価された:図4は、野生型MIDPMをSgca-null/scid/ベージュマウスに移植した後に得られた結果を示し、治療されたマウスにおける運動能力の改善を示す7。移植された筋肉のエクスビボ分析は、宿主組織へのIDEMのコロニー形成の程度を表すGFP陽性領域を示し(図5A-C)、し...

誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋原性前駆細胞は、筋ジストロフィーを治療するための細胞治療戦略の有望な候補である。このプロトコルは、急性および慢性筋肉再生のマウスモデルにおけるiPSC由来メソアンジオ芽細胞(筋前駆体の一種)の生着および分化を評価するために必要な移植および機能的測定について記述する。

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

この手順の全体的な目的は、急性および慢性の筋肉再生マウスモデルにおいて、人工多能性幹細胞由来の筋肉前駆細胞の筋形成能を評価することです。これは、まずin vitroで細胞の筋形成能を評価することによって達成されます。次のステップとして、筋肉内注射により細胞を移植します。あるいは、微小外科的手法を用いて大腿動脈に細胞を注入します。最終ステップとして、処置した動物のジストロフィー表現型の機能的改善を評価します。最終的に、免疫蛍光染色および組織学的解析を用いて、ドナー細胞のホスト筋肉への生着および機能的寄与を明らかにします。本手法は、細胞治療アプローチの検討など、骨格筋再生の分野における重要な疑問の解決に寄与します。この技術の意義は、iPS細胞由来のDER前駆細胞を用いた自己細胞治療戦略への道を切り拓く可能性があり、筋ジストロフィーの治療へと広がります。また、本手法は幹細胞ベースの治療に関する知見を提供できるだけでなく、分子の筋内投与や関節内投与、およびそれに伴う筋機能や形態への影響の解析など、他の系にも適用可能です。この手法を考案したきっかけは、iPS細胞の培養によって、組織生検からの採取可能性や増殖能といった成体幹細胞の制限の一部を克服できると考えたことでした。まず、筋形成調節因子であるmyoDを過剰発現させるタモキシフェン誘導性ベクターを導入した、安定した細胞株を作成します。1% Matrigelでコーティングし、培地で洗浄した後、導入細胞をプレートに播種し、増殖培地を用いて37°Cでインキュベートします。細胞は1〜2日でコンフルエントに達します。準備が整ったら、1 µM の 4-hydroxy tamoxifen を増殖培地に添加します。24時間後、増殖培地を 1 µM の 4-hydroxy tamoxifen を添加した分化培地に交換します。培養物を毎日観察して筋管の形成を確認し、培養準備が整った後は、1日おきに培地の半分を新鮮な分化培地に交換してください。これらは移植アッセイに使用されます。ここでは、筋内移植における生着範囲を決定するために、ジストロフィーマウスおよび免疫不全マウスを使用します。移植の24時間前に、タモキシフェンを注射して動物に前処理を行います。また、細胞に対しても、前夜に増殖培地にタモキシフェンを添加して前処理しておく必要があります。移植当日、トリプシンで剥離させ、細胞数を計測して遠心分離します。細胞をPBSで1回洗浄した後、カルシウムおよびマグネシウム不含PBSで再懸濁し、30 µLあたり10⁶ cellsの濃度に調整します。動物を麻酔し、皮膚を消毒した後、前脛骨筋を確認します。近位腱の停止点を特定し、針を挿入します。この点の2 mm下にチップを置きます。針を脛骨に対して15度の傾斜で5 mm挿入し、針を引き抜きながら細胞懸濁液をゆっくりと注入します。針が筋肉内に2 mm残っている状態でシリンジを空にします。針の刺入経路から細胞懸濁液が漏れ出すのを防ぐため、筋肉から針を抜く際は注意してください。同様の手順に従い、胃腸筋への注射はアキレス腱および大腿四頭筋の筋腱移行部から2 mm上で行います。また、動脈内移植のための大腿注射は、遠位腱から2 mm上で行います。先に示した方法に従って、動物および細胞にタモキシフェンによる前処理を行います。移植の準備が整ったら、先に示した方法で細胞を調製しますが、遠心分離の前にろ過を行う点だけが異なります。ペレットをカルシウムおよびマグネシウム不含のPBSで再懸濁し、細胞懸濁液の分布を可視化するために10%パテントブルー染料を添加します。シリンジ内で細胞を注意深く再懸濁し、注入前に気泡をすべて取り除きます。麻酔後、図のように部位を剃毛し、消毒します。5〜7 mmの切開を加え、大腿神経血管束を特定します。ピンセットを用いて、血管束を覆っている結合組織の筋膜を慎重に取り除きます。次に、ピンセットの先端を大腿静脈および神経と動脈の間にそっと差し込み、徐々に隙間を広げることで、動脈から静脈と神経を注意深く分離させます。大腿静脈は脆弱です。大腿動脈から分離させる際に、静脈を挟み込まないように注意してください。分離後、鉗子の片方の先端で動脈を持ち上げ、もう一方の先端で動脈をクランプします。30 Gの針を用いて動脈を穿刺し、クランプ領域の下流に、細胞懸濁液50 µLを毎秒約5 µLの注入速度で注入します。針と鉗子をゆっくりと動脈から抜き、肢への血流を再開させます。出血を防ぐため、滅菌ガーゼで圧迫止血を行うか、必要に応じて電気凝固を行います。パテントブルー染料を使用することで、注入が正しく行われたかを即座に確認できます。正しく注入された場合、肢全体が速やかに淡い青色に変わります。その後、傷口を縫合し、動物が回復するまで観察してください。3日間鎮痛剤を投与し、傷口を点検します。処置したマウスの運動能力の日次変化は、トレッドミル試験によって評価します。ベースラインの測定は治療の約1か月前から開始し、試験した各個体の改善度を評価するために使用します。最初のステップは、試験前に動物を運動に慣らすことです。そのためには、トレッドミルを速度 6 m/min に設定し、10 分間走行させます。この手順を1週間、1日おきに繰り返します。動物が装置に慣れたら、傾斜を10度に設定し、動物をトレッドミルのレーンに入れます。開始速度を分速6メートルに設定してトレッドミルを起動します。運動を開始したがらない動物には、軽く背中を押して促してください。次に、タイマーを開始し、動物が休息エリアに5秒以上留まった直後に、2分ごとに速度を2 meters per minuteずつ上げます。トレッドミルに再び乗せようとせず、棒で軽く触れて運動の再開を促してください。マウスがトレッドミルに再び乗ろうとせず、休息エリアに5秒以上留まった場合に、疲労したとみなします。5秒間隔で3回の連続的な機械的刺激を与えた後、各動物のパフォーマンスを記録し、細胞移植の2週間後から、少なくとも3回、毎週または10日ごとに測定を繰り返します。テスト後、処置群のマウスに対しても同様の手順を繰り返します。ベースラインとの比較を用いて、パフォーマンスの変化を評価します。4-ヒドロキシタモキシフェン投与から48時間後、培養されたmyo DER導入品の中にmyo-positive核が認められます。ここに示す通りです。1週間後、細胞は融合し、多核の筋管へと分化します。急性筋肉損傷のミラーリングモデルに筋内移植すると、これらの項目はトレッドミルによる組織再生の結果に寄与します。運動耐性試験では、移植後の治療マウスにおいて運動能力の改善が示されています。移植した筋肉のex vivo解析では、GFP陽性領域が宿主組織へのIMSのコロニー形成範囲を示しており、ドナー細胞がジストロフィー筋肉に生着することが証明されています。重要なことに、移植された細胞はin vivoで分化し、新しい骨格筋線維を形成することができます。この例は、遺伝的に矯正されたIMSから、$\alpha$-sarcoglycan欠損skid beigeマウスへの$\alpha$-sarcoglycanの発現を示しています。マッソン・トリクローム染色により、処置後の筋肉において線維化組織の減少が認められました。この手順に続き、FreeWheelテスト、エバンズブルー色素アッセイ、単一筋線維または全筋の力学特性測定などの手法を用いることで、随意運動能の改善、線維の脆弱性、および比力に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、in vitro、in vivo、およびex vivoアッセイを用いて、iPS細胞由来筋原細胞の筋肉分化能、移植能、および機能的有効性を評価する方法について十分に理解できるはずです。

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

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