比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画シロイヌナズナサスペンション細胞培養

次の実験の全体的な目標は、異なる膜サブコンパートメントを分離し、それらの異なるタンパク質組成を研究することです。これは、処理の分化を可能にするために、さまざまな条件下で細胞を安定同位体標識することによって達成されます。質量分析では、第2ステップとして、2つの処理からの細胞材料が混合されるため、ジョイント処理が保証され、サンプル間のばらつきが減少します。

次に、原形質膜サブコンパートメントを精製し、スクロースによって無菌、濃厚、および無菌の枯渇サブコンパートメントに分離します。定量的質量分析のデータに基づいて、さまざまな処理下でサブコンパートメント内のタンパク質存在量が異なることを示すグラジエント遠心分離結果が得られます。このプロトコールがウェスタンブロッティングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、数千のタンパク質のサブコンパートメント分布を定量的に記録できるため、シグナル伝達プロセスの新たな候補を発見できることです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、二相系のme精製を学ぶのが難しいため、非常に重要です。その理由は、多くのステップが必要であり、正確な制御と徹底的な取り扱いが非常に重要であるためです。この方法は、膜プロセスの調節因子として新しいタンパク質候補を発見することにより、シグナル伝達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます テキストプロトコルに記載されているように、標識および非標識シロイヌナズナの細胞懸濁培養物を成長させることから始めます。

液体窒素中の約1リットルの7日齢細胞懸濁液培養物から均質化された細胞を、ビーカー内の新鮮な重量に基づいて同量の標識凍結細胞培養物と非標識凍結細胞培養物を混合し、2容量のバッファーHを加え、直ちにビーカーをシェーカーに置き、材料が溶けて氷がなくなるまで振とうします。結晶は、サンプルをバッファーH遠心分離機とバランスをとった後、ミラークロスの1層を介して250ミリリットルの遠心分離管にホモジネートをろ過します。遠心分離後、スナットを約32ミリリットルの容量で予冷した超遠心チューブにロードします。

緩衝液hとサンプルのバランスをとった後、100、000Gsおよび摂氏4度で30分間遠心分離することにより、ミクロソームをペレット化します。遠心分離後、上清を除去すると、上清には可溶性タンパク質が含まれています。この画分を少量保存して、さらなるタンパク質沈殿のために保存することができ、その後の可溶性タンパク質の分析では、テキストプロトコルに記載されているように、各サンプルの膜ペレットをそれぞれの量のバッファーRに再懸濁します。

6グラムの二相システムを使用する場合は、正確に2グラムの再懸濁膜ペレットをロードし、サンプルの蘇生懸濁液に使用したのと同じ量の純粋なバッファーRをU2にロードします。U、one、U2チューブを30回反転させてゆっくりと混合し、1秒あたり約1回の反転でサンプルを1500Gと摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離後、U2から上相を取り出します。上相をU1からU2に移してから、同じパラメータを使用して遠心分離を繰り返します。次に、U2から上相を超遠心チューブに移し、5容量のバッファーRで希釈し、サンプルを200,000Gおよび摂氏4度で1時間完全に遠心分離します。

最後に、再利用します。メンブレンペレットを少量のTおよびEバッファーに懸濁して、界面活性剤耐性メンブレンを分離します。ブラッドフォードアッセイで原形質膜画分の濃度を確認した後、界面活性剤とタンパク質、重量対重量比が13〜15、最終界面活性剤濃度が0.5〜1%の原形質膜画分にTriton X 100を添加し、サンプルを約100RPMおよび摂氏4度で30分間振とうします。

次に、処理した原形質膜の1つの容量に3容量の2.4モルスクロースを加えて、最終濃度のスクロースを1.8モルにします。1.8モル画分の上にそれぞれのスクロース溶液をロードすることにより、超遠心チューブでスクロースグラジエントを準備します サンプルを250,000GSおよび摂氏4度で18時間遠心分離します。0.15モルと1.4モルのスクロースの界面に乳白色のリングとして見える可能性のある低密度バンドの乱れを避けるために、ローターから超遠心チューブを慎重に取り外します。

何も見えないこともありますが、洗剤耐性タンパク質画分はまだそこにあります。グラジエントの上部から0.75ミリリットルの体積の一部分、相間リングより上の約1.5ミリリットルの体積をカバーする分画2と3を取り除きます。そして、相間リングの下に0.5ミリリットル。

耐界面活性剤膜分率を表します。これらのフラクションを15ミリリットルのファルコンチューブに集めます。画分9および10は、界面活性剤可溶性膜画分を含有し、比較のために収集することもできる。

界面活性剤耐性画分からタンパク質の抽出を開始するには、回収した画分に4容量のメタノールを加え、十分にボルテックスします。次に、クロロホルムを1容量追加してから、再度完全にボルテックスします。最後に、3容量の水を加え、ボルテックスでサンプルを2000Gで5個完全に遠心分離します。

卓上遠心分離機を使用して、間相のタンパク質層の上の水相を除去します。次に、3容量のメタノールとボルテックスを加えます。ペレットを引く前にS上清を完全に取り除き、溶解消化の準備をします。

溶液分解を開始するには、サンプルを少量の6モル尿素、2モル甲状腺、pH 8、略してUTUに溶解します。サンプルと互換性のある容量をできるだけ小さく使用してください。サンプルを遠心し、テキストプロトコールに記載されているように分解を行った後、サンプルを4容量の10ミリモルトリスHCL PH 8で希釈します。

次に、サンプルタンパク質の50マイクログラムあたり1マイクロリットルのトリプシンを室温で一晩インキュベートし、700 RPMで一定の振とうを行い、サンプルを4, 000 GSで10分間遠心分離します。最後に、サンプルを最終濃度0.2%TFAまで酸性化して、約10分の1容量の2%triフルオロ酢酸を添加してpH 2に到達します。C 18ステージチップを製造するには、使い捨てプラスチックペトリ皿などの平らで清潔な面にモールディスクC18を置きます。

直径1.5mmの鈍い先端の皮下注射針を使用して小さな椎間板を打ち抜きます。ディスクは針に突き刺さり、ピペットチップに移すことができます。ディスクを針から押し出し、針の内側にある溶融シリカまたはチューブフィッティングを使用してピペットチップの先細りに固定します 50マイクロリットルの溶液Bを準備したステージチップに置くことにより、C 18ステージチップをコンディショニングします。

2000 RPMで2分間遠心分離機で先端を回転させます ベンチトップ遠心分離機では、100マイクロリットルの溶液を使用してステージチップを平衡化します。平衡化とスピンを繰り返します。

サンプルをディスクにロードしますampディスクを内側にしてサンプルをピペットチップに慎重にピペットで移します。サンプルの全量がC 18ディスクを通過するまで、遠心分離機でチップを回転させます。ステージチップを100マイクロリットルの溶液Aで2回洗浄します.遠心分離機でチップを回転させた後、EITを40マイクロリットルの溶液Bで新しい1.5ミリリットルの反応チューブに集めて遠心分離します。

再度、理想的な条件下でサンプルを速度vacに濃縮します。約1〜2マイクロリットルの液体が残ったら、脱水プロセスを停止します。最後のステップとして、最終容量の9マイクロリットルのResus懸濁液をサンプルに加え、質量分析のためにマイクロタイタープレートに移します。

原形質膜タンパク質の濃縮は、二相系の下期における原形質膜、画分、およびタンパク質の小さな雄弁のプロテオミクス分析によって示すことができます。下期には細胞の内膜が含まれています。例えば、受容体キナーゼタンパク質のような典型的に知られている原形質膜タンパク質は、原形質膜画分では存在量が多く、内膜を含む下期画分では存在量が少なかった。

次に、小胞体の既知のタンパク質は、内膜画分に高い存在量を示し、原形質膜画分では観察されませんでした。その後の難界面活性膜画分の濃縮は、理想的な場合には、低密度膜小胞の乳白色の輪の形成をもたらす。チューブの高さの約5分の1で、予想通り、界面活性剤耐性メンブレンまたはDRMフラクションに最も多く存在したレムタンパク質が見つかりました。

逆に、膜に存在しないタンパク質、A、b、Cトランスポーターなどのミクロドメインは、DRM画分において存在量の増加を示さない。また、A TPAs F零錯体由来のミトコンドリアタンパク質や60sリボソーム由来のリボソームタンパク質などの典型的な汚染物質は、DRM画分に濃縮された存在量を示さない。質量分析後も最小限の量を同定できますが、原形質膜におけるタンパク質のリン酸化状態のタンパク質存在量比、標識細胞培養物と非標識細胞培養物の画分を定量的に区別できます。

MS 定量ウィンドウでの一般的な結果では、同定されたペプチドのほとんどでイオン強度比が 1 対 1 であることが示されています。イオン強度比が1対1から大きく逸脱しているペプチドは、標識細胞培養と非標識細胞培養で異なる制御が行われていると考えられており、適用する処理の影響を受けるタンパク質とのマッチングの候補となります。代謝標識を成功させるための優れた品質管理は、ここに示すように、標識ペプチドと非標識ペプチドの両方をナノHPLC分離の単一ピークとして組み合わせることです。

この手法を習得すれば、抽出開始からサンプルが質量分析計にロードされるまでの3日間で完了します。この手順に続いて、特定の標的タンパク質のサプリケーションに関する追加の質問に答えるために、Western Beltのような他の方法を実行することができます。したがって、このビデオを見た後、安定同位体標識植物細胞培養物を混合する方法、二相システム上での原形質膜精製の実施方法、および無菌の枯渇膜サブコンパートメントから無菌の濃縮物を分離する方法を十分に理解しているはずです。