Name: 比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画シロイヌナズナサスペンション細胞培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶ シロイヌナズナ懸浮細胞の代謝標識と膜分画法による比較プロテオーム解析。プラズマ膜サブコンパートメントを分離し、質量分析でタンパク質組成を定量的に比較してシグナル伝達候補を同定する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport%2C+signal+transduction+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li>
<li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li>
<li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rafts+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).</li>
<li>Silvius, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+membrane+molecules+between+raft-and+non+raft-domains%3A+insights+from+model+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).</li>
<li>Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+plant+and+animal+cells%2C+detergent-resistant+membranes+do+not+define+functional+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts.</a> Plant Cell. , (2011).</li>
<li>Lauwers, E., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+yeast+transporters+with+detergent-resistant+membranes+correlates+with+their+cell-surface+location%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.</a> Traffic. 7, 1-15 (2006).</li>
<li>Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-%C3%9F-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li>
<li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+remodeling%2C+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li>
<li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li>
<li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li>
<li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li>
<li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li>
<li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li>
<li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li>
<li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li>
<li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li>
<li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li>
<li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID%2C+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protrome+Research%22%5BJournal%5D)">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li>
<li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StatQuant%3A+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li>
<li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+wants+cRacker%3A+Automated+standardized+data+analysis+of+LC%2FMS+derived+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li>
<li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+annotation+of+remorins%2C+a+plant-specific+protein+family%3A+Evolutionary+and+functional+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li>
<li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondetergent+isolation+of+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li>
<li>Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li>
<li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li>
<li>Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739(2011).</li>
<li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li>
<li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li>
<li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+organelle+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li>
<li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。 著者、ヴィトルドスジーマンスキーは分子植物生理学のマックスプランク研究所の従業員である。著者は、ラウドシュルツはホーエンハイム大学、ドイツの従業員である。

本論文で提示プロトコルは、多くのステップが含まれており、それらのすべては、洗剤耐性膜と洗剤の可溶性画分に植物細胞膜の純粋で代表画を得ることが重要である。したがって、指示に従って、各ステップに従うことが重要である。 非イオン性界面活性剤（ステップ3.2）を用いて原形質膜画分の処理は、膜マイクロドメイン分別の品質に最も強い影響を有する。異なる製剤間で再現性のある結果を得るために、同じ実験からの異なるサンプルを比較することができるように、それが正確に原形質膜中のタンパク質の濃度を評価し、タンパク質含有量に対して同じ比で常に清浄剤を適用することが非常に重要である常に同じ最終濃度まで。実際に、それは時々、高いタンパク質濃度を有する試料を希釈する、または異なる濃度のストックを使用する必要があることを意味トリトンX-100の。 生化学的研究では、最近、膜マイクロドメイン28〜30の単離のために界面活性剤を含まない方法を使用する研究者の間で傾向があった。これらの方法は、フレンチ圧力セルプレスと同様に非常に小さな針を通して...

1972年には、ジョナサン·シンガーとガースニコルソンは、一般的に1960年代初頭に受理されたタンパク質 - 脂質 - タンパク質サンドイッチモデルを置き換え、流動モザイクモデルの細胞膜の構造モデルを提案した。歌手とニコルソンは生体膜は、すべての脂質およびタンパク質の分子が自由に拡散し、容易に5二次元液体として考えることができると仮定した。その時以来、膜組成の原形質膜と知識の構造モデルがさらに複雑になった。特に、原形質膜内に、そのようなタンパク質複合体および脂質/ステロール基づいて構造的に無秩序なミクロドメインのような構造を観察することができる。人工モデル膜6,7において、ステロールおよびスフィンゴ脂質は、横方向に変化した物理的特徴を有する領域を形成するために、他の脂質種から分離することができる。細胞膜内でのこの分離は、主にステロールの高いSA間の自己会合特性によって引き起こされるphopshoとスフィンゴ脂質8の炭化水素鎖をturated。特に、剛性ステロールリングは、剛性がまっすぐ飽和脂質種との相互作用に有利とこれらの相互作用は、膜の厚さ及び硬度を高める、より拡張された立体配座に隣接する炭化水素鎖を強制。 ステロール濃縮膜マイクロドメインの一般的に観察特徴の一つは、非イオン性界面活性剤、トリトンX-100またはブリジ35で処理するとそれらの不溶性だった。これらの画分を膜マイクロドメインと同一であると考えられていたし、その生化学的製造法2に基づいて、洗剤耐性膜（DRM）と呼ばれていました。 DRM抽出中の非イオン性界面活性剤の使用は、生化学的なDRMの準備を直接生きた細胞9内の任意の特定の膜コンパートメントに対応しないことなど、いくつかの批判を受けた。特に、タンパク質の比洗剤は、このような調製において重要と思われる異なる界面活性剤だ、ならびに異なる界面活性剤の量は、界面活性剤耐性膜画分10の異なる組成物を得ることができる。しかし、特定のタンパク質種は、これらの特異的細胞性ステロールに富む膜ドメインに関連付けることを示す証拠があり、これらのタンパク質がよく界面活性剤耐性膜画分11の生化学的調製物において富化される。植物DRM画分に認められた、とのDRMでの存在が依存ステロールであったために、タンパク質のコアは、このようなファスシクリン様アラビノガラクタンタンパク質（のFLA）とのSKUタンパク質ファミリーのメンバーとして特にGPIアンカー型タンパク質であった。また、このような受容体様キナーゼまたはホスホリパーゼのようないくつかのシグナル伝達タンパク質は、11を発見された。これらの結果は、哺乳類の膜マイクロドメイン12,13に関する多くのプロテオミクス研究と一致している。また、植物のストレス応答14の文脈における膜マイクロドメインの役割のための証拠が増えている-16。 ここに記載されているプロトコルは、細胞膜マイクロドメインの分別のための堅牢な方法を提供し、特に、私たちは、ステロールが豊富な膜コンパートメント4,11,14のストレス誘発性の変化を描くことを可能にする界面活性剤濃度、タンパク質を使用しています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS </strong</td></tr><tr><td>>Chemicalsは、特に</td><td></td><td></td><td></td>断りのない限り、Sigma-Aldrichから注文されました</tr><tr><td>アンモニア(ストック25%溶液)</td><td>WAKO</td><td>010-03166</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 10 &mu;m </td><td>GL-Science</td><td>5020-75010</td><td></td></tr><tr><td>エンポア ディスク C18</td><td>バリアン</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール(PEG 3350)</td><td>シグマ</td><td>88276</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン T500</td><td>ロス</td><td>9219.2</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>プロメガ</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル (PIC)</td><td>シグマ</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>K15NO3</sub</td><td>>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-765-PK</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Optima L-80 XP 超遠心分離</td><td>機 ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC II ナノ液体クロマトグラフ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac RVC 2-25</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

原形質膜マイクロドメインは、脂質やステロール環境の物理的性質に基づいて特徴であり、プロセスのシグナル伝達に特定の役割を持っている。プロテオーム解析のための植物細胞からのステロールに富む膜マイクロドメインを抽出し、他の細胞区画からの汚染のために複数の準備手順とソースに主に困難な作業です。原形質膜は、植物細胞内のすべての膜の約5〜20％を構成し、従って、高度に精製された原形質膜画分の単離は困難である。頻繁に使用される方法は、95％の純度を有する1原形質膜小胞を生じるポリエチレングリコールおよびデキストラン中水性二相分配を伴う。原形質膜内のステロールに富む膜マイクロドメインは、アルカリ性pHで冷非イオン性界面活性剤での処置の際に不溶性である。この界面活性剤耐性膜画分は、で超遠心分離によりバルクプラズマ膜から分離することができるucroseグラデーション2。続いて、タンパク質は、メタノール/クロロホルム沈殿によってショ糖勾配密度の低いバンドから抽出することができる。抽出したタンパク質は、その後、脱塩し、最終的に、LC-MS/MSで分析トリプシン消化されます。ステロールに富むミクロドメインのための私達の抽出プロトコルは、 シロイヌナズナ細胞培養物からの清浄な界面活性剤耐性膜画分の調製のために最適化される。 我々は興味3の生物学的処理を以下の定量的な比較プロテオミクス研究のための唯一の窒素源としてK 15 NO 3とシロイヌナズナ懸濁細胞培養の完全な代謝標識を使用しています。関節タンパク質抽出のための標識および非標識細胞培養物の等量比を混合することにより、最終的な定量的結果についての準備段階の影響を最小限に維持される。また抽出時の材料の喪失は、コントロールと同じように処理サンプルの両方に影響を与えるDそのため、光とヒーブペプチドの比率は一定のままである。もう一方は対照4として機能する提案方法のいずれかで標識するか、または非標識の細胞培養は、生物学的処理を受ける。

代謝的に標識されたシロイヌナズナの細胞培養物を使用して提示プロトコルでは、植物組織（ステップ2は、2および図4）から、原形質膜を分離し、原形質膜内の界面活性剤耐性膜画分を濃縮することができる（ステップ3,3および図5）。その後、プロトコルは、これらの界面活性剤耐性膜画分（ステップ4）からのタンパク質の抽出、比較プロテオーム解析（ステップ5）のためのタンパク質の消化を可能にする。最後に、リン酸化ペプチド（ステップ8）のオプションの濃縮は、細胞シグナル伝達過程を研究する上で特に興味深い。最後のステップは、標識し、非標識細胞培養由来の膜画分中のタンパク質存在比の定量的データ分析（ステップ9、 図6）である。 2相系（ステップ2）、およびその後の遠心分離混合後の典型的な結果は、明確な色の上相とある緑は下相（ 図2）色。緑の葉緑体や他の内部の膜から膜小胞が低いデキストラン相に取り込まれている間に原形質膜小胞は、優先的に、上方のPEG相に関...

ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

本実験の全体的な目的は、異なる膜サブコンパートメントを分離し、それらのタンパク質組成の違いを研究することです。これは、異なる条件下で細胞を安定同位体標識し、処理間の区別を可能にすることによって達成されます。第2ステップの質量分析では、2つの処理から得られた細胞材料を混合します。これにより、共通の処理工程が保証され、サンプル間のばらつきが低減されます。次に、ショ糖密度勾配遠心法を用いて、細胞膜のサブコンパートメントを精製し、sterile、rich、およびsterile depletedの各サブコンパートメントに分離します。定量質量分析法によるデータに基づいた勾配遠心の結果から、異なる処理条件下における各サブコンパートメント中のタンパク質含有量の差が明らかになります。ウェスタンブロッティングなどの既存の手法に対する本プロトコルの主な利点は、数千種類のタンパク質のサブコンパートメント分布を定量的に記録でき、それによってシグナル伝達プロセスの新たな候補因子を発見できる点にあります。2相系の精製は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。その理由は、多くの工程が含まれ、精密な制御と徹底した取り扱いが非常に重要であるためです。本手法は、膜プロセスの調節因子となる新たなタンパク質候補を同定することで、シグナル伝達分野における重要な疑問の解決に寄与します。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、標識および非標識のArabidopsis thaliana細胞懸濁培養を行います。液体窒素中で凍結させた培養7日目の細胞懸濁液（約1 L）から得られたホモジナイズ細胞を、生重量に基づいてラベル済みおよび未ラベル済みの凍結細胞培養物と同量ずつビーカーに混合し、2倍量のバッファーHを加えます。直ちにビーカーをシェーカーに置き、材料が融解し氷晶がなくなるまで振盪します。ホモジナイズ液をミラークロス1層でろ過し、250 mL遠心チューブに回収します。バッファーHでサンプルの量を調整した後、10,000 Gで8分間遠心分離します。遠心分離後、上清を容量約32 mLの予冷した超遠心チューブに分注します。バッファーHでサンプルの量を調整した後、100,000 G、4°Cで30分間遠心分離し、ミクロソームをペレット化します。遠心分離後、可溶性タンパク質を含む上清を除去します。この分画のごく少量を、後のタンパク質沈殿およびそれに続く可溶性タンパク質の分析用に保存しておくことができます。各サンプルの膜ペレットを、テキストプロトコルに記載されている通り、それぞれ規定量のバッファーRで再懸濁し、U12相系の最上層にロードします。6gの二相系を使用する場合、再懸濁した膜ペレット2gを正確に分注し、サンプル再懸濁に使用したものと同じ量の純粋なバッファーRをU2に分注します。U1管とU2管を、約1秒に1回の速さで30回反転させてゆっくりと混合し、サンプルを1,500 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、U2から上層を回収します。U1の上層をU2に移し、同じ条件で再度遠心分離を行います。次に、U2の上層を超遠心管に移し、5倍量のバッファーRで希釈して十分に混合し、サンプルを200,000 ×g、4 °Cで1時間遠心分離します。最後に、再懸濁を行います。界面活性剤耐性膜の単離のため、膜ペレットを少量のT and Eバッファーに懸濁します。Bradfordアッセイで細胞膜画分の濃度を確認した後、界面活性剤とタンパク質の重量比が13～15、最終的な界面活性剤濃度が0.5～1%となるように、細胞膜画分にTriton X 100を添加します。サンプルを約100 RPM、4°Cで30分間振盪します。次に、処理済み細胞膜1量に対して2.4 Mのスクロースを3量加え、最終的なスクロース濃度を1.8 Mにします。超遠心管に、1.8 M画分の上にそれぞれのスクロース溶液を重ねてスクロース密度勾配を作成します。サンプルを250,000 ×g、4 °Cで18時間遠心分離します。0.15 Mと1.4 Mのスクロースの界面に乳白色のリングとして見えることがある低密度バンドを乱さないよう、超遠心管をローターから慎重に取り出します。何も見えない場合がありますが、界面活性剤耐性タンパク質画分は依然として存在しています。グラジエントの上部から0.75 mLの分画（分画2および3）を回収します。これにより、界面リングより上の約1.5 mLの容量と、界面リングより下の0.5 mLの容量がカバーされます。界面活性剤耐性膜画分を示します。これらの画分を15 mLのファルコンチューブに回収します。画分9および10には界面活性剤可溶性膜画分が含まれており、比較のためにこれらも回収することが可能です。界面活性剤耐性分画からタンパク質の抽出を開始するには、回収した分画に4容量のメタノールを加え、十分にボルテックスします。次に、1容量のクロロホルムを加え、再び十分にボルテックスします。最後に、3容量の水を加えて十分にボルテックスし、サンプルを2000 Gsで5分間遠心分離します。ベンチトップ遠心分離機を用いて、界面のタンパク質層の上にある水相を除去します。次に、3倍量のメタノールを加え、ボルテックスします。インソリューション消化の準備として、ペレットを回収する前に上清を完全に除去します。サンプルを少量の6 M urea 2 M thyroid pH 8（略称：UTU）に溶解し、インソリューション消化を開始します。サンプルの量に合わせて、可能な限り少ない液量を使用してください。テキストプロトコルに従ってサンプルの遠心分離と消化を行った後、サンプルを10 mM tris HCl pH 8で4倍量に希釈します。次に、試料タンパク質50 µgあたり1 µLのtrypsinを加え、700 RPMで定速撹拌しながら室温で一晩インキュベートし、試料を4,000 ×gで10分間遠心分離します。最後に、約1/10量の2%トリフルオロ酢酸を添加し、最終濃度0.2% TFA、pH 2まで試料を酸性化します。C18ステージチップを作製するには、使い捨てプラスチック製ペトリ皿などの平らで清潔な表面に、C18ディスクを配置します。直径1.5 millimetersの鈍端下皮針を用いて、小さなディスクを打ち抜きます。ディスクは針に付着するため、ピペットチップへと移すことができます。ディスクを針から押し出し、溶融シリカまたは針の内部に適合するチューブを用いて、ピペットチップのテーパー部分に固定します。準備したステージチップに50 microlitersの溶液Bを滴下し、C 18ステージチップをコンディショニングします。遠心分離機を用いて、チップを2000 RPMで2分間遠心分離します。ベンチトップ遠心分離機を用い、100 µLの溶液aを使用してステージチップを平衡化します。ベンチトップ遠心分離機で、チップを5,000 ×gで遠心分離します。平衡化と遠心分離を繰り返します。ディスク内部にあるピペットチップにサンプルを注意深くピペッティングし、ディスクにロードします。サンプルの全量がC 18ディスクを通過するまで、遠心機でチップを回転させます。ステージチップを100 µLの溶液Aで2回洗浄します。遠心機でチップを回転させた後、40 µLの溶液Bが入った新しい1.5 mL反応チューブにEITを回収し、遠心分離します。再度、最適な条件下でスピードバキュームを用いてサンプルを濃縮します。液体が1～2 µL程度になった時点で脱水工程を停止してください。最終ステップとして、9 µLのResus懸濁液をサンプルに加えて最終容量とし、質量分析用にマイクロタイタープレートへ転送します。プラズマ膜タンパク質の濃縮は、プラズマ膜、画分、および二相系の下相に含まれるタンパク質の微量サンプルのプロテオーム解析によって示すことができます。下相には細胞の内膜が含まれています。例えば、受容体キナーゼタンパク質のような、一般的に知られているプラズマ膜タンパク質は、プラズマ膜画分で高発現し、内膜を含む下相画分では低発現であることが示されました。同様に、小胞体として知られているタンパク質は内膜画分に多く含まれており、細胞膜画分には認められませんでした。続いて界面活性剤耐性膜画分を濃縮すると、理想的な場合には、低密度の膜小胞による乳白色のリングが形成されます。期待通り、チューブの高さの約5分の1の箇所において、界面活性剤耐性膜（DRM）画分にremnタンパク質が最も多く検出されました。逆に、ABCトランスポーターのような膜のマイクロドメインに存在しないタンパク質は、DRM画分において存在量の増加を示しません。また、ATP合成酵素F₀複合体由来のミトコンドリアタンパク質や60Sリボソーム由来のリボソームタンパク質といった典型的なコンタミネーション（混入物）も、DRM画分において濃縮された存在量を示しません。質量分析後に微量のタンパク質が検出されることはありますが、ラベル化および非ラベル化細胞培養の血漿膜画分におけるタンパク質の存在比やタンパク質リン酸化状態を定量的に区別することが可能です。MS定量ウィンドウにおける代表的な結果では、同定されたペプチドのほとんどで、イオン強度の比が1:1となるはずです。イオン強度の比が1:1から著しく逸脱しているペプチドは、ラベル化された細胞培養物とラベル化されていない細胞培養物の間で差次的に調節されていると考えられ、適用された処理によって影響を受けたタンパク質へのマッチング候補となります。代謝標識が成功したことを示す良好な品質管理の指標は、ここで示されているように、ラベル化されたペプチドとラベル化されていないペプチドの両方のバージョンが、nano HPLC分離において単一のピークとして共溶出することです。この手法を習得すれば、抽出の開始から質量分析計へのサンプルロードまでを3日間で完了させることができます。この手順に続き、特定の標的タンパク質の補給に関するさらなる疑問を解決するために、Western Beltなどの他の手法を実施することが可能です。したがって、このビデオを視聴することで、安定同位体標識した植物細胞培養液の混合方法、二相系を用いたプラズマ膜の精製方法、および標識濃縮膜画分と標識希釈膜画分の分離方法について十分に理解できるはずです。

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物材料から、特定の種​​類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている...

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等し​​い体積を質量分析によって混合し、分析する。...

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

1つのサンプルを用いて生物学的組織からの脂質、代謝産物およびタンパク質を包括的に抽出するためのプロトコルを提示する。...

単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ここでは、シロイヌナズナの葉と 3 つメイン サブ コンパートメント (エンベロープ、質、およびチラコイド) から葉緑体を浄化する手法について述べる差動遠心、連続 Percoll の勾配の組み合わせを使用して、蔗糖不連続密度勾配。メソッドは subplastidial...

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

複数の生体分子のシステム全体の分析は、生物学的プロセスに関する機能的および機械的な洞察を得るために重要です。本明細書により、同期クラミドモナス培養から採取された単一のサンプルから脂質、代謝産物、タンパク質およびデンプンの高スループット抽出について広範なプロトコルが記載されている。...

緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。...

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

学ぶ シロイヌナズナ懸浮細胞の代謝標識と膜分画法による比較プロテオーム解析。プラズマ膜サブコンパートメントを分離し、質量分析でタンパク質組成を定量的に比較してシグナル伝達候補を同定する手法です。

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画

さらに動画を探す