比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画

本実験の全体的な目的は、異なる膜サブコンパートメントを分離し、それらのタンパク質組成の違いを研究することです。これは、異なる条件下で細胞を安定同位体標識し、処理間の区別を可能にすることによって達成されます。第2ステップの質量分析では、2つの処理から得られた細胞材料を混合します。これにより、共通の処理工程が保証され、サンプル間のばらつきが低減されます。

次に、ショ糖密度勾配遠心法を用いて、細胞膜のサブコンパートメントを精製し、sterile、rich、およびsterile depletedの各サブコンパートメントに分離します。定量質量分析法によるデータに基づいた勾配遠心の結果から、異なる処理条件下における各サブコンパートメント中のタンパク質含有量の差が明らかになります。ウェスタンブロッティングなどの既存の手法に対する本プロトコルの主な利点は、数千種類のタンパク質のサブコンパートメント分布を定量的に記録でき、それによってシグナル伝達プロセスの新たな候補因子を発見できる点にあります。

2相系の精製は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。その理由は、多くの工程が含まれ、精密な制御と徹底した取り扱いが非常に重要であるためです。本手法は、膜プロセスの調節因子となる新たなタンパク質候補を同定することで、シグナル伝達分野における重要な疑問の解決に寄与します。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、標識および非標識のArabidopsis thaliana細胞懸濁培養を行います。

液体窒素中で凍結させた培養7日目の細胞懸濁液（約1 L）から得られたホモジナイズ細胞を、生重量に基づいてラベル済みおよび未ラベル済みの凍結細胞培養物と同量ずつビーカーに混合し、2倍量のバッファーHを加えます。直ちにビーカーをシェーカーに置き、材料が融解し氷晶がなくなるまで振盪します。ホモジナイズ液をミラークロス1層でろ過し、250 mL遠心チューブに回収します。バッファーHでサンプルの量を調整した後、10,000 Gで8分間遠心分離します。遠心分離後、上清を容量約32 mLの予冷した超遠心チューブに分注します。

バッファーHでサンプルの量を調整した後、100,000 G、4°Cで30分間遠心分離し、ミクロソームをペレット化します。遠心分離後、可溶性タンパク質を含む上清を除去します。この分画のごく少量を、後のタンパク質沈殿およびそれに続く可溶性タンパク質の分析用に保存しておくことができます。各サンプルの膜ペレットを、テキストプロトコルに記載されている通り、それぞれ規定量のバッファーRで再懸濁し、U12相系の最上層にロードします。

6gの二相系を使用する場合、再懸濁した膜ペレット2gを正確に分注し、サンプル再懸濁に使用したものと同じ量の純粋なバッファーRをU2に分注します。U1管とU2管を、約1秒に1回の速さで30回反転させてゆっくりと混合し、サンプルを1,500 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、U2から上層を回収します。U1の上層をU2に移し、同じ条件で再度遠心分離を行います。次に、U2の上層を超遠心管に移し、5倍量のバッファーRで希釈して十分に混合し、サンプルを200,000 ×g、4 °Cで1時間遠心分離します。

最後に、再懸濁を行います。界面活性剤耐性膜の単離のため、膜ペレットを少量のT and Eバッファーに懸濁します。Bradfordアッセイで細胞膜画分の濃度を確認した後、界面活性剤とタンパク質の重量比が13～15、最終的な界面活性剤濃度が0.5～1%となるように、細胞膜画分にTriton X 100を添加します。サンプルを約100 RPM、4°Cで30分間振盪します。

次に、処理済み細胞膜1量に対して2.4 Mのスクロースを3量加え、最終的なスクロース濃度を1.8 Mにします。超遠心管に、1.8 M画分の上にそれぞれのスクロース溶液を重ねてスクロース密度勾配を作成します。サンプルを250,000 ×g、4 °Cで18時間遠心分離します。0.15 Mと1.4 Mのスクロースの界面に乳白色のリングとして見えることがある低密度バンドを乱さないよう、超遠心管をローターから慎重に取り出します。

何も見えない場合がありますが、界面活性剤耐性タンパク質画分は依然として存在しています。グラジエントの上部から0.75 mLの分画（分画2および3）を回収します。これにより、界面リングより上の約1.5 mLの容量と、界面リングより下の0.5 mLの容量がカバーされます。

界面活性剤耐性膜画分を示します。これらの画分を15 mLのファルコンチューブに回収します。画分9および10には界面活性剤可溶性膜画分が含まれており、比較のためにこれらも回収することが可能です。

界面活性剤耐性分画からタンパク質の抽出を開始するには、回収した分画に4容量のメタノールを加え、十分にボルテックスします。次に、1容量のクロロホルムを加え、再び十分にボルテックスします。最後に、3容量の水を加えて十分にボルテックスし、サンプルを2000 Gsで5分間遠心分離します。

ベンチトップ遠心分離機を用いて、界面のタンパク質層の上にある水相を除去します。次に、3倍量のメタノールを加え、ボルテックスします。インソリューション消化の準備として、ペレットを回収する前に上清を完全に除去します。

サンプルを少量の6 M urea 2 M thyroid pH 8（略称：UTU）に溶解し、インソリューション消化を開始します。サンプルの量に合わせて、可能な限り少ない液量を使用してください。テキストプロトコルに従ってサンプルの遠心分離と消化を行った後、サンプルを10 mM tris HCl pH 8で4倍量に希釈します。

次に、試料タンパク質50 µgあたり1 µLのtrypsinを加え、700 RPMで定速撹拌しながら室温で一晩インキュベートし、試料を4,000 ×gで10分間遠心分離します。最後に、約1/10量の2%トリフルオロ酢酸を添加し、最終濃度0.2% TFA、pH 2まで試料を酸性化します。C18ステージチップを作製するには、使い捨てプラスチック製ペトリ皿などの平らで清潔な表面に、C18ディスクを配置します。

直径1.5 millimetersの鈍端下皮針を用いて、小さなディスクを打ち抜きます。ディスクは針に付着するため、ピペットチップへと移すことができます。ディスクを針から押し出し、溶融シリカまたは針の内部に適合するチューブを用いて、ピペットチップのテーパー部分に固定します。準備したステージチップに50 microlitersの溶液Bを滴下し、C 18ステージチップをコンディショニングします。

遠心分離機を用いて、チップを2000 RPMで2分間遠心分離します。ベンチトップ遠心分離機を用い、100 µLの溶液aを使用してステージチップを平衡化します。ベンチトップ遠心分離機で、チップを5,000 ×gで遠心分離します。平衡化と遠心分離を繰り返します。

ディスク内部にあるピペットチップにサンプルを注意深くピペッティングし、ディスクにロードします。サンプルの全量がC 18ディスクを通過するまで、遠心機でチップを回転させます。ステージチップを100 µLの溶液Aで2回洗浄します。遠心機でチップを回転させた後、40 µLの溶液Bが入った新しい1.5 mL反応チューブにEITを回収し、遠心分離します。

再度、最適な条件下でスピードバキュームを用いてサンプルを濃縮します。液体が1～2 µL程度になった時点で脱水工程を停止してください。最終ステップとして、9 µLのResus懸濁液をサンプルに加えて最終容量とし、質量分析用にマイクロタイタープレートへ転送します。

プラズマ膜タンパク質の濃縮は、プラズマ膜、画分、および二相系の下相に含まれるタンパク質の微量サンプルのプロテオーム解析によって示すことができます。下相には細胞の内膜が含まれています。例えば、受容体キナーゼタンパク質のような、一般的に知られているプラズマ膜タンパク質は、プラズマ膜画分で高発現し、内膜を含む下相画分では低発現であることが示されました。

同様に、小胞体として知られているタンパク質は内膜画分に多く含まれており、細胞膜画分には認められませんでした。続いて界面活性剤耐性膜画分を濃縮すると、理想的な場合には、低密度の膜小胞による乳白色のリングが形成されます。期待通り、チューブの高さの約5分の1の箇所において、界面活性剤耐性膜（DRM）画分にremnタンパク質が最も多く検出されました。

逆に、ABCトランスポーターのような膜のマイクロドメインに存在しないタンパク質は、DRM画分において存在量の増加を示しません。また、ATP合成酵素F₀複合体由来のミトコンドリアタンパク質や60Sリボソーム由来のリボソームタンパク質といった典型的なコンタミネーション（混入物）も、DRM画分において濃縮された存在量を示しません。質量分析後に微量のタンパク質が検出されることはありますが、ラベル化および非ラベル化細胞培養の血漿膜画分におけるタンパク質の存在比やタンパク質リン酸化状態を定量的に区別することが可能です。

MS定量ウィンドウにおける代表的な結果では、同定されたペプチドのほとんどで、イオン強度の比が1:1となるはずです。イオン強度の比が1:1から著しく逸脱しているペプチドは、ラベル化された細胞培養物とラベル化されていない細胞培養物の間で差次的に調節されていると考えられ、適用された処理によって影響を受けたタンパク質へのマッチング候補となります。代謝標識が成功したことを示す良好な品質管理の指標は、ここで示されているように、ラベル化されたペプチドとラベル化されていないペプチドの両方のバージョンが、nano HPLC分離において単一のピークとして共溶出することです。

この手法を習得すれば、抽出の開始から質量分析計へのサンプルロードまでを3日間で完了させることができます。この手順に続き、特定の標的タンパク質の補給に関するさらなる疑問を解決するために、Western Beltなどの他の手法を実施することが可能です。したがって、このビデオを視聴することで、安定同位体標識した植物細胞培養液の混合方法、二相系を用いたプラズマ膜の精製方法、および標識濃縮膜画分と標識希釈膜画分の分離方法について十分に理解できるはずです。