腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス S.ネズミチフス菌バクテリア

この実験の全体的な目標は、腫瘍内で増殖するSチリアン細菌のin vivo遺伝子発現動態を研究することです。まず、マウス異種移植がんモデルでは、尾静脈から細菌を静脈内注射します。細菌は腫瘍にコロニーを形成し、指数関数的に増殖しますが、遺伝子発現は発光レポーターを使用して視覚化されます。

動物全体の生物発光イメージングは、IVUSスペクトルイメージングシステムを使用して行われます。24時間から48時間かけて、IVUS画像のタイムコースを撮影します。この画像シリーズは、腫瘍の均質化とプレーティングによって生成されたコロニー数と相関しています。

これらのデータを組み合わせることで、標準的な細胞培養技術を使用して、in vivoでの腫瘍標的細菌の遺伝子発現と集団動態をリアルタイムで細胞調製継代、細胞株で定量的に測定できます。この実験では、我々は、80〜100%の目標co流暢さに総細胞をocar8細胞s使用し、ヘモ、サイトメーター、resus、懸濁液、およびフェノールレッドフリーDMEMで細胞を採取し、1ミリリットルあたり10倍7細胞、またはフラスコあたり約200マイクロリットルの目標濃度でカウントしました。15%減少した成長因子マトリゲルを添加し、移植腫瘍の移植まで細胞懸濁液を氷上に保ちます。

Anesは、3%isofフッ素を使用して4週齢の雌ヌードマウスに麻酔をかけました。腫瘍ごとに100マイクロリットルの細胞を1ミルシリンジに装填し、2つの両側後脇腹注射部位のそれぞれに27.5ゲージの針を取り付けます。鉗子で皮膚をやさしく持ち上げてテントを作り、基部に細胞を注入します。

血液を産生する血液を深く浸透させすぎないように注意してください。ピンセットを使用して、シリンジをスパッタなしでそっと取り外します。腫瘍の直径が2〜4ミリメートルに達するまで、10〜20日間毎日腫瘍の成長を監視します。

バクテリアの調製は、マイナス80の冷凍ストックまたは冷蔵プレートから、3ミルのLB培地と抗生物質でバクテリアの一晩培養を開始します。この実験では、午前中にELH4 30株を使用しました。培養物を1〜100に希釈してろ過したポンドにし、0.4〜0.6のOD600に成長させます。

スピンダウンしてリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、最終OD 600が0.1、または10の約1×10/milで7細胞に再懸濁します。バクテリアの注射、動物への麻酔、尻尾の利き手の方を向く位置。尾静脈の位置を特定し、温水またはヒートランプを使用して拡張します。

マウス1匹あたり100マイクロリットルのバクテリアを1ミルの注射器に装填し、チップを90度未満に曲げます。シリンジの先端を尾静脈に合わせ、抵抗を感じない浅く浸透し、細菌を注入します。注射を成功させるために血流の変位を観察します。

コロニー形成が起こるまで、イメージングの前に約12〜18時間待ちます。マウスイメージングは、誘導チャンバー内の動物を麻酔します。次に、各マウスをイメージングプラットフォームに置きます。

正確な位置決めを維持して、時点間の定量的な結果を確保し、Ibis Spectrumイメージングシステムを使用して動物を画像化します。複数の動物を画像化する場合は、動物間の交差照明による動物の解剖を防ぐために、それらの間に光バリアを配置し、腫瘍をピンセットで保持します。逆ハサミで皮膚をはがします。

動き:皮膚の大部分が分離されたら、ピンセットを使用して腫瘍を完全に切除します。臓器と事前に計量したマイクロ遠心チューブを置きます。これらのチューブの質量は大きく異なる可能性があるため、定量的な結果を得るためには、チューブを事前に計量することが重要です。

各時点の細菌の生体分布を定量化し、腫瘍を切除し、重量を量り、500マイクロリットルのPBSと15%グリセロールを追加し、組織の涙液を使用して均質化し、細菌コロニーの代表的な結果をカウントするための段階希釈とプレートを生成します。このプロトコルを使用して、腫瘍標的細菌のin vivo増殖と遺伝子発現動態に関するデータを生成することができます。ここでは、全体的なワークフローをまとめます。

第1段階では、細菌を注入し、ivusを用いて動物をイメージングし、レポーターとして発光による遺伝子発現を測定しました。次に、第2段階では、腫瘍を切除、均質化、および播種してコロニー数を測定し、腫瘍内で増殖する細菌の数を決定しました。細菌株が生成する生物発光は、最小コロニー化投与量が約5倍、すべての場合で10倍から5倍程度の減弱により、注入量によるivusシグナルの増加を用いて可視化されます。

細菌は、腫瘍に特異的にコロニーを形成したか、またはマウスシグナルで有意に増殖しないか、放射輝度単位を使用して定量化され、曝露時間または10〜6以上の典型的な値は、特定の感染に対するコロニー形成を示しています。ピークはここでの注入後約36時間ですが、使用する菌株やプラスミドによってタイミングが異なる場合があります。次回の実験で定量的な結果が得られるように、毎回マウスをまったく同じように配置してください。

細菌の生体内分布は、さまざまな臓器での細菌の経時的な成長を測定するために定量化され、生存可能な細菌と腫瘍は、腫瘍を切除して均質化し、その段階希釈をめっきすることによって定量化されます。他の臓器も定量化できます。同様に、腫瘍の脾臓比は希釈係数を使用して逆計算した後の細菌特異性の典型的な尺度であるため、ここでは脾臓を使用しています。

これらのカウントにより、特定の細菌集団を経時的に測定することができます。左側では、実験期間中、バクテリアの数が着実に増加していることがわかります。倍加時間は1時間から3時間で、バッチ培養実験よりも大幅に短縮されます。

これは、腫瘍微小環境の栄養条件が悪いためである可能性があります。右側では、腫瘍の脾臓の比率を定量化し、実験全体で増加することを確認しました。これらの実験の目標は、IVUSイメージングとコロニーカウント技術を使用して、細菌と腫瘍環境の成長と遺伝子発現のダイナミクスを定量的に監視することです。

私たちは、細菌の集団が腫瘍環境でin vivoで特徴付けることができることを示しました。将来的には、より複雑な遺伝子発現プログラムを設計し、操作して、細菌の高度な治療送達システムを構築することができます。