Name: 腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス S.ネズミチフス菌バクテリア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶ腫瘍内細菌の遺伝子発現ダイナミクスをマウス異種移植モデルで可視化する方法。減毒Salmonella typhimuriumの増殖と発現をバイオルミネセンスイメージングでリアルタイムに定量化し、細菌療法の評価に活用する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

私たちは、原稿の重要な読書や編集のためにH.フレミングに感謝します。この作品はMisrockポストドクトラルフェローシップ（TD）とNDSEG大学院生フェローシップ（AP）によってサポートされていました。 SNBはHHMIの研究者でもある。

1。細胞調製<ol><li>標準的な細胞培養技術を用いて継代細胞系。この実験では、OVCAR-8細胞（NCI DCTD腫瘍リポジトリ、フレデリック、MD）を用いた。 100％ - 80のコンフルエントターゲットに細胞を成長させる。 </li><li> 5分間5ミリリットルトリプシンで細胞をインキュベートし、その後、5ミリリットルRPMI培地+ FBS、トリプシンを不活性化するために追加します。 </li><li>収穫と血球のセルを数える。 5×10 7細胞/ ml、またはフラスコ当たり約200μlの目標濃度でフェノールレッド不含DMEMに再懸濁する。 </li><li>減少増殖因子マトリゲル（BD Biosciences社）15％を追加して、移植まで氷上で細胞懸濁液を保つ。 </li></ol> 2。腫瘍移植<ol><li>イソフルラン3％を使用した4週齢の雌NCR / nuマウスを麻酔し、深い麻酔を確保するために、約5分待ちます。麻酔下ながら、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用します。 </li><li> 1ミリリットルの注射器で細胞を（腫瘍あたり100μl）をロードし、27 1を添付/ 2ゲージの針。 </li><li> 2国間後肢フランク注射部位のそれぞれについて、テントを作るとベースで細胞を注入するためにピンセットで優しく肌を持ち上げます。血を生産、あまりに深く浸透しないように注意してください。優しくはねずにシリンジをピンセットで取り除いてください。 </li><li> 2の腫瘍直径まで20日 - - 4ミリメートルに達した10毎日腫瘍の成長を監視します。 </li></ol> 3。細菌の準備<ol><li> -80℃の冷凍庫ストック又は冷蔵プレートから3ミリリットルLB培地+アンピシリン中の細菌の一晩培養を開始します。この実験では、使用されるS.ネズミチフス菌株ELH430（SL1344 PhoPQ-のaroA-）。 </li><li>午前中は、フィルタリングLBに文化1:100に希釈し、OD600 0.4に成長 - 0.6。 </li><li>スピンダウンとリンで3回洗浄する生理食塩水（PBS）は、バッファリングされ、0.1の最終OD600（1×10 7細胞/ ml程度）で再懸濁します。 </li></ol> 4。細菌インジェクション<ol><li>動物を麻酔あなたの利き手に向かって指している尾を持つその側にDポジション。麻酔下ながら、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用します。 </li><li>温水または熱ランプを用いて尾静脈を拡張する。 </li><li> 1ミリリットルのシリンジ内細菌（マウス当たり100μlの）をロードし、90度弱の先端を曲げる。 </li><li>尾静脈とシリンジ先端を合わせ、浅い深さ（全く抵抗を感じないはず）に浸透し、細菌を注入する。成功した注射用血流の変位を観察する。 </li></ol> 5。マウスイメージング<ol><li>誘導室に動物を麻酔はその後イメージングプラットフォーム上の各マウスを置きます。麻酔下ながら、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用します。時点との間の定量的な結果を保証するために正確な位置決めを維持する。 </li><li> IVISスペクトラムイメージングシステム（キャリパーライフサイエンス）を使用して、画像の動物。それらの間のイメージング以上1動物、場所光バリア、クロスilluを防止する場合mination。動物は、細菌の局在を確認するために、腹側の第1の結像されるべきである。 </li><li>画像の動物は背IVISの実験期間（36時間）ごとに2時間を使って。与えられたROIのタイムコースを生成します。 </li></ol> 6。細菌の生体内分布を定量<ol><li>吸収おむつで背中にCO 2と場所を使って動物を安楽死させる。 </li><li> 2後肢脇腹皮下腫瘍を露出するために動物を回します。腫瘍を分離除去するために周囲の皮膚組織をカット。ピンセットで腫瘍を保持し、逆はさみの動きを使って皮膚を除去。皮膚の大部分が分離されたときに、完全にピンセットを用いて腫瘍を取り除く。 </li><li>予め秤量マイクロチューブ内の臓器を置きます。これらのチューブの質量が大きく異なりますので、それは定量的な結果のためにそれらを事前に比較検討することが重要です。 </li></ol> 7。細菌の生体内分布を定量<ol><li>各時点で、消費税のために、腫瘍重量を量る。 </li><li> 500μlのPBS + 15％のグリセロールを追加し、組織特異Tearor（BIOSPEC）を使用してホモジナイズする。サンプル間のエタノールでホモジナイザー3回すすいでください。 </li><li>段階希釈し、細菌コロニーカウント用のプレートを生成します。単板を使用し、事前区分プレート上にプレートを複数の希釈に。 </li></ol>

<ol><li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+phoP%2FphoQ-deleted%2C+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li>
<li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li>
<li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li>
<li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li>
<li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li>
<li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li>
<li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+perfect+%28bacterial%29+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li>
<li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+%27biopixels%27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li>
<li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+delivery+of+siRNAs%3A+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li>
<li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+amplified+protein+expression+therapy%3A+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511(2013).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

この手順を用いて、腫瘍を定着細菌の増殖および遺伝子発現動態のタイムコースを生成することができる。これらの測定は、定期的にバッチ培養又はマイクロ流体デバイスにおいてインビトロで行われるが、それらはインビボで行うことがはるかに困難である。 これらの方法を適用することができるいくつかの変更がある。我々はマウスモデルを生成するためにOVCAR-8細胞株を使用しながら、他の細胞株の数を同等に使用することができる。例えば、luciferized細胞株は、腫瘍および細菌ルシフェラーゼチャネルの3D局在を可能にすることを使用することができる。我々は、バイラテラル後肢脇腹モデルを使用しながらさらに、異なる数および注入部位の位置が異なる現象を研究するためのモデルを生成するために使用することができる。例えば、もし腫瘍の大きさは重要な変数である、細胞の連続希釈物を調製することができ、Smalの生成、同時に異なる部位に注入LERと大きいサイズの腫瘍。最後に、我々はSを使用しながらネズミチフス菌株ELH430、Sの他の株...

合成生物学は、過去10年間で急速に進んでおり、現在はエネルギーと健康に重要な問題に影響を与えるように配置されている。しかしながら、臨床分野への展開は安全上の懸念及びin vivoでの遺伝子回路の設計基準を開発するの有無によって遅くされている。加速高い衝撃の医療アプリケーションでは医療インフラ、管理されたラボ環境の外に機能する遺伝子回路、安全かつ臨床的に受け入れられる微生物ホストと直接インタフェースする方法を利用して必要になります。 菌株の数は、腫瘍において優先的に増殖する能力に起因する癌治療のために研究されてきた。これらは、C.が含まれているノビイ、大腸菌、V. cholorae、B.ロンガム 、およびS.ネズミチフス3-8。S.彼らは9-12ヒト臨床試験の数は、安全性と寛容性を示してきたようにネズミチフス菌は、特定の関心を生成しました。これらbacteri<html>最初にホストの免疫系の刺激を介して、癌細胞代謝に必要な栄養素の欠乏による抗腫瘍効果を作成することが示された。治療上の貨物の生産は後で遺伝子改変を通して追加されました。これらの研究は、腫瘍治療のための細菌の使用における重要な進歩を表しているが、既存の努力の大半は、典型的に高い投与量、オフターゲット効果、およびホスト抵抗13-16の開発の送達をもたらす高レベルの発現に依存している。 さて、合成生物学は、高度なセンシングと配信17-20を実行できる計算に設計遺伝子回路を利用することによって、プログラム可能な貨物の生産を追加することがあります。これらの回路は、腫瘍特異的な刺激を感知し、必要に応じて貨物の生産を自己調節する送達システムとして機能するように設計することができる。しかし、 生体内でこれらの回路の機能を研究することはこれまで挑戦してきました。 ve_content &quot;&gt;プラスミド、合成回路の共通のフレームワークであるため、我々は、マウスモデルを用いたin vivoでプラスミドベースの遺伝子発現のダイナミクスを特徴づけるための方法を説明しますこれらのメソッドは、タイムラプス発光イメージングと生体内分布の定量的測定を利用しています一緒に、これらのアプローチは、臨床応用のための生体内でのプラスミドベースのネットワークを研究するためのフレームワークを提供します。

<table><tbody><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>BD Biosciences 309602</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc インスリン シリンジ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide ニードル </td><td>BD バイオサイエンス</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ミディアム 1640 (1X)、液体、L-グルタミン配合</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天ブロス</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani ブロス</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス<em&gt; s.ネズミチフス菌</em&gt;バクテリア

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

これらの実験の目的は、弱毒Sの増殖および遺伝子発現の動態に関する定量経時データを生成することである腫瘍の内部で成長菌細菌コロニー。 我々は、OVCAR-8（NCI DCTD腫瘍リポジトリ、フレデリック、MD）、ヒト卵巣癌細胞系の皮下注射によってマウスにおける異種移植モデルの腫瘍を発生した。 私たちは、S.の弱毒株を変換可視化2用プラスミド構成的に発現ルシフェラーゼ（luxCDABE）と： ネズミチフス菌 （SL1344 phoPQ-1 ELH430）。マウス1〜本質的に非病原性を維持しながら、これらの株は、特に腫瘍を植民地化する。 測定可能な腫瘍が確立した後、細菌は、投与量を変化させた尾静脈を介して静脈内注射した。腫瘍局在化、細菌の遺伝子発現を用いた60時間かけてリアルタイムでモニターしたvivoイメージングシステム（IVIS） であった 。各時点で、腫瘍を均質化し、切除し、そして遺伝子発現データとの相関のための細菌コロニーを定量するために播種した。 併せて、このデータは、腫瘍の内部に成長する細菌のin vivo増殖および遺伝子発現ダイナミクスの定量的尺度を与える。

このプロトコルを使用して、我々は腫瘍標的細菌のin vivo増殖および遺伝子発現ダイナミクスに関するデータを生成することができる。全体的なワークフローを図1に要約する。 第一段階では、細菌（緑）画像のレポーターとしてルミネッセンス（青）で遺伝子発現を測定するためにIVISを用いて動物を注入する。 次に、第二段階では、我々物品は、均質化、およびコロニー数についてのプレート腫瘍は、腫瘍の成長細菌の数を決定する。 菌株によって生成された生物発光を可視使用IVIS（ 図2）である。 5×10 5の周り最小植民投与量（ 図2A）を注入した投与量の信号が増加。すべての場合において、弱毒化細菌はいずれか一方のみの腫瘍特異的に定着するか、またはマウスにおいて成長しなかっすることができる。信号がnormaliに輝きユニットを用いて定...

これらの実験の目的は、弱毒化の増殖および遺伝子発現の動態に関する定量経時データを生成することである<em&gt; S.ネズミチフス菌</em腫瘍内部成長&gt;細菌コロニー。このビデオでは、腫瘍細胞の準備と注入、細菌の準備と注入、全動物の発光イメージング、腫瘍切除、および細菌のコロニーカウントをカバーしています。

腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス<em&gt; S.ネズミチフス菌</em&gt;バクテリア

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

本実験の全体的な目的は、腫瘍内で増殖するS tyrian細菌のin vivoにおける遺伝子発現ダイナミクスを研究することである。まず、マウス異種移植がんモデルにおいて、細菌を尾静脈から静脈内に注入する。細菌が腫瘍に定着して指数関数的に増殖する間、発光レポーターを用いて遺伝子発現を可視化する。IVUSスペクトラムイメージングシステムを用いて、個体全体の生物発光イメージングを行います。24時間から48時間にわたって、IVUS画像のタイムコースを撮影します。この一連の画像は、腫瘍をホモジナイズして平板培養することで得られたコロニー数と相関させます。これらのデータを合わせることで、標準的な細胞培養技術を用いた細胞株の細胞調製および継代において、腫瘍標的細菌の遺伝子発現と個体群動態をin vivoでリアルタイムに定量的に測定することが可能になります。本実験では、標的コンフルエンシーが80～100%になるようにOcar 8細胞を使用しました。ヘモサイトメーターで細胞を回収および計数し、標的濃度 5×10⁷ cells/mL（1フラスコあたり約200 µL）のフェノールレッドフリーDMEMに再懸濁します。15%低成長因子Matrigelを加え、腫瘍移植まで細胞懸濁液を氷上に保持します。3%イソフルランを用いて、4週齢の雌ヌードマウスを麻酔しました。1 mLシリンジに、腫瘍1つあたり100 µLの細胞を充填し、27.5Gの針を装着して、両側の後肢側腹部の注射部位にそれぞれ注入します。ピンセットで皮膚を軽く持ち上げてテント状にし、その基部に細胞を注入します。出血が起こらないよう、深く刺しすぎないことに注意してください。飛散を防ぐため、ピンセットを用いて慎重にシリンジを抜去します。腫瘍の直径が2～4 mmに達するまで、10～20日間、毎日腫瘍の成長を観察してください。細菌の調製として、-80°Cフリーザー保存ストックまたは冷蔵プレートから、抗生物質を含む3 mLのLB培地で細菌のオーバーナイト培養を開始します。本実験では、翌朝にS. typhi株ELH430を使用しました。培養液をフィルター滅菌済みLB培地で100倍に希釈し、OD600が0.4から0.6になるまで培養します。遠心分離してリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、最終的なOD 600が0.1、または細胞数として約1×10⁷ cells/mLになるように再懸濁します。細菌を注入するため、動物を麻酔し、尾が利き手に向くように配置します。尾静脈を確認し、温水またはヒートランプを用いて拡張させます。1 mLシリンジに細菌懸濁液をマウス1匹あたり100 µL分ロードし、チップを90度弱に曲げます。シリンジの先端を尾静脈に合わせ、抵抗を感じない浅い深度で刺入し、細菌を注入します。血液が押し出されるのを確認し、注入が成功したか判断しま

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Liu、PC 他。 抗生物質薬剤選択下における細菌の適応進化のための低コスト自動モルビドスタットの設計と利用 J. Vis. 経験。 (2016年)このビデオでは、マイクロ流体チップを使用して、トリメトプリム抗生物質ストレス下での野生型およびトリメトプリム耐性 大腸菌...

抗生物質薬剤耐性を研究するためのマイクロ流体チップ上の細菌増殖

我々は内膜破裂を追跡するための方法を説明することは細胞内細菌によって誘発...

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。...

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

ここでは、推定ファージ遺伝子の機能的特徴付けのための現象的アプローチを提示します。技術には、宿主の同化代謝を監視できる開発されたアッセイ、マルチ表現型アッセイプレート(MAP)、確立されたメタボロミクスの方法に加えて、異化代謝への影響を測定することができます。...

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

進化のシナリオで品揃え（空間的分離）の役割は、空間分布の調整を可能にする制御された実験室での単純な微生物系を用いて調べることができます。創始細胞密度を変更することにより、様々な品揃えのレベルは、 枯草菌のコロニーバイオフィルム内の蛍光標識された菌株を使用して可視化することができます。...

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

細菌の成長の定量的評価はシステム...

細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

マイクロチター皿における放射標識細菌培養物の成長は、(p)ppGppを含むヌクレオチドプールの豊富さの複数の技術的および生物学的複製アッセイを可能にする高スループットサンプリングを促進する。生理的ストレスの原因によって引き起こされる成長遷移の影響だけでなく、ストレスからの回復を監視することができます。.

大腸菌(p)ppGppの複数の生体内測定に対するマイクロチター皿放射ラベリングの使用、その後に薄層クロマトグラフィー

酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。...

成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌...

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ(ファージ)は、腸内細菌叢の不可欠な構成要素です。これらの共生生物は細菌の適応度と個体群動態を促進しますが、腸の恒常性や疾患にどのような影響を与えるかについてはほとんどわかっていません。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に適応可能なマウス...

マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

学ぶ腫瘍内細菌の遺伝子発現ダイナミクスをマウス異種移植モデルで可視化する方法。減毒Salmonella typhimuriumの増殖と発現をバイオルミネセンスイメージングでリアルタイムに定量化し、細菌療法の評価に活用する。

腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス

さらに動画を探す