Name: 免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ 免疫不全マウスへのヒト肝細胞癌異種移植片の皮下・肝内移植法。腫瘍断片や細胞懸濁液の調製、部分肝切除による移植成功率向上、腫瘍生物学と治療応答の研究に活用できます。

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この作品は、健康の研究のフェーズ1臨床医科学者賞（AG）のカナダの協会および癌研究協会（AG）からの営業助成金によって支えられている。著者らは、このプロジェクトの彼のサ​​ポートのためのドクター·ジョン·ディックに感謝しています。

プロトコルの概略図を図1に示す。 1。人間のHCCサンプルの処理書面による患者の同意を得て、制度的な研究倫理委員会の承認を得て初代ヒトのHCC検体を入手します。これらのプロトコルは、人類の福祉のためのすべて、制度、国、国際的なガイドラインを遵守して大学健康ネットワーク研究倫理委員会から承認を得て我々の施設で実施されてきた。 適切なサンプルは、臨床目的のために採取された後に外科的処置の後、できるだけ早く新鮮HCC検体を収集します。理想的には、これは、患者からの組織の除去後30分以内に行われるべきである。 図2に示すように、腫瘍の中央部分が壊死してもよいように、腫瘍の周囲から得られた少なくとも1cm 3の試料は、最適である。従来、このような放射線、化学療法、またはアブレーションなどの任意の切除処置を受けていない腫瘍は、腫瘍細胞が生存している可能性を最大にするために好ましい。バイオハザード品目の標準個人用保護プロトコルに従って、一次ヒト組織を処理します。無菌技術を使用して、クラスIIバイオセーフティキャビネット内の腫瘍組織および細胞調製のすべての実験室の操作を実行します。 <ol><li> 4℃で10〜25ミリリットルの無血清ダルベッコ改変イーグル培地/ハムF12で、新鮮な肝細胞癌サンプルを置き、即時処理し、マウスに異種移植用組織片および/または細胞の調製のために研究室に氷上に移す。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、100ミリメートルのX 20ミリメートルペトリ皿または他の適切な滅菌作業面に腫瘍サンプルを置く。 10番の外科用メスの刃を使用して約2〜3mm程度の断片に腫瘍サンプルを分割する。この時点では、スナップインを凍結またはホルマリン固定Sを検討OME腫瘍他の実験のための断片または必要に応じて分析しています。 </li><li>腫瘍断片の異種移植のために、断片が沈めたままにできるように、十分なマトリゲルを含む1つ以上のマイクロ遠心管にHCC断片の一部を配置する。氷の上でこれらのチューブを保管してください。 </li><li>腫瘍細胞懸濁液の調製のために、残りのHCC組織にできるだけミンチし、細分化した組織の体積に応じて50mlコニカルチューブ中DMEM-F12の5〜10 mlで混合するために、外科用メスの刃を使用する。 </li><li>ミリリットル200単位/最終濃度コラゲナーゼタイプIVおよびディスパーゼIIを追加し、0.8単位/それぞれミリリットル。 25ミリリットルピペットを用いてよく、上下の混合物をピペット。 </li><li>チューブを密封し、腫瘍組織の柔軟性に依存して30〜60分間、5％炭酸ガスインキュベーター中37℃で、ステップ1.6からの混合物をインキュベートする。酵素消化の進捗状況を評価するように、数回ごとに10分までの混合物をピペットで。 </li><li>ディの後輻輳は、100μmの細胞濾過器腫瘍ソリューションを渡し、完了です。穏やかに通過する腫瘍細胞の最大数を可能にするための25mlのピペットチップを用いて細胞ストレーナーの残りの組織をマッシュ。 15ミリリットルコニカルチューブ内の歪んだ細胞懸濁液を収集します。 </li><li> 4℃で5分間1,200 rpmでの腫瘍細胞懸濁液を遠心分離</li><li>優しく上清をデカント。ペレットのサイズに応じて、氷冷1×赤血球（RBC）溶解緩衝2-5ミリリットル追加し、穏やかに上下にピペッティングペレットを再懸濁する。 5分間氷上に保管してください。 </li><li> RBC溶解液を洗い流すために、4℃で5分間、1,000 rpmで15ミリリットル遠心全量をDMEM-F12を追加します。 </li><li>優しく上清を除去し、DMEM-F12でのRBCのない腫瘍細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>手動または自動細胞カウンターでパンブルー排除を用いて生細胞を数える。 </li><li>所望numbeを含む遠心腫瘍細胞のアリコート注射のための細胞のrは、上述したように、30の氷冷マトリゲルμlを、氷上でストアに得られた細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol> オプション：1.11ステップの後、我々は日常的に、バルク腫瘍細胞懸濁液からのヒトCD45 +細胞（白血球）を枯渇させる、及び/又はフローサイトメトリーまたは免疫磁気ビーズを用いて腫瘍細胞のサブセットを精製する。これらの技術のための詳細なプロトコールは、関連する抗体、ビーズ、およびフローサイトメーターの製造業者によって記載されている。 注：上述のプロトコルは、ステップ1.1において、一次ヒトHCC組織に対する異種移植組織に置き換えて、連続移植を行うためにマウスから採取したヒト腫瘍異種移植片を処理するために使用することができる。この状況では、工程1.11の後、我々は日常的に、マウスH2K組織適合抗原に対する抗体を用いて細胞懸濁液からマウス細胞を枯渇させる浸潤。 2。異種移植制度的動物管理委員会によって承認されたプロトコルに準拠したすべての動物の手続きを行っています。本明細書に記載の手順は、すべての関連する規制や制度機関、規制、ガイドラインに沿っやコンプライアンスの大学健康ネットワーク動物実験委員会の承認を受け、特定の動物への使用議定書の下で完了している。 小動物への吸入揮発性麻酔薬を送達するための機器は、動物施設や研究機関の標準的な操作手順に従って利用しなければならない。クラスIIバイオセーフティキャビネット内で無菌操作し、滅菌器具を用いて、すべての外科的処置を行う。非肥満糖尿病重症複合免疫不全を利用（NOD / SCID）または6〜8週齢の雌雄のマウスのNOD / SCID /インターロイキン2受容体γ鎖のヌル（NSG）の株（ジャクソン研究所、メイン州バーハーバー） 9,10。これらのマウスは免疫不全動物に適した無菌状態を提供することが可能な施設で飼育し、維持しなければならない。 1リットル/酸素の分で5％（V / V）吸入イソフルランを供給室で手術のためのマウスを準備します。角膜とつま先反射の消失、動物（S）であるまで麻酔を維持。皮下異種移植のために、動物の背部上の1つまたは複数の小領域（単数または複数）を剃り、70％エタノールで皮膚を清潔にする。肝内異種移植のために、ダウン鼠径部への腋窩から動物（S）の腹胸部と腹部を剃り、70％エタノールで皮膚を清潔にする。 2.1腫瘍断片の皮下移植<ol><li>マウスピースで吸入イソフルラン麻酔（2％（V / V）を1L /分のO 2）を維持し、発生しやすい、麻酔したマウスを置きます。外傷性傷害から動物の目を保護する涙 - ゲルを適用します。 </li><li>ベタジンで背剃毛面積（S）を殺菌する外科スクラブを70％エタノールに続いて、最後にポビドンヨード溶液による。 </li><li>無菌鋭いハサミで5mmの皮膚切開を加えます。 </li><li>皮下空間に静かに閉じ鈍いはさみを挿入し、腫瘍フラグメントを収容するのに十分な大きさのポケットを開発するために静かに広がった。 </li><li>無菌細いピンセットを用いて皮下ポケットにステップ1.3で作成腫瘍断片を挿入します。 </li><li>縫合糸またはクリップを使用して皮膚切開を閉じます。 </li><li>以下に説明するように、マウスに術後ケアを提供。 </li></ol>腫瘍細胞の皮下注射2.2 <ol><li>ステップ2.1.1と2.1.2で説明したように動物を準備します。 </li><li>針29 G 1/2インスリン注射器にステップ1.13で作成マトリゲル中の腫瘍細胞の懸濁液をロードします。 </li><li>皮下空間に針を挿入し、注射器の内容物を排出する。離れて皮下平面に沿って針数mm FRを進めるオム皮膚穿刺部位は、ニードルの引き抜き時の穿刺部位からの腫瘍細胞懸濁液の漏れを防止する。 </li><li>以下に説明するように、マウスに術後ケアを提供。 </li></ol> 2.3腫瘍断片の肝内移植<ol><li> 1ミリリットルの注射器の針で27 G 1/2を使用して、手術中の流体の損失を補償するために、麻酔した動物の首の背中の滅菌生理食塩水の皮下に350μlの管理。鎮痛のため、1ミリリットルの注射器27のG 1/2-in針を使用して、動物の腹部に皮下ブプレノルフィン（0.1 mg / kgの）を含む無菌生理食塩水350μlの管理。 </li><li>メンテナンスを吸入イソフルラン麻酔（2％（V / V）を1L /分のO 2）を提供するためにマウスピースの内側に位置し、鼻と口に予熱したパッドの上にマウス仰臥位に配置します。 </li><li>手足を拡張し、露光を最適化するために、操作面にテープで固定し腹側腹部と胸部。 </li><li>可視化を最適化するために、拡大ランプの下の手順を実行します。 </li><li>そして最後にポビドンヨード液で70％エタノールに続いてベタジン外科スクラブと腹側腹部と胸部に剃毛した皮膚を殺菌。 </li><li>無菌鋭いハサミを使用することで、横方向の両側性肋骨下の皮膚切開を行い、肝臓全体の適正露出を可能にするために、腹腔に入ること筋肉層を分ける。 </li><li>剣状突起上の皮膚にステッチを配置し、肝臓や周囲の構造のよりよい露出を可能にするためにテープでマウスピースに固定します。 </li><li>それを安定させるために肝臓に隣接して、後方2綿棒アプリケーターを使用してください。 </li><li>無菌10号手術用メスの刃を用いて肝臓の表面に、長さ、深さが3ミリメートルの切開を加えます。 </li><li>すぐに止血を達成するために切開部位にサージセル、穏やかな圧力を適用し、60〜90秒後に削除完全な止血が達成された場合にのみ進みます。 </li><li>無菌細いピンセットで、または、18G針で肝臓切開部に腫瘍フラグメントステップ1.3を配置します。 </li><li>腫瘍断片のずれを防止し、継続的な止血を確実にするために、肝切開を介しサージセルの小片を適用する。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じます。 </li><li>以下に説明するように、術後ケアを提供</li></ol>肝臓への直接注射により、腫瘍細胞の2.4肝内移植<ol><li>上記の2.3.7のステップ2.3.1で説明したように、マウスを準備します。 </li><li>針29 G 1/2を用いて、インスリン注射器中に腫瘍細胞懸濁液（1.13ステップで調製）を読み込む。 </li><li>肝臓は綿の先端のアプリケーターを使用して安定化して、肝臓へのインスリン注射針を挿入し、数ミリ被膜下平面に沿って穿刺部位を越えて先端を進める。 </li><li>優しく、注射器とTの内容を排出鶏は、肝臓から針を外します。 </li><li>穿刺部位にわたって行わサージセルと腫瘍細胞懸濁液の漏れを防ぎ、完全な止血を達成するために綿棒で静かに押し込みます。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じて、以下に説明するように、術後ケアを提供。 </li></ol>脾臓に注射を介して腫瘍細胞の2.5肝内異種移植<ol><li>上記の2.3.5へのステップ2.3.1で説明したように、マウスを準備します。 </li><li>無菌鋭いハサミを使用して、1センチメートル腹腔に入ること肋骨下切開を残してください。 </li><li>頭側と脾臓を露出させるために、動物の右側に胃を反映するために綿棒を使用してください。 </li><li>無菌細かい非外傷性の鉗子で、周囲の脂肪組織を処理することにより、切開部に脾臓を提供し、それを安定させるために、脾臓の後ろに綿棒を配置。 </li><li> 5-0絹縫合糸、場所を使用して下極以上の脾臓の周りに緩み予め結んだ結び目。 </li><li>針29 G 1/2を用いて、インスリン注射器中に腫瘍細胞懸濁液（1.13ステップで調製）を読み込む。 </li><li>脾臓下極へのインスリン注射針を挿入し、緩い予め結んだ結び目のレベルを越えて、それを進める。 </li><li>徐々に、注射器の内容物を排出脾臓から針を取り外し、注入された腫瘍細胞懸濁液の漏れを防止するための結び目を締める。 </li><li>腹腔内に脾臓を交換してください。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じて、以下に説明するように、術後ケアを提供。 </li></ol>ヒト腫瘍組織の肝内移植を促進するために2.6肝切除<ol><li> 2.3.7ステップ2.3.1で説明したように、マウスを準備します。 </li><li>無菌鋭いハサミで、肝臓の中葉に装着鎌状靭帯を分ける。 </li><li>綿棒を使用して、動員肝臓と位置左葉の周りに5-0絹縫合糸の緩い予め結んだ結び目の左葉。左葉のbilio - 血管茎に向けて可能な限り近い緩い結び目を進め、結び目を締めます。 </li><li>結び目およびその後の出血の滑りを防止するために小さな切り株を残して、滅菌鋏を用いて結紮する左葉の先端を切り出す。 </li><li>同様の技術を用いて、胆嚢を避け、肝臓の中葉の大部分を結紮し、切除する。 </li><li>使用サージセルおよび完全な止血を達成するための肝実質の切断面に沿って綿棒で穏やかな圧力。 </li><li>腫瘍フラグメントまたは腫瘍細胞の肝内異種移植の場合は、手順に進み、上述のように2.4.5 2.3.11または2.4.2に2.3.8。 </li><li>脾臓注射を介した腫瘍細胞の肝内異種移植のために、exposi、優しく頭側、動物の右側に胃を反映するために綿棒アプリケーターを利用脾臓ngの。上記のように2.5.9ためのステップ2.5.4に進みます。 </li><li>縫合糸またはクリップで切開を閉じて、以下に説明するように、術後ケアを提供。 </li></ol> 2.7術後ケア<ol><li>吸入麻酔マウスピースからマウスを外します。 </li><li>麻酔から回復し、完全に動員されるまで約20分間加熱ランプ下ケージにマウスを置きます。 </li><li>最初の2〜3術後日間ブプレノルフィン投与量ごとに8から12時間を繰り返します。 </li></ol>

<ol><li>El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).</li>
<li>Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%3A+insight+from+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma: insight from animal models.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).</li>
<li>Tateishi, R., Omata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+in+2011%3A+Genomics+in+hepatocellular+carcinoma--a+big+step+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).</li>
<li>Hoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+classification+and+novel+targets+in+hepatocellular+carcinoma%3A+recent+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements.</a> Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).</li>
<li>Ji, J., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+cancer+stem+cell+biology+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma.</a> Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).</li>
<li>Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+therapies+for+hepatocellular+carcinoma%3A+a+critical+view+of+the+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+human+tumour+tissue+xenografts+in+immunodeficient+mice%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review.</a> Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).</li>
<li>Sausville, E. A., Burger, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+human+tumor+xenografts+to+anticancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.</a> Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li>
<li>Ohbo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+hematopoiesis+in+mice+with+a+truncated+mutant+of+the+interleukin-2+receptor+gamma+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain.</a> Blood. 87, 956-967 (1996).</li>
<li>Fiebig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vivo+imaging+of+the+murine+liver%3A+a+micro-computed+tomography-based+anatomical+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study.</a> PLoS One. 7, e31179(2012).</li>
<li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cancer+cell+lines%3A+fact+and+fantasy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).</li>
<li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+features%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-130b+Promotes+CD133%28%2B%29+liver+tumor-initiating+cell+growth+and+self-renewal+via+tumor+protein+53-induced+nuclear+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1.</a> Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90%2B+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).</li>
<li>Park, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoangiogenesis+and+sinusoidal+%22capillarization%22+in+dysplastic+nodules+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver.</a> Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).</li>
<li>Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+liver+drug+uptake+following+hepatic+artery+and+portal+vein+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion.</a> J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).</li>
<li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2%2F3+partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%3A+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).</li>
<li>Zhang, D. Y., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis-dependent+mechanisms+of+hepatocarcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis.</a> Hepatology. 56, 769-775 (1002).</li>
<li>Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+solid+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice+are+vulnerable+to+lymphomagenesis+associated+with+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus.</a> PLoS One. 7, e39294(2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々は、実験的な質問およ​​び多種多様なアッセイに適用することができる免疫不全マウスに皮下および肝臓内のヒトHCC異種移植片を確立するために様々な技術を記載している。皮下異種移植片が広くHCC生物学の様々な側面を研究するために使用されてきたが、肝内異種移植片はほとんど文献に記載されていない。さらに、異種移植片の使用を記載した研究の大部分は、十分に確立された細胞株からこれらを生成した。ヒト腫瘍生物学をモデル化する12の癌細胞株の限界を考えると、我々は、初代ヒトHCC組織を用いて上述した技術を検証するために動機付けされている。原因実験群の小さなサンプルサイズに統計分析によってサポートされていないが、我々の観察は、主観的に腫瘍細胞またはその断片の肝移植の部分肝切除を追加した改良された生着率に向けて魅力的な傾向を明らかにした。&lt;/ pの&gt; 厳密に一次組織を活用することを試みてきたいくつかの研究は、13〜15が得られた患者のサンプルのごくわずかな割合で成功したの皮下移植を達成している。また、正常に上述の技術を用いて、免疫不...

肝細胞癌（HCC）は、世界中の5番目に多いがんと北米における癌死の最も急速に増加原因となっています。 HCCのための最も優勢な危険因子は、最も頻繁に起因する慢性ウイルス性肝炎、アルコール乱用、自己免疫疾患、または遺伝性代謝障害1発生する、肝硬変である。 世界的な集団上HCCによって課される重い疾病負担にもかかわらず、HCCの病態生理は、比較的乏しい例えば、結腸直腸癌、乳癌、または前立腺癌のような他の一般的な癌と比較して理解される。例えば、腫瘍形成を駆動する特定の分子と細胞事象は明らかに2で定義されていない。他のほとんどの固体の上皮癌と同様に、ゲノムのアプローチは、HCC 3に関連する収差の不均一性を明らかにした。多くの研究は、シュール、細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の種々の無秩序な活性を明らかにしたvival、分化、および血管新生4。また、肝細胞癌の病理生物学におけるがん幹細胞の役割は、5を明確にされていない。 HCCの病態生理の限られた理解した上で、肝細胞癌に有効な治療法の装備一式も比較的限定されたままである。再発は共通ですが、肝臓に限局した腫瘍を有する初期段階の患者は、腫瘍の切除や外科的切除を使用した根治療法の候補である。より進行した疾患を持つ患者のために、化学療法や放射線は、限られた有効性のものであり、緩和的意図を6と疾病管理のために主に使用されています。 人間のHCCの生体実験モデルにおいて 、高品質は、このように人間の肝細胞癌の病態生理学にだけでなく、新たな治療アプローチを評価するために多くの必要な基礎研究のための貴重なプラットフォームを提供します。細胞株または高度に規定されたマウスモデルを用い、PRIの異種移植片と比較して彼らはまた、7,8内および異なる患者との間に存在する不均一性を取り込む際に忠実に人間の病気をrecapitulatingすることができるので、免疫不全マウスでのメアリーのヒト腫瘍は、そのような研究のための貴重なツールとして浮上している。この目的のために、我々は、免疫不全マウスにおけるヒトHCC異種移植片を確立するための様々な方法を開発した。 HCC異種移植片を伴う公表された研究の大半は、この目的のために十分に確立されたヒトHCC細胞株の使用を記載しているが、我々はすぐに患者からの外科的切除後に得られた一次HCC標本から異種移植片を生成するために、我々のアッセイの最適化に焦点を当てている。 種々の異種移植技術は、異なる研究用途に必要とされてもよい。例えば、腫瘍断片から生成された皮下異種移植片が急速に発生し、容易に監視され、便利で新規な治療薬の局所投与のためのより適切かもしれない腫瘍反応のモニタリングが行われます。肝内異種移植は、肝細胞癌生物学の肝微小環境の役割に関する研究のためのより適切な場合があります。腫瘍細胞懸濁液から生成された異種移植片は、腫瘍開始細胞サブセットの同定および特徴付けのために、もしくは異種移植の前に、腫瘍細胞のインビトロ操作で必要とする実験のために必要である。我々は、このように開発され、初代ヒトのHCC検体から得られた細胞懸濁液または腫瘍断片から皮下または肝内異種移植片を確立するために、次のプロトコルを検証しています。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ&#8217;のMod。イーグルミディアム/ハム&#8217;s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) </td><td>WISENT Bioproducts</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td> コラゲナーゼ TypeIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td> マトリゲルマトリックス</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td> 10 % 緩衝ホルマリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % 生理食塩水溶液(NaCl)、滅菌済み</td><td>ハウスブランド</td><td>1011-L8001</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン外科用スクラブ</td><td>Purdue Pharma</td><td>NPN 00158313</td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane USP、99.9 %、吸入麻酔薬</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>ティアジェル </td><td>ノバルティス ファーマシューティカル</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td> 冷凍セクション コンパウンド </td><td>VWR</td><td>95057-838</td><td></td></tr><tr><td> クライオモールド、ティッシュ -Tek </td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td> プレシジョン グライド ニードル 18G 1 &#189; </td><td>ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td> プレシジョン グライド ニードル 27G &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td> インスリン注射器、3/10 cc U-100、29G&#189; </td><td>ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td> サージカルブレード No.10</td><td>フェザー・セーフティ・カミソリ</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td> #5-0 ソフトシルク外科用縫合糸、3/8インチ テーパーポイント針 </td><td>Syneture</td><td>VS-880</td><td></td></tr><tr><td> トランスポア外科用テープ</td><td>3M ヘルスケア</td><td>1577-1</td><td></td></tr><tr><td> コットンアプリケーター </td><td>Medpro</td><td>018-425</td><td></td></tr><tr><td> サージセル、酸化再生セルロース</td><td>エチコン</td><td>1951</td><td></td></tr><tr><td> セルストレーナー 100 &#956;m ナイロン</td><td>ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td> 倍率 照明と移動式ベース</td><td>ベンソン・メディカル・インダストリーズ社</td><td>モデル: RLM-CLT-120V</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュ滅菌 100x20 mm </td><td>Sarstedt 821474</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 組織鉗子、1x2 歯、4-1/2 インチ</td> <td>Almedic</td><td>A10-302</td><td></td></tr><tr><td> Adson ドレッシング鉗子 4-3/4 インチ</td> <td>Almedic</td><td>A10-220</td><td></td></tr><tr><td> 眼科ドレッシング鉗子、鋸歯状、ストレート、4 インチ </td><td>Almedic</td><td>A19-560</td><td></td></tr><tr><td> Hartman 止血鉗子、湾曲、3-1 / 2 "</td><td>アルメディック</td><td>A12-142</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ、湾曲、4-1 / 4 "</td><td>アルメディック</td><td>A8-690</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ、ストレート、4-1 / 2 "</td><td>アルメディック</td><td>A8-684</td><td></td></tr><tr><td>オルセン-ヒーガンニードルドライバー、5-1 / 2 "</td><td>アルメディック</td><td>A17-228</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

生体内でヒトの疾患を再現肝細胞癌（HCC）の実験モデルは、疾患の病態生理の研究のためと新しい治療法の前臨床評価のための貴重なプラットフォームを提供します。我々は、研究の種々の用途に利用され得る免疫不全マウスの皮下または同所性ヒトHCC異種移植片を生成するために、種々の方法を提示する。出発点として外科的切除を受けた患者からの原発腫瘍組織の使用に焦点を当て、我々は異種移植用の細胞懸濁液または腫瘍断片の調製を記載する。マウス脾臓内またはii）肝臓内、いずれかの肝臓への腫瘍細胞または断片の直接注入によって、または間接的に細胞を注入することにより、我々は、これらの組織i）の皮下に異種移植するための特定の技術を記載している。我々はまた、戦略などの異種移植の時にネイティブのマウスの肝臓の部分切除の使用を記載初代ヒト腫瘍細胞の肝臓内移植を容易にすることができるレシピエントマウスにおける活性肝再生の状態を誘導する。これらの技術の期待される結果が示されている。記載されたプロトコルは、一般的に広く使用され、頻繁に文献に引用されている十分に確立されたヒト肝細胞癌細胞株よりも少ないロバスト行う一次ヒト肝細胞癌サンプルと異種移植片を使用して検証されています。細胞株と比較して、我々は、異種移植モデルにおいて原発HCC生着の比較的低い可能性に寄与し、異種移植片の増殖の動態に影響し得る技術的な問題についてコメントする要因を議論する。また、得られた異種移植片を正確に親HCC組織に似ていることを保証するために適用されるべき方法を示唆している。

図3は、皮下ヒト肝細胞癌異種移植腫瘍の対応病理組織学的外観の典型的な外観を示しています。皮下異種移植片の発展と成長を容易にレシピエントマウスの毎日の検査によってモニターすることができる。腫瘍の異種移植と開発との間の時間間隔は、（組織のタイプ（細胞懸濁液対腫瘍断片）、組織の供給源（一次患者サンプル、継代異種移植片、又は細胞株）、および移植された組織の量に応じて大きく変化し得る細胞または腫瘍断片の大きさの数）。 6ヶ月の得られた1×10 5個の細胞から同様の異種移植片の開発のために必要とされるかもしれないが、例えば、かなりの異種移植片は、1〜2週間以内に、十分に確立されたHCC細胞株の5×10 6細胞の注射から発症し得る一次患者のHCCサンプルから。我々はimplantatio後6ヶ月よりも後の皮下異種移植片の形成は確認されていません腫瘍サンプルのN、したがって、異種移植が開発されていない場合は、この時点でレシピエントマウスを生け贄に捧げる。 図4は 、典型的な肝臓に腫瘍...

免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植は、癌の生物学を研究するための貴重なツールです。ヒト肝細胞癌細胞または腫瘍断片の皮下および肝臓内異種移植片を生成するための特定のプロトコルが記載されている。レシピエントマウスにおいて、部分肝切除により誘発される肝臓再生は、肝移植を容易にするための戦略として提示される。

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

この手順の目的は、免疫不全マウスにおいて、皮下または肝内へのヒト肝細胞癌（HCC）ゼノグラフトを作製することである。まず、皮下ゼノグラフト用に、新鮮なヒトHCC検体から腫瘍断片または単一細胞懸濁液を調製し、マウスに移植する。次に、肝内ゼノグラフトのために、腫瘍細胞の注入または腫瘍断片の皮下背側ポケットへの移植を行う。次のステップは、腫瘍細胞を脾臓または肝臓に注入するか、あるいは最終ステップとして腫瘍断片を肝臓に直接移植することです。動物を数週間観察し、腫瘍が発生するまで待ちます。最終的に、ヒトHCCゼノグラフトを用いることで、腫瘍形成のメカニズムや新規治療法への反応など、腫瘍生物学の多くの側面を研究することが可能になります。細胞株のみ、あるいは皮下異種移植のみを用いる既存の手法と比較した本手法の主な利点は、ヒト肝がんの原発検体および患者由来肝内異種移植を用いることで、ヒト肝細胞がんのより現実的な生物学的モデルを提供できる点にあります。腫瘍断片の皮下移植の手順については、私の研究室の博士研究員であるSharif Ahmedが実演します。まず、麻酔をかけたマウスを腹臥位に置き、マウスピースを用いて吸入イソフルラン麻酔を維持します。外傷から動物の目を保護するためにティアジェルを塗布し、次にベタダイン外科用スクラブ、70% ethanol、最後にポビドンヨード溶液を用いて、背部の除毛部位を滅菌します。次に、鋭利な鋏を用いて皮膚に5 mmの切開を加えます。閉じた鈍端鋏の先端を皮下空間に挿入し、ゆっくりと鋏を開いて、腫瘍片を収容するのに十分な大きさのポケットを作成します。次に、精密ピンセットを用いて腫瘍片を皮下ポケットに挿入し、腫瘍片の配置後にクリップで切開部を閉じます。matrigel中で懸濁した腫瘍細胞を、29ゲージ・1/2インチの針を装着したインスリン用注射器に充填します。次に、麻酔を施し除毛した動物の皮下空間に針を刺入し、穿刺部位から皮下平面に沿って数ミリメートル進めてから、注射器の内容物を注入します。ヒト腫瘍組織を移植するための動物の準備として、まず、術中の体液喪失をあらかじめ補うため、麻酔下にある動物の頸部背側に、1mL注射器と27ゲージ・1/2インチの針を用いて、滅菌生理食塩水350 µLを皮下投与します。次に、予熱したパッドの上で仰臥位のマウスを麻酔し、肢を伸ばして手術台にテープで固定し、腹側腹部と胸部の露出を最適にします。動物の上に拡大鏡付きランプを配置し、先ほど示したように腹側腹部と胸部の除毛した皮膚を滅菌します。鋭い剪刀を用いて、肋骨下で左右に横方向の皮膚切開を行い、その後、筋肉層を分離して肝臓全体を露出させます。剣状突起上の皮膚に縫合糸をかけ、それをテープでマウスピースに固定して、肝臓および周囲の構造をより良く露出させます。次に、組織の隣接部および後方に2本の綿棒を配置して肝臓を固定します。その後、鋭いハサミを使用して、肝臓の中葉に付着している鎌状靭帯を切断します。綿棒を用いて肝臓の左葉を剥離し、5-0シルク縫合糸で緩い結び目を作り、左葉の周囲に配置します。結び目を左葉の血管柄にできるだけ近づけてから、締め付けます。次に、はさみを用いて結紮部位より遠位の葉を切除します。この際、結び目の滑脱とそれに伴う出血を防ぐため、小さな断端を残してください。同様の手法を用いて、肝臓の中葉の大部分を結紮および切除し、その後、外科用止血材（Surgicel）と綿棒による緩やかな圧迫を肝実質の切断面に沿って行い、完全に止血します。最後に、以降のセクションで説明するように、腫瘍断片または腫瘍細胞の肝内異種移植を行うか、あるいは脾臓注射による腫瘍細胞の肝内異種移植を行います。腫瘍断片を肝内に植え付ける場合は、まず10番のメスを用いて、肝表面に長さおよび深さ3 mmの切開を加えます。その後、直ちにsurgicelを適用し、切開部位に60〜90秒間軽く圧迫を加えて止血します。完全に止血されたら、微細ピンセットを用いて腫瘍断片を肝切開部に配置します。次に、切開部の上に少量のsurgicelを適用し、肝臓への直接注入による腫瘍細胞の肝移植を行います。腫瘍細胞懸濁液を満たしたインスリン注射針を露出した肝臓に刺入し、針先を穿刺部位から被膜下平面に沿って数mm進めます。シリンジの内容物をゆっくりと注入し、肝臓から針を抜きます。次に、穿刺部位にサージセルを配置し、綿棒で軽く圧迫して、腫瘍細胞懸濁液の漏出を防ぎ、脾臓への注入による肝内腫瘍細胞異種移植のための完全な止血を行います。マウスを右側臥位にし、鋭利なハサミを用いて左肋下を1 cm切開し、腹腔内にアプローチします。次に、綿棒を用いて胃を頭側から動物の右側へ押し除けます。微細な非外傷性ピンセットで周囲の脂肪組織を操作して脾臓を露出させ、脾臓を切開口へ出し、組織を安定させるために脾臓の背後に綿棒を配置します。ここで、5-0シルク縫合糸を用いて、脾臓の下極より上の位置に緩いプリティ結び（pretti knot）を作ります。腫瘍細胞懸濁液を満たしたインスリン用注射針を脾臓の下極に挿入し、緩く結んだ結び目の位置を越えて進めます。その後、注射器の内容物をゆっくりと注入し、針を脾臓から抜き、注入した細胞懸濁液が漏れないように結び目を締め付けます。最後に、脾臓を腹腔内に戻します。この画像では、腫瘍に対して補助療法を受けていないHCC患者からの肝切除標本が示されています。白い枠は、ゼノグラフト用に採取された周辺部の生存腫瘍領域を示しています。皮下ゼノグラフトの形成と成長は、レシピエントマウスを毎日観察することで容易にモニタリングできます。例えば、周囲の組織とは視覚的に明確に区別できるヒトHCC皮下異種移植片の典型的な外観と、それに対応する腫瘍の組織病理学的所見を示します。腫瘍の組織像では、核の異型性と高い核細胞質比を持つ肝細胞様細胞、門脈域の消失、および肝細胞索の厚みが増した歪んだ索状構造など、HCCの典型的な特徴が認められます。これらの画像では、腫瘍組織を肝臓に直接移植して得られた肝内ヒトHCC異種移植片と、腫瘍細胞を脾臓に注入して得られたものの典型的な外観を示しており、各画像内の黒い矢印は実質内腫瘍を示しています。肝内xenograftの辺縁を通るこの組織切片は、ヒトHCCの典型的特徴と、それに隣接する正常なマウス肝臓を示しています。表は、免疫不全マウスにヒト原発性肝細胞癌組織を移植した後に得られた腫瘍生着率をまとめたものです。各移植方法について先に示した異なる手法を用いた際、腫瘍生着率の分母は個別のヒトHCCサンプルを表しています。これらのデータは、ヒト原発性HCC組織において、皮下移植率は、脾臓内への腫瘍細胞注入または肝内への腫瘍断片移植によって得られる肝内定着率よりも低いこと、および部分肝切除が肝内定着を促進することが示唆されることを示しています。この処置を行う際は、滅菌操作を徹底し、完全に止血させることが重要です。生後6〜8週の小型の免疫不全マウスは感染症にかかりやすく、術後のわずかな出血であっても生存できない可能性があるためです。

generation-subcutaneous-intrahepatic-human-hepatocellular-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、ヒト化異種移植マウスモデルを生成するためのアッセイを実演しています。免疫不全マウスにシクロホスファミドを注射して免疫細胞の枯渇を引き起こします。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)とハイドロゲル中に混合した患者由来腫瘍細胞をマウスに皮下注射し、T細胞が浸潤した腫瘍を形成します。...

ヒトPBMC移植ヒト異種移植マウスモデルの生成技術

癌の転移拡散は、癌関連死の主要な原因です。私たちは、固形臓器腫瘍で転移のメカニズムを研究するための「患者様」同所同系マウスモデル系を確立するための私たちの生存の手術方法の詳細な説明を提供します。...

肝細胞癌転移の「患者様」同所同系マウスモデル

ここでは、未熟で拡張可能なヒト肝幹細胞の移植後にAlb-toxin receptor mediated cell...

ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

ノドの部分肝切除 (PHx) と脾臓を介して細胞移植を実行するためのプロトコルを説明しました。SCID (うなずく。CB17-Prkdcscid/J)...

うなずくにおける肝切除後肝脾内移植。SCID マウス

ここでは、ひと誘導多能性幹細胞由来肝細胞を用いた家族性高コレステロール血症のひと肝臓キメラマウス...

誘導多能性幹細胞由来肝細胞を用いた家族性高コレステロール血症ひと肝臓キメラマウス モデル

このプロトコルは、ヒト免疫系および肝細胞の両方を有するヒト化マウスを確立するための信頼性の高い方法を提供する。ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞の脾臓内注射を介して達成される二重再構成免疫不全マウスは、ヒト免疫不全ウイルス-1感染の影響を受けやすく、肝臓損傷を再キャパチレートするHIVに感染した患者...

HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立

ここでは、肝細胞癌(HCC)の典型的な免疫特徴を要約した肝癌の臨床的に関連するマウスモデルの開発について述べた。...

肝炎症と線維症の設定に起因する肝細胞癌の腫瘍性肝細胞誘発性オルコトピックマウスモデル

オルソトピックヒト肝転移性ブドウ球色黒色移植マウスモデルは、培養ヒトブドウ色腫細胞株を用いた患者由来腫瘍チャンクおよび針注射技術を用いた外科的オルトトピック移植技術を用いて作成された。...

免疫不全マウスにおける肝直交細胞性ヒトうveal黒色腫異種移植プラットフォームの生成

ここでは、肝動脈結紮の有無にかかわらず同所性肝細胞癌異種移植片を作成し、[18 F]フルオロミソニダゾール([18 F]FMISO)および[18...

肝細胞癌の同所性モデルマウスにおける非侵襲的PET/MRイメージング

患者の腫瘍から生成されたオルガノイドをマウスの肝臓に同所的に注入します。非腫瘍性肝組織の切除は、腫瘍が位置する肝臓組織に再生環境をもたらします。...

肝臓再生が腫瘍増殖に及ぼす影響を調査するための肝細胞癌患者由来オルガノイド異種移植モデル

学ぶ 免疫不全マウスへのヒト肝細胞癌異種移植片の皮下・肝内移植法。腫瘍断片や細胞懸濁液の調製、部分肝切除による移植成功率向上、腫瘍生物学と治療応答の研究に活用できます。

免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成

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