ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

この手順の全体的な目標は、結晶化スクリーニング実験から得られたタンパク質結晶の数と回折品質を向上させることです。これを行うために、目的の標的タンパク質を使用して確立された既存のタンパク質結晶化スクリーニング実験から結晶性または沈殿性材料を同定し、結晶性または沈殿性材料を回収し、次に結晶種ストックを生成するために使用されます。次に、目的の標的タンパク質と結晶シードの両方を含む一連の結晶化スクリーニングを確立します。

最後に、シードされた結晶化スクリーニングの結晶形成が監視され、新しいタンパク質結晶の特性評価が行われます。最終的に、この手順を適用すると、結晶化スクリーニング実験から得られるタンパク質結晶の数サイズと回折品質が増加する可能性があります。この手法の主な利点は、従来のマイクロ播種やマクロ播種などの既存の方法よりも、迅速に実行でき、拡張性が高く、他の播種方法よりも結晶化スペースが大幅に多いことです。

この技術のもう一つの利点は、種子ストックの生産に高品質の結晶性出発物質を使用する必要がないことです。一般に、この方法に不慣れな個人は、結晶の収集と操作のステップ中にかなりの程度の手先の器用さが必要になるため、苦労するでしょう。ランダムマトリックスマイクロシーディングが他のクリスタルシーディング方法から大幅に逸脱しているため、IFメソッドが重要であることを視覚的に示しています。

この方法の微妙な点が成功の鍵であり、これらの多くがテキスト形式で正確に伝えるのが困難です。この手順は、双眼顕微鏡または結晶イメージングシステムを使用して、座った結晶化トレイからのみ開始します。最初の1週間は毎日トレイを点検します。

その後、週に一度、クリスタルサイズをメモします。さらなる成長の証拠がなくなったらすぐに、結晶性材料を採取するトレイから1つ以上の適切なウェルを選択します。シードストックの生成には、細い針、スピアルライト、マイクロクリスタル、不規則で形成が不十分なクリスタルなど、あらゆる材料を使用できます。

古い材料は部分的に架橋されている可能性が高く、播種実験での使用には適していません。収穫の日には、炎症を起こしたパンを使用して、ガラス製の牧草地ピペットから丸みを帯びたプローブを作成します。これを行うには、ピペットを中央付近で柔らかくなるまで加熱します。

次に、すばやく炎から取り出し、端を引き離して引き出します。ガラスが約0.25ミリメートルのポイントで0.25ミリメートル未満に引き下げられることを目指します。ガラスを割って、壊れた端を炎に少し突っ込みます。

このプロセスを繰り返して、端に直径約0.75ミリメートルのガラスの半球が形成されます。シードビーズが入った1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを氷の上に置きます。次に、選択した晶析トレイを開きます。

まあ、24のよくぶら下がっているドロップトレイのために。ピンセットを使用して、カバースリップを取り外してください。次に、カバースリップを裏返して、安定した清潔な面に置きます。

96個のよく座っているドロップトレイ用。メスを使用して、選択したウェルの上部にあるプラスチック製の天井フィルムの周りを切り取り、次にピンセットを使用して天井フィルムの切除された部分を取り除きます。リザーバー溶液の50マイクロリットルを除去し、この液体をシードビーズを含むマイクロ遠心分離チューブに移し、チューブが氷上に留まるようにしますこの手順の最も困難な側面は、シードストックの調製です。

これは、説明されているとおりに正確に、できるだけ早く実行することが重要です。プローブで種子材料を完全に粉砕し、顕微鏡でサンプルを見ながらできるだけ多く回収するように注意してください。前に準備したガラスプローブを使用して、カバーの結晶を完全に粉砕します。

スリップドロップ。小さな結晶は、完全に粉砕するのに数分かかる場合があります。砕けやすい結晶は架橋されておらず、塩の結晶ではありません。

一方、塩の結晶は、押しつぶされたときに聞こえたり感じたりできる独特のカチッという音を発します。次に、シードビーズチューブから5マイクロリットルのリザーバー溶液を取り出し、同等のサブウェルに移して座り落とし実験を行うか、または収穫する結晶性物質を含む吊り下げ滴実験用のカバースリップに移します。この液体を5〜6回ピペットで上下させて、サブウェルをできるだけ多く再懸濁するか、スリップ内容物を覆います。

懸濁液をシードビーズチューブに戻し、この手順をさらに2回繰り返して、できるだけ多くの結晶性材料が収穫されるようにします。ボルテックス、シードビーズを2分間、30秒ごとに停止して氷上のチューブを冷却します。1.5では、リザーバー溶液を含むミリリットルチューブ。

希釈シリーズを作成して、各段階でリザーバー溶液中の種子ストックを4〜10倍に希釈してアーカイブします。種子、ストック、希釈液をすぐに使用しない場合は、10〜20マイクロリットルのアリコートを摂氏マイナス20度または摂氏マイナス80度の冷凍庫に入れて保管します。凍結すると、種子ストックは必要になるまで無期限に保持することができます。

RMMS結晶化スクリーニングは、吊り下げ式液滴蒸気拡散法を採用した24ウェルトレイ、またはシッティング液滴蒸気拡散法を用いた96ウェルトレイのいずれかを使用して行うことができます。24の井戸吊り下げ式ドロップトレイでMMSスクリーニングを行うには、ピペットを使用して、96条件の結晶化スクリーンから各条件の300マイクロリットルを10ミリリットルで手動で移します。4 24の各ウェルへのシングルチューブ形式。

各300マイクロリットルのリザーバーから十分にグリースを塗った結晶化トレイは、各結晶化条件の1マイクロリットルを、前面と背面の両方の保護バッキングストリップが1マイクロリットルに除去された対応するプラスチックカバースリップの表面に移します。カバースリップに、1マイクロリットルのタンパク質溶液を追加し、次に0.5マイクロリットルの結晶シードストックを追加します。RMMSの最初のラウンドでは、希釈したシードストック溶液を使用しないことが重要です。

種子の濃度が高いほど、より多くの結晶化ヒットが得られます。各カバースリップを反転させて、液滴が下を向き、適切な上になるようにします。カバースリップを下にしっかりと押し込み、天井のグリースを圧縮し、しっかりとシールします。

96滴がすべて確立されたら、トレイを摂氏4〜18度のインキュベーターまたは恒温室に移して保管します。96でMMSスクリーニングを行うには、ドロップトレイをしっかりと座らせます。結晶化ロボットまたは8チャンネルピペットを使用して、96条件の結晶化スクリーンから各条件の20〜50マイクロリットルを深井戸ブロック形式で結晶化トレイの各対応するウェルに移します。

次に、1.0マイクロリットルのタンパク質溶液、1.0マイクロリットルの結晶化条件、および0.5マイクロリットルの種子ストックを滴下に移します。トレイを透明な天井シートで密封し、摂氏4〜18度のインキュベーターに移すか、設置後5日間は24時間に1回、その後は双眼顕微鏡または結晶イメージングシステムを使用して最大4週間、実験用の恒温槽に移します。各サブウェルまたはカバースリップを順番に検査し、結晶形成の証拠を記録します。

MMSスクリーニング実験の結果と非EDスクリーニング実験の結果を比較し、違いがあれば記録してください。観察された複数のRMMSサイクルが必要になる場合があります。最適な回折品質の結晶が追加のサイクルのために生成される前に。

必要に応じてアーカイブされた希釈シードストックを使用して、ウェルあたりの結晶数を制御します。RMMS の有効性を実証する。スクリーニング法は、ヘナ、白色リゾチーム、およびウシ肝臓触媒の結晶化に、各タンパク質3 96条件に適用した。

結晶化スクリーンは、J-C-S-G-P-A-C-T、およびMorpheusを使用しました。その後、5日後、結晶性材料の成長をサポートすることがわかった各トレイから1つの条件を選択し、シードストックの生成に使用しました。5日後、結晶化トレイを検査し、結晶の滴数を記録しました。

この図は、この実験の結果をまとめたもので、鶏卵白リゾチームの定量分析を提供します。このタンパク質にRMMSを適用すると、非EDトレイと比較して結晶化成功率が4倍から10倍向上することが観察されました。特に、ウシ肝カタラーゼについては、RMMSの使用後に同定された55の条件と比較して、Morpheusスクリーニングの1つの条件のみが結晶を生成することがわかりました。

さらに、JCSGスクリーニングとPACTスクリーニングを使用したウシ肝臓缶の結晶化の成功率は、すべてのケースでそれぞれ3倍と2倍に増加し、使用した結晶化スクリーニングに関係なく、MMSスクリーニングは非RMMSスクリーニングよりも結晶の総数が有意に多かった。私たちのMMSはシンプルでありながら強力なアプローチであり、タンパク質結晶化スクリーニング実験の成功率を大幅に向上させることができると結論付けています。このビデオを見た後、結晶材料の特定と収穫から結晶種子ストックの調製、そして最後に、シード結晶化の確立まで、ランダムなマイクロシードマトリックススクリーニング実験を実行する方法をよく理解しているはずです。

この手法は1時間未満で実行できます。リキッドハンドリングロボットを使用して行われるランダムマトリックスマイクロシーディングスクリーニング実験の場合、または手作業で行われる実験の場合、約3時間で実行されます。この手順を試行する際は、保管前にすべてのシード結晶化スクリーンが十分に密封されていることを確認することが重要です。