Name: ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶランダムマイクロシードマトリックススクリーニング法によるタンパク質結晶化の成功率向上技術。結晶の数と回折品質を増加させ、構造生物学研究の効率化に貢献します。

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この作品は、BBSRC（BB/1006478/1）によって部分的に資金を供給された。 PRRは王立協会大学研究フェローシップ受賞。

1。戦略的な考慮事項<ol><li> microseeding実験のために使用するシード結晶の選択は、実験の目的に依存して変化する。プロジェクトの開始時に、結晶の最適化のための代替出発点を提供することができるいくつかの結晶化ヒットを見つけることは有用である。良好な品質の結晶が乱れ、すなわち以下または平衡システムに戻る核生成領域において、相図の準安定域で成長する可能性が高いため、リスク管理措置が大きく、結晶の最適化の必要性を低減する。そこで我々は、日常とすぐに最初の結晶が（とすぐに最初の結晶が成長を止めたように、より正確に、または）が得られるようにリスク管理措置を使用してお勧めします。 </li><li>リスク管理措置の最初のラウンドのため、シードストックは、可能な限り多くの結晶性の材料で作られるべきである。一つだけでなく、結晶が含まれて提供されていたり、結晶が小さい場合、それは、複数の繰り返しを設定するために役立つ可能性がある場合結晶の供給を増加させる（シーディングなし）オリジナ​​ルヒット。しかし、いくつかの異なるヒットが得られた場合、種結晶は、いくつかの条件から収集し、一緒に混合することができる。 </li><li>相分離を回避するために、高塩条件で成長した結晶は、高PEG条件において成長した結晶とは別個に収穫されるべきである。いくつかのウェルから結晶が混在している場合、塩の結晶を得にくくなるリザーバー溶液は、種子懸濁液のために選択されるべきである。例えば、リン酸塩、硫酸塩、カルシウムおよびマグネシウムの高濃度は避けるべきである。 </li><li>後でプロジェクト内には、回折を改善双晶を回避し、リガンドと結合するのに適した結晶を得るために、異なるユニットセルを有する結晶を探すために重要であり得る。この段階で（ 例えば最善を回折するもの）は、最も適した結晶は、種ストックを作るために使用されるべきである。 microseedingの時々繰り返さラウンドはここだけ &quot;最高の、必要とされる「結晶は、その後のラウンドのためのシードストックを作製するために使用される。可能な場合は、「例えばPEG 3000などの中性「沈殿剤は、新規な結晶接触を促進するために、高で不安定であり得る複合体を結晶化シード結晶を懸濁するために使用されるべき-塩溶液12。 </li><li>単結晶化条件が使用されている古典的なmicroseeding実験は、多くの場合、有望な状態のとその後の最適化中の識別以下の役に立ちます。これは、液滴当たりの結晶の所望の数を得るために、種ストックを希釈することがしばしば必要である。 （増加希釈のシードストックを一連の結晶化条件に追加される）「コンビナトリアル」microseeding実験は、シードストックの最適希釈を見つけるための迅速な方法である。このアプローチは、以下に説明する。 </li></ol> 2。シードストックの調製<ol><li>ブンゼン炎を用いたガラスパスツールピペットから丸みを帯びたガラスプローブを作る。 <ol><li>それが柔らかくなるまで中央付近ピペットを加熱し、その後すぐに炎からそれを削除して、端を離れて引っ張って、それを引き出す。ダウン0.25ミリメートル以下の直径にガラスを引っ張ることを目指しています。 </li><li>それは周りの0.25ミリメートルである点でガラスを割って簡単に炎に分割端を急落。 〜0.75ミリメートルの直径が端部に形成されたガラスの半球までこれを繰り返します。このプローブは、それが適切に0.01〜1.0ミリメートルスケールで固体物体に衝突するための大きさで、それを結晶化トレーサブウェルまたはカバースリップのプラスチック表面を損傷しないような結晶材料を粉砕するために有用である。結晶がガラスとプラスチックの間に閉じ込められているので、より大きなプローブ（〜1.0ミリメートル）がより効果的に小さな結晶を押しつぶすことがあります。 </li></ol></li><li>氷上のシードビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブを配置します。 </li><li>双眼顕微鏡又は結晶イメージングシステムを用いて事前に確立された結晶化トレイを検査し、一つ以上のAPを選択する種ストックを生成するための結晶材料を収穫する、そこからトレイから井戸をpropriate。どのような材料は、微細な針、球晶、微結晶と不規則な、不完全に形成された結晶を含むことができます。結晶が成長を止めた後に古い資料は、このように播種実験における使用のためのその適合性を低下させる、部分的に架橋されやすくなるようにシードストックは、できるだけ早くなされるべきである。疑義を回収する結晶性物質が塩またはタンパク質であるかどうかについて存在しない場合だけでなく、従来の開口にUV蛍光顕微鏡または撮像システムを用いて視覚化することができる、または結晶材料は、 その場 X線回折分析に供され得るトレイに。 UV照射下で蛍光を発する前者のタンパク質結晶を使用する場合、塩結晶は、無色に見えるであろう。 </li><li>うまく選択された結晶化トレイを開きます。 96ウェルを中心に、上側プラスチック封止シートを切断ドロップトレイを座ってするためのUSIでなく、選択しメスの刃ngの。 24ウェルハンギングドロップトレイ用ピンセットを使用してカバースリップを削除します。カバースリップを反転させ、安定したクリーンな面に置きます。リザーバー溶液50μlを取り外し、チューブを通して氷の上に残っていることを確実にシードビーズを含むマイクロ遠心チューブにこの液体を移す。 </li><li>徹底的に、顕微鏡下での結果を見て、セクション2.1で作製したガラスプローブを使用して、subwell（96ウェルトレイ）やカバーガラス（24穴トレイ）滴結晶をつぶす。小さな結晶を徹底的に鎮圧するのに数分かかることがあります。このステップは、彼らは塩の結晶ではないことも実験者は結晶がつぶすのは簡単であるため、架橋されていないことをチェックすることを可能にし、。塩の結晶は、聞いたこと、それらが破砕されたとき感じることができる独特のクリックを生成します。結晶は、新鮮な材料を入手し、使用しようと潰すのは難しいが困難である場合。 </li><li>シードビーズ管からリザーバー溶液5μlを取り外し、T同等のサブウェルに順伝達（ドロップ実験を行っ座って）、またはカバースリップ（落下実験をぶら下げ）収穫される結晶性物質を含む。可能な限り、サブウェルまたはカバースリップの内容をできるだけ多く再懸濁するためにこの液体を上下に5〜6回ピペット。シードビーズチューブにサスペンションを返し、さらに2回、この手順を繰り返して、できるだけ多くの結晶性物質は可能な限り収穫されることを保証する。 </li><li>氷上でチューブを冷却するために、30秒毎に停止する、2分間のシードビーズをボルテックスする。 </li><li>各段階で4から10倍にリザーバー溶液中の種ストックを希釈、希釈系列を作る。典型的には、あまりにも多くの結晶が希釈されていないシードストックを用いたときに得られたので、ウェルあたりの結晶の数を制御するために希釈された種子ストックを使用することができる。種子の濃度よりも大きい結晶化ヒットが得られるため、リスク管理措置の最初のラウンドでは、シードストック溶液を希釈しないことが重要である。 </li><li>それは直ちに使用しない場合ately、ストレージのためのCの冷凍庫-20℃にシードストック懸濁液と希釈種ストックを転送、または-80。少量ずつ、 すなわち 10〜20μlの中で、この物質を保管、シードストックの有効性を低下させるかもしれない、凍結融解の繰り返しを防止します。凍結したら、必要になるまで、種子ストックは、無期限に保持することができる。 </li></ol> 3。結晶化トレイの設置<ol><li>結晶化設備、実験者の好みの可用性に応じて、リスク管理措置結晶化スクリーニングは、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いたハンギングドロップ蒸気拡散法、または96ウェルトレイを用いた24ウェルトレーのいずれかを用いて行うことができる。リスク管理措置のための結晶化トレーは、ロボットディスペンサー液体処理、またはその2つの組み合わせを使用して、どちらの手によって確立することができる。 </li><li>手で設定され、典型的なリスク管理措置の実験は、タンパク質溶液、1.0μlの結晶化条件μL1.0を含むであろうし、0.5μLシードストック。結晶化ロボットを使用して設定典型的な実験では、0.3μlのタンパク質溶液、0.2μlの結晶化条件、および0.1μlの種ストックを含む。 </li><li> 24ウェルドロップトレイをぶら下げにリスク管理措置のスクリーニングを行うためには、まず、手動ピペットを用いて、4×24ウェルpregreased結晶の各ウェルに10ミリリットル単一チューブ形式で96ウェル条件晶画面から各条件を300μlを転送トレー。 <ol><li>前面と背面保護用バッキング·ストリップの両方が除去された、対応するプラスチックカバースリップの表面にそれぞれ300μLリザーバから各結晶化条件の転送1μL。 </li><li>各結晶化条件の1μlに結晶シードストックの0.5μLに続くタンパク質溶液1μlを加える。液体の滴が適切でなく、上記を下向きにし、位置になるように、各カバースリップを反転します。 </li><li>カバーガラス上で下方向に押して、sealiを圧縮グリースngの、安全なシールを形成する。一旦全て96滴が確立されて、トレイは通常、ストレージの範囲は4から18℃の中で、保育器や恒温室に転送する必要があります。 </li></ol></li><li> 96ウェルシッティングドロップトレイにリスク管理措置のスクリーニングを行うためには、まず、結晶化トレーの対応するウェルそれぞれに深いウェルブロックフォーマットの96ウェル条件晶画面から各条件の20から50μLを転送します。この転写工程は、8チャンネルピペットを用いて結晶化ロボット、または手動のいずれかにより転写を用いて行うことができる。 <ol><li>手または3.1に詳述されたボリュームを使用してロボットと滴の貯水池、タンパク質と種の原液を転送します。いくつかの市販結晶化ロボットがディスペンス接触しない、そのようなシステムを用いてシードストック転送を行うことにより分注チップの閉塞または関連する管類をもたらし得る。ディスペンシングの順序は可変である：いくつかのロボットが同時にすべてのソリューションを分注する。もしこれは不可能ですし、株式をシードし、貯水池、第一のタンパク質を分注する。 </li><li>ロボットを分配接触が鈍い針を装着し、低容量ガラス製注射器を用いて、種子利用でき、転送されていない場合。各ドロップに種ストックを分配リザーバー溶液を通過させることにより、針を洗浄します。 </li><li>透明封止シートを使用して、トレイを密封し、インキュベーターや保管のための恒温室に移す。 </li></ol></li></ol> 4。結晶化トレーの検査<ol><li>双眼顕微鏡や結晶イメージング·システムのいずれかを使用して、すべての結晶化実験を視覚化する。前者は一般的に、ビューの深さ以上のユーザーより詳細に制御し、後者よりも拡大率が得られるが、より多くの時間がかかります。 </li><li>シーケンス内の各sub-well/coverslipを検査し、結晶形成の証拠を記録します。実験は、設立後5日間に一度、24時間点検されるべきであるNその後に一度7日までの4週間。 </li><li>最適回折品質の結晶が生成される前に、リスク管理措置の複数のサイクルが頻繁に必要とされる。 </li></ol>

<ol><li>Bergfors, T. Protein Crystallization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+T+%22IUL+Biotechnology+Series%22">IUL Biotechnology Series</a>. , 2nd, (2009).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Priciples%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li>
<li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li>
<li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li>
<li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+Sect.+F.+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li>
<li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol+.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li>
<li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li>
<li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+Microseeding%3A+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li>
<li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li>
<li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+matrix+microseeding%3A+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li>
<li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme%3A+a+model+enzyme+in+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li>
<li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

本論文では、リスク管理措置のタンパク質結晶化スクリーニングのための一般的な方法を記載している。我々は、このメソッドを使用して、2つの試験タンパク質の結晶化の成功率の著しい増強を用いて実証した。リスク管理措置及び非リスク管理措置法を用いて作製した結晶のサブセットの放射光を用いた回折分析は、以前の著者らは良質の結晶がRMMS実験11で増殖する可能性が高いことを報告しているが、いずれの方法を用いて成長した結晶との間の回折品質にほとんど変化を明らかにした13。彼らは結晶化し、異常に容易であるためHEWL及びBLCは非定型な結果を与えている可能性があります。また、リスク管理措置実験で使用結晶シードストックの濃度を最適化することの重要性を示しており、これは、回折品質結晶の最適な数が生成されることを保証するために希釈することによって調整することができる方法を示す。 リスク管理措置は非常に単純な、高スループットである伝統的なスクリーニング方法を補完するために使用することができるスケーラブルな方法。実験は、96ウェルまたは24ウェルト...

ヘモグロビンやミオグロビンの構造を決定する上でペールツ、ケンドルーとその共同研究者によって、その最初の適用から、構造ゲノムコンソーシアムのパイプラインを自動化された現代的なハイスループットに、巨大分子のX線結晶学は私たちに、タンパク質の世界に前例のない構造的な姿を与えている。この技術では、原子、または原子レベルの分解能（ すなわち、1〜3Åの範囲）付近のタンパク質構造の直接的な可視化を可能にする最も広く適用できる実験方法のままである。タンパク質に適用されるX線回折の前提条件は、それが最初に結晶化されなければならないことであり、それは回折法1、2による構造決定における唯一最大の律速段階のままプロセスのこの段階である。タンパク質結晶化の過程の理解が大幅に進歩し、結晶化スクリーンの品質と可用性の大幅な改善にもかかわらず、トレイ、および関連技術は、確実に、結晶化の成功3の可能性を予測することは不可能のままである。生化学的および生物物理学的方法は、対象ディスプレイのタンパク質が結晶核生成と成長のための良好な特性、 すなわち、それがうまく折り、均質な単分散などであるかどうかを評価するために適用することができる、しかし、決して、これらの知見は、結晶化の決定的な予測を提供傾向。 播種は、既存の長い結晶または結晶性物質4-7の数、サイズ、及び品質を向上させるための実行可能な方法であることが主張されている。このアプローチは、結晶核形成を支持する状態が続く結晶成長およびその逆のために最適ではないかもしれないことを前提としている。別の状態から核物質を転送することによって、人はまだ未踏の結晶空間として、このように新たにアクセスを与え、効果的にこれらのプロセスを分離しようとする場合があり、その結果、スクリーニング実験の全体​​的な成功率を増加させる。確立された方法は、（i）マクロシーディング、別の8 1つの状態から、その全体が単結晶の転写、一般に、例えばした指向性圧力を加えることによって得られた（ii）のストリークシーディング、核物質の移動のために文書化されている猫の新しい結晶化ドロップ9を介してウィスカの後続の通過に続いて、既存の結晶の表面にウィスカ、および（iii）「古典的な」microseedingは、収穫することによって生成された結晶を「シード」の移動は、結晶（または結晶を砕いシード10をもたらしたものと同様の条件への材料）、。注目すべきことに、これらの方法の3つのすべては、確かに近代的な液体処理結晶化ロボットを用いて達成可能であるものと比較して、時間がかかり、不十分スケーラブルです。これらの要因は、その種子知覚に、少なくともいくつかのレベルで、貢献してきましたINGは他のアプローチが実を結ぶことができなかった場合にのみ訪問する方法である。 ランダム行列microseeding（リスク管理措置）は、ハイスループットスクリーニングとスケーラビリティ11月13日のものと伝統的なmicroseedingの利点を組み合わせた最新の方法論的革新です。このアプローチは、標準的な96の条件結晶化画面内の各sub-well/coverslip /上に分注しことが有核結晶質材料から製造シードストックの生成に依存している。この方法は、手動で、または24ウェルまたは96ウェルトレイ形式の液体取り扱いロボットを用いて、いずれかの確立されたドロップ蒸気拡散実験を、座ったりハングの両方に適用可能である。リスク管理措置が大幅に結晶化の成功率を高め、より大きな回折品質および量11、13、14の結晶を生成するために実験的に証明、およびoにおけるアプローチの結晶学者&#39;武器の中で革新的なツールを表すされている結晶化の成功に向けて努力をngoing。ここでは、リスク管理措置のための一般的な方法を説明し、この技術の有効性を示すサンプルデータを提供する。

<table><tbody><tr><td>MRC 96 well crystallization trays</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD11-00-100</td><td>非UV対応、ロボットClearViewシーリングシートによって確立されたスクリーン用</td></tr><tr><td></td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD6-01S</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>~95% 純度</td></tr><tr><td>ウシ肝臓カチラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>純度95%</td></tr><tr><td>キシラナーゼ</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR7-104</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatococcus daniellii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7630</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus thermoproteolyticus 六甲からのサーモリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1512</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus HT-96 スクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-40</td> ロボット PACT プレミア HT-96 <td>によって確立されたスクリーン用</td></tr><tr><td>スクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-36</td><td>ロボットによって確立されたスクリーン用</td></tr><tr><td>Morpheus HT-96 スクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-47</td><td>ロボットによって設立されたスクリーン用</td></tr><tr><td>Crystal Ph&#8211;nix液体処理システム</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>602-0001-10</td><td></td></tr><tr><td>Seed bead kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>双眼実体顕微鏡</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2646-100EA</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;lピペット</td><td>Starlab</td><td>S7100-0125</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 2-20 &mu;lピペット</td><td>Starlab</td><td>S7100-0221</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 100-1000 &mu;l ピペット</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-37</td><td>手作業で確立されたスクリーン用</td></tr><tr><td>PACT プレミアスクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-29</td><td>手で確立されたスクリーン用</td></tr><tr><td>Morpheus スクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>手作業で確立されたスクリーン用</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5415-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CrystalClene coverslips 18 mm</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD4-17</td><td></td></tr><tr><td>2 ml ガラス パスツールピペット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z722669</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>24 well XRL crystallization tray</td><td>Molecular Dimensions Limited</td><td>MD3-11</td><td>手</td></tr><tr><td>作業で確立されたスクリーン用30% (w/v) PEG 8000、0.2 M 硫酸アンモニウム、0.1 M カコジル酸ナトリウム pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 8000、0.2 M 酢酸マグネシウム、0.1 M カコジル酸ナトリウム pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 6000、100 mM クエン酸 pH 5.0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ランダムmicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

ランダムmicroseedマトリックススクリーニング（リスク管理措置）は、種結晶をランダム画面に付加されたタンパク質結晶化技術である。結晶は、タンパク質の相図の準安定域で成長し、余分な結晶化リードがしばしば得られる可能性を増加させることにより、製造された結晶の品質を向上させることができ、データ収集および浸漬実験のために、結晶の十分な供給が提供される。ここでは、手または96ウェルまたは24ウェルトレイ形式で、液体ハンドリングロボットを用いてのいずれか確立シッティングドロップまたはハンギングドロップ蒸気拡散実験のいずれかに適用することができるリスク管理措置のための一般的な方法を記載している。

RMMS実験の（A）実施例リスク管理措置のスクリーニングの有効性を実証するために、我々はニワトリ卵白リゾチーム（HEWL）およびウシ肝臓カタラーゼ（BLC）の結晶化にこの方法を適用する。これらの酵素は極めて結晶性であり、構造的によくターゲット15,16の両方を特徴とする。このような両方のリスク管理措置で達成可能な強化された結晶化の成功率を説明するために、優れた被検者に提供したよう。結晶化実験は96ウェルの液体処理ロボット工学を使用して、ドロップトレイフォーマットを座って設立された。 HEWLとBLCの溶液は、それぞれ100ミリグラム/ mlおよび20 mg / mlの最終濃度を20mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、pH7.5の中の各々の凍結乾燥粉末を溶解することによって製造した。各タンパク質の3の96の条件結晶化スクリーンが使用された。JCSG、PACTとモーフィアス。 microseedingずに結晶化スクリーニングは、リザーバ50μLのボリューム、2μLを用いて行ったタンパク質溶液とリザーバー溶液の1μLの1μLを含有するシッティングドロップ。 6枚...

ここでは、ランダムmicroseedマトリックススクリーニングのための一般的方法を記載する。この技術は、有意に、タンパク質結晶化スクリーニング実験の成功率を高める最適化の必要性を低減し、データ収集およびリガンド浸漬実験の結晶の安定供給を提供することが示されている。

ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

この手順の全体的な目的は、結晶化スクリーニング実験で得られたタンパク質結晶の数と回折品質を向上させることです。そのために、まず目的の標的タンパク質を用いて確立された既存のタンパク質結晶化スクリーニング実験から、結晶または沈殿物を特定します。次に、その結晶または沈殿物を回収し、結晶シードストックを作成します。続いて、標的タンパク質と結晶シードの両方を含む一連の結晶化スクリーニングを確立します。最後に、シード添加後の結晶化スクリーニングを監視して結晶の形成を確認し、得られた新規タンパク質結晶の特性を評価します。最終的に、この手順を適用することで、結晶化スクリーニング実験から得られるタンパク質結晶の数、サイズ、および回折品質を向上させることができます。従来のマイクロシーディングやマクロシーディングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、迅速に実施でき、拡張性が高く、他のシーディング法よりも大幅に多くの結晶化条件を探索できる点にあります。この手法のもう一つの利点は、シードストックの作製に高品質な単結晶の出発物質を必要としないことです。一般的に、この手法に不慣れな人は、結晶の回収および操作のステップにおいて高度な手先の器用さが求められるため、習得に苦労します。ランダムマトリックスマイクロシーディングは他の結晶シーディング法とは大きく異なるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。この手法の細かな点は成功の鍵となりますが、その多くを文章だけで正確に伝えることは困難です。この手順は、必ず双眼顕微鏡または結晶イメージングシステムを用いて、結晶が沈殿した結晶化トレイがある状態で開始してください。最初の1週間は、毎日トレイを点検してください。その後は週に1回、結晶の大きさを記録します。さらなる成長が見られなくなった時点で、結晶物質を回収するためにトレイから1つまたは複数の適切なウェルを選択します。シードストックの作成には、微細な針状結晶、螺旋状の結晶、微結晶、および不規則で形状の不十分な結晶を含む、あらゆる物質を使用できます。古い材料は部分的に架橋している可能性が高く、播種実験への使用には適していません。回収日に、ブンゼンバーナーを用いてガラスパステールピペットから丸みを帯びたプローブを作成します。そのためには、ピペットの中央付近を柔らかくなるまで加熱してください。その後、すぐに火から離し、両端を引っ張って引き伸ばします。約0.25 mmの箇所で、直径が0.25 mm未満になるまで引き伸ばすようにしてください。ガラスを切り離し、折れた端を短時間火の中に浸します。ガラスの末端に直径約 0.75 mm の半球形が形成されるまで、この操作を繰り返します。シードビーズを入れた 1.5 mL マイクロ遠心チューブを氷上に置きます。次に、選択した結晶化トレイを開けます。24ウェル・ハンギングドロップトレイを使用します。ピンセットを用いてカバーガラスを取り出します。次に、カバーガラスを反転させ、安定した清潔な平面の上に置きます。96ウェル用シッティングドロップトレイを使用します。メスを用いて、選択したウェルの上部にあるプラスチック製シーリングフィルムの周囲を切り取り、切除したフィルムの一部をピンセットで取り除きます。リザーバー溶液を50 µL分取り出し、シードビーズの入ったマイクロ遠心チューブに移します。この際、チューブを常に氷上に保持してください。本手順において最も困難な点は、シードストックの調製です。この操作は、記述通りに正確かつ可能な限り迅速に行うことが重要です。顕微鏡でサンプルを確認しながら、プローブで種結晶材料を十分に砕き、可能な限り多く回収するように注意してください。あらかじめ用意したガラスプローブを使用して、カバー上の結晶を十分に砕いてください。スリップを滴下します。小さな結晶を完全に砕くのに数分かかる場合があります。砕きやすい結晶は架橋されておらず、塩の結晶ではありません。塩結晶を砕くと、特有のクリック音が聞こえ、また感触として感知されます。次に、シードビーズチューブからリザーバー溶液を5 µL分取り出し、シッティングドロップ法の場合は対応するサブウェルへ、ハンギングドロップ法の場合は回収対象の結晶材料を含むカバーガラスへ移します。この液体をピペッティングで5〜6回上下させ、サブウェルまたはカバーガラスの内容物を可能な限り再懸濁させます。懸濁液をシードビーズチューブに戻し、この手順をさらに2回繰り返し、可能な限り多くの結晶物質を回収します。シードビーズを2分間ボルテックスし、30秒ごとに停止してチューブを氷上で冷却します。リザーバー溶液を含む1.5 mLチューブに用意します。シードストックをリザーバー溶液で、各段階において4倍から10倍に希釈し、希釈系列を作成します。シードストックおよび希釈液をすぐに使用しない場合は、10から20 µLずつ分注し、-20 °Cまたは-80 °Cのフリーザーで保存してください。凍結後は、必要になるまでシードストックを無期限に保存することが可能です。RMMSの結晶化スクリーニングは、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いた24ウェルトレイ、またはシッティングドロップ蒸気拡散法を用いた96ウェルトレイのいずれかを使用して実施できます。24ウェルハンギングドロップトレイでMMSスクリーニングを行うには、10 mLのシングルチューブ形式で提供される96条件の結晶化スクリーニングから、各条件を300 µLずつピペットで4枚の24ウェルトレイの各ウェルに手動で分注します。あらかじめグリスを塗布した結晶化トレイの各300 µLリザーバーから、対応するプラスチックカバースリップの表面に、各結晶化条件の溶液を1 µLずつ分注します。カバースリップは、前後両方の保護バッキングストリップを剥がした状態で使用してください。カバースリップ上に、タンパク質溶液を1 µL加え、次に結晶シードストックを0.5 µL加えます。RMMSの第1ラウンドでは、希釈したシードストック溶液を使用しないことが重要です。種子の濃度が高ければ高いほど、より多くの結晶ヒットが得られます。各カバーガラスを、液滴が下を向くように反転させ、適切なウェルの上に配置します。カバーガラスを下に押し付け、シーリンググリースを圧縮して、確実な密閉状態を作ります。96個のドロップがすべて作成されたら、トレイを4〜18°Cのインキュベーターまたは恒温室に移して保存します。96ウェルの座りドロップトレイを用いてMMSスクリーニングを行うには、結晶化ロボットまたは8チャンネルピペットを使用し、ディープウェルブロック形式の96条件結晶化スクリーンの各条件から20〜50 µLを、結晶化トレイの対応する各ウェルに分注します。次に、1.0 µLのタンパク質溶液、1.0 µLの結晶化条件溶液、および0.5 µLのシードストックをドロップに分注します。透明なシーリングシートでトレイを密閉し、4～18 °Cのインキュベーターまたは恒温室に移します。保存した試料は、設置後5日間は24時間ごとに1回、その後は最大4週間まで7日ごとに1回、実体顕微鏡または結晶イメージングシステムを用いて観察してください。各サブウェルまたはカバーグラスを順に検査し、結晶形成の証拠を記録します。我々のMMSスクリーニング実験の結果を非EDスクリーニングの結果と比較し、相違点を記録します。最適な回折品質の結晶が追加サイクルで得られるまで、RMMSの複数サイクルの実施が必要となる場合があります。ウェルあたりの結晶数を制御するため、必要に応じて保存済みの希釈シードストックを使用してください。RMMSの有効性を実証するため、ヘナ、白色リゾチーム、およびウシ肝臓カタラーゼの結晶化に対して、各タンパク質につき3つの96条件のスクリーニング法を適用しました。結晶化スクリーニングには、J-C-S-G-P-A-C-TおよびMorpheusが使用されました。その後5日後、各トレイから結晶物質の成長が認められた単一の条件を選択し、シードストックの調製に使用しました。5日後、結晶化トレイを点検し、結晶が形成されたドロップの数を記録しました。この図は本実験の結果をまとめ、ニワトリ卵白リゾライムの定量的な解析を示しています。このタンパク質にRMMSを適用したところ、非EDトレイと比較して結晶化成功率が4倍から10倍に向上することが観察されました。特筆すべき点として、ウシ肝カタラーゼでは、Morpheusスクリーンで結晶が得られたのはわずか1条件であったのに対し、RMMSの使用後は55条件が特定されました。さらに、すべてのケースにおいて、JCSGおよびPACTスクリーンを用いたウシ肝臓カナゼの結晶化成功率は、それぞれ3倍および2倍に増加しました。また、使用した結晶化スクリーンに関わらず、本MMSスクリーニングは非RMMSスクリーニングよりも有意に多くの総結晶数を得ることができました。以上のことから、本MMSは簡便ながら強力なアプローチであり、タンパク質結晶化スクリーニング実験の成功率を大幅に向上させ得ると結論付けられます。このビデオを視聴することで、結晶材料の同定と回収から結晶シードストックの調製、そして最終的なシード添加結晶化の確立に至るまで、ランダム・マイクロシード・マトリックス・スクリーニング実験の実施方法について十分に理解できるはずです。この手法は、リキッドハンドリングロボットを用いてランダムマトリクス・マイクロシーディング・スクリーニング実験を行う場合は1時間未満で、手作業で実験を行う場合は約3時間で完了できます。この手順を実施する際は、シーディングしたすべての結晶化スクリーンを保存前にしっかりと密封することが重要です。

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Biology

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学ぶランダムマイクロシードマトリックススクリーニング法によるタンパク質結晶化の成功率向上技術。結晶の数と回折品質を増加させ、構造生物学研究の効率化に貢献します。

ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

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