Name: ハニービーモデルの老化、減速し加速し、逆に試験片を得た (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-29T16:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶミツバチ労働蜂の老化動態における社会的役割の影響。看護蜂と採餌蜂の比較により、細胞老化が社会的行動によって減速・逆転可能であることを示す。行動生物学と神経科学の研究に有用である。

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私たちは、撮影時の有益な助言と支援のためのオスマンKaftanogluに感謝します。私たちは、洞察に満ちたコメントを匿名の査読に感謝したいと思います。この作品は、ノルウェーの研究評議会（180504、191699、および213976を付与）、マリーCurie/FP7（プロジェクトREF。238665）、エージング（助成NIAのP01のAG22500）の国民の協会、およびピュー慈善信託がサポートされていました。

1。暦年齢から老化をデカップリングこのセクションでは、同じ暦年齢（「未婚年齢集団」）と、巣のミツバチのコホートを共有する識別された個人の集団で構成され、二重コホートコロニーのセットアップについて説明します。未婚年齢コホートの同じ高齢者は、最終的には別の高齢化ダイナミクスと異なる労働者のタイプに分離する - これらは加速機能低下で減速し、飼料収穫ミツバチと看護婦の蜂です。すべての手順は、1実験コロニーに記載されている。我々は、コロニーの効果が（二反復設計）のために制御することができるように複製する少なくとも二つのコロニーのための実験を​​行ったが、助言する。 <ol><li> ダブルコホートコロニーハイブボックスの準備：1、通常のハイブ蜂蜜を2食品の櫛を受けボックス、花粉と他の食品くし、および2の空の櫛を準備します。 3,000人以上と交配女王だけでなく、ドナー植民地を見つけることを確認してください巣のミツバチ。どちらも、（1.3）後で紹介します。 </li><li> 同じような生活年齢を持つ個人の入手方法およびマーキング：出現しようとしている密封されたひなに櫛を収集します。 1複製のために3,000〜5,000キャップひなのセルの合計で櫛を集めることを期待しています。それぞれについて、母親の遺伝子型（ハイブ起源）の歪んだ分布を回避するために、少なくとも三つの異なるハイブ源からひなのバランスのとれた量を使用して複製します。 <ol><li> 60〜70パーセントの相対湿度を34℃に設定したインキュベーター内ひな櫛を配置します。新興ひなを免れることはできないような方法で櫛を保管してください。 </li><li>ミツバチが2日間出てみようと胸郭（ 例えばユニPOSCA、三菱鉛筆株式会社）に小さなペンキタグでこれらのミツバチをマーク。ペンキマークは未婚年齢コホート（出現の日）のミツバチを特定できるようになり、その他の複製コロニーと区別するために。 </li></ol></li><li> 私のコホートが含まれて二重コホートコロニーをセットアップdentified、未婚年齢の蜂：日に若いミツバチがマークされているが、参照してください（（。議論ではセクション1と比較されたい）、そして前に準備したハイブボックスにこれらのマークされていないミツバチを追加ドナーコロニーからの約2,500〜3,000巣のミツバチを集めるステップ1.1）。後者の人々は、正体不明の巣のハチのコホートを構成する。 <ol><li>最初は女王ケージ（市販品）に限定される女王を追加します。働き蜂がゆっくりと女王を解放するために食用キャンディー（ 例えば Apifonda、SüdzuckerAG、マンハイム/オクセンフルト、ドイツ）でケージを封印。 </li><li>未婚年齢集団を構成する新規に登場し、マークされたミツバチを追加します。これらのハチは、マークされた個人であり、以下のすべてのステップのためのフォーカスグループである。 </li></ol></li><li> 発症を採餌し、飼料収穫機のマーキングモニタリング：発症と未婚年齢コホートにおける看護師への飼料収穫機の移行動態を評価するために、採餌活動eの人口統計開発を監視各コロニーのために非常に先日。コロニーが設立された後の5日間（ 図1）のカウントを開始する。 <ol><li>一定時間で3×20分間の観察期間内の航空券（入場カウント）採餌から戻っハチの総数をカウントします。 （説明を参照）配向便の期間中にハチをカウントしないようにしてください。 </li><li>入場数は（&gt; 100入学カウント/日）を開始するために、かなりの採餌活動を示している場合には、飼料収穫機のマーキングを開始。そのためには、未婚年齢コホート（シングルマーク個人）の飼料収穫機は、最初の採餌便から復帰後第ペンキマークを受ける。この塗料マークは発症を採餌の日を指定し、後で各飼料収穫のための採餌年齢を識別することができます。 </li><li>ミツバチ十分な数のマークが付けられているまで毎日マーキングを繰り返します。これらのハチは、典型的には14日後に、熟成させた後にマーク飼料収穫の十分な数を推定するため、これ以上の5〜10％以上の回収率を期待する採餌。 </li></ol></li><li> サンプリング：すべての最初にマークされたミツバチが、同様の暦年齢を持っているので飼料収穫機が≥14日間採食しているときには、看護師や古い飼料収穫の年齢をマッチさせたグループは、同時に収集することができます。 <ol><li>単一のマークされた看護婦の蜂が巣箱内に収集され、看護行動（オープンひな細胞に置く頭と幼虫の摂食とクリーニング）によって識別されます。 </li><li>毎日の採餌活動が始まる前に、二重マーク飼料収穫もハイブ内で収集されます。 </li><li>十分な換気を提供するケージ（チューブ、箱）でミツバチを収集し、さらなる処理まで暗く保つ。代わりに、トランスクリプトーム、エピジェネティックやプロテオミクス研究のために、直接液体窒素中で凍結ミツバチスナップ。すべてのテストグループから個人のバランスの取れた数値を収集し、コロニーを複製する。 </li></ol></li></ol> 2。ハイブの人口統計の変更によって遅く加齢に伴って労働者に迅速な労働者の逆転&lt;/ pの&gt; このセクションが遅く、加齢に伴う労働者に促進老化（飼料収穫機）（看護師蜂）との労働者からの反転が行われている方法について説明します。飼料収穫機は、通常のひなのケアに携わる看護師のミツバチの不足が発生した場合、このような行動の逆転は、誘導される。復帰の手順は、単一のコロニーを分離する2つのじんましんに複製：看護師の蜂画分（「看護師由来」）、および飼料収穫機画分（「飼料収穫由来」）を持つ別の1と1ハイブを。成功した反転後、プラスチックの可能性症状と高齢化が反転すると元に戻り、労働者、継続的な飼料収穫、継続的な看護師の蜂や新入飼料収穫機で未婚年齢コホートで研究することができる。以前のように、一つの年齢層ではなく、正体不明の巣のミツバチの集団の識別されたハチは、実験的なフォーカスグループを構成している。 <ol><li> 準備：看護師とのじんましん（シングルマーク）と飼料収穫機（ダブルマーク）を複製、前のセクションで説明したように利用できるようになります。復帰が完了した後に十分な取得を確実にするために複製コロニーあたり500未満とマーク飼料収穫機での復帰を開始しないようにしてください。 <ol><li>反転後のテストグループを安全に識別のためには、元のハイブ全体飼料収穫機の人口は、復帰前にオフにマークされていることが重要です。以下の手順は、1つのレプリケートに記載されている。 </li><li>復帰前日に、飼料収穫機由来のハイブの1の追加のハイブボックス（ステップ1.1参照）を準備します。クイーン、ドナーハイブから2ひな櫛の位置を確認します。実験コロニーへの転送前に、これらのとさかからすべての大人のハチを離れて磨く。一ケージ女王（ステップ1.3を参照）、1ひなコームは、オリジナルハイブボックスに女王とひな櫛に置き換えられます。女王とひなコムの他のセットは、新しいハイブボックスの次の日に使用されます。両方、オリジナルと新しいハイブがいることを確認することをお勧めしますための新しいひな櫛とエイリアンクイーンの同じような配分に分離飼料収穫機や看護師Sも同様に経験がハイブ合図（「ハイブ臭い」）を変更します。 </li></ol></li><li> 復帰：午前中だけ復帰する前に、飼料収穫機由来の割合を受け取る新しいボックスにケージ女王とひなコムを追加します。ピーク採餌時間が開始されるまで待ちます。そして、少なくとも100メートル離れて元の位置からマークされた飼料収穫機や看護師の蜂、元植民地を移動します。 <ol><li>元の場所に、ひなのみ女王と飼料収穫由来ハイブの新しいボックスを設定します。 </li><li>飼料収穫機は脱臼オリジナルハイブボックスをオンのままにし、元の場所に戻って向かいます。飼料収穫機は巣のミツバチからの飼料収穫機の人口の分離を完了するために、次へを達成するために2時間を元の場所に戻ることができます。 </li><li>その後、分離を終了するために、オリジナルの、今 &quot;看護師由来の「ハイブを閉鎖し、少なくとも3キロ離れて養蜂場に移す。 </li></ol></li><li> 成功社会的タスクのハイブの保守お ​​よび監視反転：健康、オープンひなのために定期的に実験的なじんましんを確認してください。 <ol><li>コロニー操作後の最初の日の間に潜在的な病原体の負荷を軽減するために、無人、死んだひなを交換してください。 </li><li>コームを交換したとき、または復帰実験が完了したときに飼料収穫由来ハイブ内で成功し逆転を検証するには、（ 図2）、再びこれらを導入する前にひなの櫛の写真を撮る、と。以前に上限なしのひなと、オープン、ライブひなとの領域は飼料収穫由来コロニーでの看護活動の信頼性の高いマーカーである。 </li></ol></li><li> サンプリング：社会的な反転に伴う生理学的効果は3-8日飼料収穫機や看護後に検出することができる分離した。 <ol><li>我々は、すべての試験群、 すなわち逆戻り労働者と継続的な飼料収穫機（飼料収穫由来ハイブ）だけでなく、逆転が開始された8日後の継続看護師や、新たに採用さ飼料収穫機（看護師由来ハイブ）をサンプリング助言。 </li><li>コルステップ1.5で説明したようにセレクトサンプル。 </li></ol></li></ol> 3。リポフスチンの定量化によって労働者タイプ特異的細胞老化のパターンを分析するリポフスチンは、細胞老化の普遍的なバイオマーカーである。真性累積生成物として、リポフスチンの特異的自己蛍光（発光最大 = 530から650 nm）を18検出のために使用することができる。 <ol><li> 切開および固定：動かまで氷上チルミツバチが、削除して、所望の組織標本を解剖する。 <ol><li> 4℃で一晩のインキュベーションのために、固定液中（pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水、PBS中4％パラホルムアルデヒド）を転送する</li><li> PBS中のサンプル3回洗浄します。 </li></ol></li><li> 組織処理および取付け：振動刃ミクロトーム、 例えばライカバーモント1000S（ライカバイオシステムズ、ボック、ドイツ）を使用して、例えば、それ以上40μm以下の厚さのセクションに組織サンプルをカットします。 <ol><li&gt;クリアリングのために、30％のグリセロール（PBS）中で一晩組織切片をインキュベートし、50％グリセロール（PBS）中の別の2時間。 </li><li> 50％グリセロール（PBS）に、顕微鏡スライド上のセクションをマウントします。長期保存のためのシールカバーはマニキュアでスリップ。 </li></ol></li><li> 像取得：リポフスチンに検出するために、私たちはλ= 514、561nm又は励起ための同様のレーザラインを与えるレーザー走査焦点顕微鏡で使用することをお勧めし、検出器の帯域幅は570から650程度に設定して。 <ol><li>リポフスチンのよりよい識別のために、第二のチャネルが含まれ、より短い波長のスペクトル（励起= 405nmで、発光= 410から450ナノメートル）での同時スキャンを実行する。より長い波長チャネルの両方、リポフスチン顆粒を明らかにするだけでなく、自家蛍光による気管および他の非グラニュラ構造への非特異的な「バックグラウンド」であろう。第二の、より短い波長チャネルは非特異的自己蛍光を明らかにではなく、リポフスチンう。このように、リポフスチン識別は設備などが可能<html>いずれか一方だけがリポフスチン特定の蛍光を顆粒を明らかにして、両方のチャネルの信号を比較することでtated。 </li><li>高解像度の画像を取得するために40Xの倍率以上、1.25以上、好ましくは開口数を有する対物レンズを使用する。スキャン画像は、約100×100×10〜3の寸法のスタック。すべての個々の組織サンプルは、複数の画像スタックによって表されなければならない。 </li><li>技術的変動に起因する個体内および個体間のばらつきを低減するために、常にレーザパワーと検出器の感度を一定に保つ。 </li><li>日日々の技術的な変化によって偏りを減らすために、いくつかのスキャンの各セッションのすべてのテストグループの等しいサンプル数をスキャンします。 </li></ol></li><li>画像処理：顕微鏡画像スタックの高度な処理を可能モジュールとソフトウェアパッケージを使用して、例えばImageJの（健康、ベセスダ、メリーランド州、米国の米国の国立研究所、gej.nih.gov / ijは/ &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/）。 <ol><li> 3次元画像スタックのそれぞれについて最大2D投影を生成する。 </li><li>高周波ノイズを減衰させる、及びリポフスチン顆粒の寸法を有する構造を維持するために、適度なカーネルサイズを有するガウスフィルタを適用する。 </li><li>リポフスチンの識別を容易にするために、両方の色チャネルをマージする（ステップ3.2参照）。 </li></ol></li><li> 画像分析：定量化の手順を実行して、被験者がテストグループIDに盲目になることを確認してください。 <ol><li>全ての画像について、まず、関連する構造をカバーし、他の画像からのROIと同様の寸法を有し、関心領域（ROI）を選択します。 </li><li>その後、各ROIを表すリポフスチン顆粒の希望する番号を選択します。 ROI内のリポフスチン顆粒を選択する場合は、次の規則の適用は、主観的なバイアスを減らすことができます。 <ol><li>最初granuを選択するための一貫性のある場所を選択ル。これは、例えば、ROIの最左端とすることができ、縁部に最も近い顆粒は、常に最初の選択であろう。 </li><li>続々は、顆粒は前の選択（次の隣）に最も近いものが選択される。 </li><li>次の隣を選択する際に、唯一の前の選択から右の検索たとえば、一方向のみに移動する。この規則は、選択が高密度に充填された顆粒の時折のクラスタによって支配されることを防ぐことができます。 </li><li>選択が完了すると、それぞれの顆粒領域を概説し、測定することにより、各リポフスチン粒子の大きさを評価する。別のテストグループの個人を比較するために、適切な統計的検定を使用してください。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Munch, D., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curious+case+of+aging+plasticity+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The curious case of aging plasticity in honey bees.</a> FEBS Lett. 584, 2496-2503 (2010).</li>
<li>Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negligible+senescence+in+the+longest+living+rodent%2C+the+naked+mole-rat%3A+insights+from+a+successfully+aging+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Negligible senescence in the longest living rodent, the naked mole-rat: insights from a successfully aging species.</a> J Comp Physiol B. 178, 439-445 (2008).</li>
<li>Parker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+social+insects+telling+us+about+aging%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Myrmecological+News%22%5BJournal%5D)">What are social insects telling us about aging?</a> Myrmecological News. 13, 103-110 (2010).</li>
<li>Seeley, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeeley%2C+TD+%22The+Wisdom+of+the+Hive%22">The Wisdom of the Hive</a>. , Harvard University Press. (1995).</li>
<li>Amdam, G. V., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulatory+anatomy+of+honeybee+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The regulatory anatomy of honeybee lifespan.</a> J Theor Biol. 216, 209-228 (2002).</li>
<li>Amdam, G. V., Norberg, K., Hagen, A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+exploitation+of+vitellogenin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Social exploitation of vitellogenin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 1799-1802 (2003).</li>
<li>Guidugli, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+regulates+hormonal+dynamics+in+the+worker+caste+of+a+eusocial+insect%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect.</a> FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).</li>
<li>Amdam, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+reversal+of+immunosenescence+in+honey+bee+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Social reversal of immunosenescence in honey bee workers.</a> Exp Gerontol. 40, 939-947 (2005).</li>
<li>Seehuus, S. C., Norberg, K., Gimsa, U., Krekling, T., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+protein+protects+functionally+sterile+honey+bee+workers+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reproductive protein protects functionally sterile honey bee workers from oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 962-967 (2006).</li>
<li>Scheiner, R., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tactile+learning+is+related+to+social+role+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Impaired tactile learning is related to social role in honeybees.</a> J Exp Biol. 212, 994-1002 (2009).</li>
<li>Behrends, A., Scheiner, R., Baker, N., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+aging+is+linked+to+social+role+in+honey+bees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Cognitive aging is linked to social role in honey bees (Apis mellifera.</a> Exp Gerontol. 42, 1146-1153 (2007).</li>
<li>Münch, D., Baker, N., Kreibich, C. D., Braten, A. T., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+laboratory+and+during+free-flight%3A+old+honey+bees+reveal+learning+and+extinction+deficits+that+mirror+mammalian+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In the laboratory and during free-flight: old honey bees reveal learning and extinction deficits that mirror mammalian functional decline.</a> PLoS One. 5, e13504(2010).</li>
<li>Vance, J. T., Williams, J. B., Elekonich, M. M., Roberts, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+age+and+behavioral+development+on+honey+bee+%28Apis+mellifera%29+flight+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The effects of age and behavioral development on honey bee (Apis mellifera) flight performance.</a> J Exp Biol. 212, 2604-2611 (2009).</li>
<li>Dukas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+rates+of+honey+bees+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Soc%22%5BJournal%5D)">Mortality rates of honey bees in the wild.</a> Insect Soc. 55, (2008).</li>
<li>Behrends, A., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+at+old+age%3A+a+study+on+winter+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning at old age: a study on winter bees.</a> Front Behav Neurosci. 4, 15(2010).</li>
<li>Huang, Z. -Y., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honeybee+colony+integration%3A+Worker-worker+interactions+mediate+hormonally+regulated+plasticity+in+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Honeybee colony integration: Worker-worker interactions mediate hormonally regulated plasticity in division of labor.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 11726-11729 (1992).</li>
<li>Huang, Z. Y., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+honey+bee+division+of+labor+by+colony+age+demography%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology+and+Sociobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of honey bee division of labor by colony age demography.</a> Behavioral Ecology and Sociobiology. 39, 147-158 (1996).</li>
<li>Double, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparative+biology+of+neuromelanin+and+lipofuscin+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The comparative biology of neuromelanin and lipofuscin in the human brain.</a> Cell Mol Life Sci. 65, 1669-1682 (2008).</li>
<li>Fonseca, D. B., Brancato, C. L., Prior, A. E., Shelton, P. M., Sheehy, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+rates+reflect+accumulating+brain+damage+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Death rates reflect accumulating brain damage in arthropods.</a> Proc Biol Sci. 272, 1941-1947 (2005).</li>
<li>Baker, N., Wolschin, F., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+learning+deficits+can+be+reversible+in+honeybees+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Age-related learning deficits can be reversible in honeybees Apis mellifera.</a> Exp Gerontol. 47, 764-772 (2012).</li>
<li>Capaldi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+orientation+flight+in+the+honeybee+revealed+by+harmonic+radar%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of orientation flight in the honeybee revealed by harmonic radar.</a> Nature. 403, 537-540 (2000).</li>
<li>Marco Antonio, D. S., Guidugli-Lazzarini, K. R., do Nascimento, A. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+silencing+of+vitellogenin+gene+function+turns+honeybee+%28Apis+mellifera%29+workers+into+extremely+precocious+foragers%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated silencing of vitellogenin gene function turns honeybee (Apis mellifera) workers into extremely precocious foragers.</a> Naturwissenschaften. 95, 953-961 (2008).</li>
<li>Whitfield, C. W., Cziko, A. -M., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+in+the+brain+predict+behavior+in+individual+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees.</a> Science. 302, 296-299 (2003).</li>
<li>Schmidt, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attraction+of+reproductive+honey+bee+swarms+to+artificial+nests+by+Nasonov+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Attraction of reproductive honey bee swarms to artificial nests by Nasonov pheromone.</a> Journal of Chemical Ecology. 20, 1053-1056 (1994).</li>
<li>De Moraes, R., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+cell+death+in+the+hypopharyngeal+gland+of+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Internat%22%5BJournal%5D)">Modes of cell death in the hypopharyngeal gland of the honey bee (Apis mellifera L).</a> Cell Biol Internat. 24, 737-743 (2000).</li>
<li>Sheehy, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow-cytometric+method+for+quantification+of+neurolipofuscin+and+comparison+with+existing+histological+and+biochemical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gerontol+Geriatr%22%5BJournal%5D)">A flow-cytometric method for quantification of neurolipofuscin and comparison with existing histological and biochemical approaches.</a> Arch Gerontol Geriatr. 34, 233-248 (2002).</li>
<li>Hsieh, Y. S., Hsu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honeybee+trophocytes+and+fat+cells+as+target+cells+for+cellular+senescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Honeybee trophocytes and fat cells as target cells for cellular senescence studies.</a> Exp Gerontol. 46, 233-240 (2011).</li>
<li>Wolschin, F., Munch, D., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+proteomic+analyses+reveal+regional+brain+differences+during+honeybee+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and proteomic analyses reveal regional brain differences during honeybee aging.</a> J Exp Biol. 212, 4027-4032 (2009).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここでは、前述の8,16,17,19,20に近づく採用し、ミツバチに柔軟な老化を研究容易にする単一のワークフローに統合する。我々の目的は、関連するサンプル材料を得るために標準化された設定ツールを使用してこのフィールドの初心者である科学者を提供し、異なる研究チーム間の実験的再現性を改善することである。私たちの手順が簡略化されており、それ以前の説明（実施例8についての比較）のように特別な装置を必要としませんが、念のため、いくつかの対策が推奨され、以下に収集されます。 暦年齢から老化を切り離す。A最も重要な側面は、採餌行動の最初の確認（マーキング2 回目 ）の間に飼料収穫ミツバチの誤識別を回避することである。そのため、飼料収穫機を監視し（「入学カウント」）またはマークする場合には、厳密にオリエンテーション便との日常の期間を避けます。これらの期間の間に多くの事前フォーラムパトンのステージ蜂は逸脱したりハイブを入力します。これらのハチは、成熟した飼料収穫機の代表的な生理学的特性を表示しますが、容易に識別円形...

高度に社会的な動物の複雑なコロニーの構造は、生殖カーストとの相互作用によって維持されており、様々な社会的なタスクの動作と、典型的には、非再生労働者のヘルパーカースト。別の労働者では、特定の生理学的適応は、個別のSIBケア行動を可能にし、また極端な寿命の違いにリンクされています。ミツバチとモルラットは社会性の加速、無視できるか、1〜3老化逆転のパターンにリンクされているか調べるために最善の発達した動物モデルを表しています。 ミツバチコロニーでは、単一の産卵女王は、食品用のひな、飼料の傾向が数千人の労働者によって支援され、ガード、体温調節や衛生的な行動4に従事。これらの労働者の中で最も長い寿命と非常に短寿命の飼料収穫機、中間体と看護師の蜂、冬（diutinus）蜂です。個人は、しかし、恒久的にWO、あるにバインドされていませんrker型が、柔軟性のある行動個体発生を表示する：彼らは（「時間カースト」）を別の社会的なタスクの動作から変更してください。キャロウミツバチは、最終的には外部の採餌に変更されることがあり、看護師蜂を、傾向ひなに変更することができます。しかし、キャロウの巣のミツバチも最長寿命の冬のハチに変身することができ、かつ短命の飼料収穫機であっても、通常より長い寿命の看護師に戻すことができます。極端な（冬の蜂）と中間体（看護師の蜂）の寿命を持つ労働者が豊富なリソースとよく発達した食料生産および貯蔵器官を持っている- （1,5に概説されている）、短命飼料収穫機とは対照的である。しかし、個々の寿命の調節は、個々のリソースバランスの簡単な変更を超えていることは、ゼリーの生産6、ホルモン制御7、免疫などの非再生ワーカーカーストに多様な適応機能を備えてい卵黄タンパク質、研究によって示唆されている8および抗酸化防御9。 Fパターン労働者の間で、嗅覚のために確立され、また他の脳や運動機能のためunctional下落（老化）、ミラーの寿命格差10月13日 。長寿命の冬の蜂15で検出可能な減少（無視できる老化）の欠如とは対照的に、具体的には、採餌のわずか2週間後の学習機能の大幅な減少は、飼料収穫機14で同様の死亡率の進行と一致します。 柔軟な老化の分子指紋を識別するために、我々は8,16,17のエージングタイプの遷移を監視し、操作を可能に確立された実験パラダイムに適応。暦年齢と高齢化に関する作業員型特異的社会的行動の影響を分離することができるサンプルの入手方法1の詳細を実験する。実験2が遅く老化ダイナミクスと看護婦の蜂へと加速した飼料収穫機の逆転を説明しています。実験3はanatomicaによる細胞老化の影響をプロービングするためのアプローチを提供しています細胞の老化（リポフスチン）18のための確立されたバイオマーカーのL定量化。

<table><tbody><tr><td>アピフォンダ</td><td>S&#252;dzucker AG、マンハイム/オクセンフルト、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>メルク</td><td>1.04094.1000</td><td></td></tr></tbody></table>

ハニービーモデルの老化、減速し加速し、逆に試験片を得た

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

高度に社会的な動物の社会は密接に関連し、個人間の広大な寿命の違いを備えています。社会性昆虫の中では、ミツバチが寿命や老化における可塑性が社会的要因によって説明される方法を研究するための最良の確立されたモデルです。 ミツバチの労働者階級は、蜜や花粉を集めるひなを傾向がある看護師蜂、および飼料収穫機蜂が含まれています。以前の研究は、脳機能と飛行性能は看護師に比​​べて飼料収穫機でより急速に老化することを示している。飼料収穫機が看護業務に戻すしかし、脳機能は、回復することができます。加速され、逆に機能的な老化のようなパターンは、タンパク質存在量の変化に免疫機能に、変更された代謝資源のレベルにリンクされています。ビテロゲニン、ホルモン制御および細胞防御における適応機能を備えた卵黄タンパク質は、労働者に別の高齢化のダイナミクスを制御し、ネットワーク内の主要な調節要素として機能することができる。ここでは、看護師や飼料収穫機の出現を監視し、かつ長寿命の看護師に、通常短命の飼料収穫機からの逆転を含め、操作する方法について説明します。当社の代表的な結果は、同様の暦年齢と個人は実験条件の下で飼料収穫機や看護師の蜂に分化する方法を示しています。我々は戻って看護師への飼料収穫機からの行動の逆転を検証する方法を例示している。最終我々は、細胞老化は、リポフスチンの蓄積は、老化の普遍的バイオマーカーを測定することによって評価することができる異なる方法を示している。 社会的な影響をリンクすることができるメカニズムを研究し、可塑性をエージングのために、このプロトコルは、関連するサンプル材料を取得するように設定され標準化されたツールを提供し、将来の研究の間のデータ比較可能性を改善する。

試験群は加速し、減速し、単一の年齢層を有するコロニーの老化を逆の属性を研究するために得ることができるどのようなプロトコルのセクション1と2に詳細。我々は（ 図1、セクション1と比較されたい）6コロニーについて飼料収穫機のカウント（「入学カウント」）を評価し、正常な個体発生に伴う労働者タイプの分化を監視します。グラフは、個人が10日以上経過した前に、飼料収穫機状態に看護師からかなりの変化が典型的に観察されないことを示している。飼料収穫機数の著しい変動が異なるコロニーのうち採食開始のタイミングに関しては観察し、各コロニー内でマークされた日々の変動の通りであった。別にこのような異なるひな負荷などのコロニー特定人口統計学的要因から、多くの変動性は、気象条件（ 図1の赤でマークされた時点）を変えることによって説明される。採餌ダイナミクスの綿密なモニタリングは、したがって、DURマーキングと収集の努力を最適化することをお勧めします実験ING。 バック看護タスクへの採餌と逆に個体発生（第2）飼料収穫由来コロニー（ステップ2.2お...

ミツバチの労働者では、高齢化が社会的行動ではなく生活年齢に依存します。ここでは、非常に異なる加齢パターンを持つ労働者のタイプが取得され、細胞の老化を分析する方法を示しています。

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

本実験の全体的な目的は、急速な老化が抑制および逆転したメカニズムを持つミツバチの働き蜂の型を得ることです。これにより、老化の研究が可能になります。これはまず、同年齢の新生蜂でコロニーを構成し、老化を暦年齢から切り離すことで達成されます。これらのミツバキは、同じ暦年齢であっても、最終的に育児か採餌という異なる社会的役割を担います。育児蜂は、採餌蜂のより急速な老化と比較して、老化が遅延することを示します。次に、採餌から育児へと老化のダイナミクスを逆転させます。まず、外勤蜂を保育蜂から分離させます。その後、保育蜂が不足した環境に置かれた外勤蜂は、再び保育作業を行う個体へと戻ります。戻った働き蜂、通常の外勤蜂、および保育蜂の間で細胞老化の症状を比較することにより、結果を得ます。この手法は、加齢に伴う機能低下の抑制にどのようなメカニズムが寄与しているかなど、老化研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手順の大きな利点は、特別な装置を必要としないことです。したがって、これらの方法を用いて実験を再現することは容易であるはずです。いくつかの手順の実演は、アリゾナ州立大学のミツバチ研究室でプロジェクトマネージャーを務めるOsman Craftが行います。このセクションでは、タグ付けされたミツバチの年齢一致コホートと、ランダムな巣内ミツバチのコホートからなる2コホートコロニーのセットアップについて説明します。タグ付けされたミツバチは、老化のダイナミクスが異なる保育蜂または採餌蜂のいずれかに分かれます。実験は、このようなコロニーを2つ以上用いて行う必要があります。まず、蜂蜜が入った2枚の貯蜜巣板、花粉が入った1枚の貯粉巣板、および2枚の空巣板を入れた通常の巣箱を準備します。次に、交尾済みの女王蜂と、3000匹以上の働き蜂がいるドナーコロニーを確保します。続いて、羽化直前の封蓋幼虫がある巣板を回収します。1つのコロニーにつき、3000から5000個の封蓋細胞が必要です。母系遺伝子型の分布の偏りを避けるため、これらの巣房は少なくとも3つの巣群から収集する必要があります。次に、収集した育児巣房を34 °C、相対湿度60～70%でインキュベートします。ミツバチが羽化するまで2日間待ち、羽化した幼虫が逃げ出さないように巣房を保管してください。次に、単一の年齢コホートの蜂を識別し、他の反復コロニーと区別するために、羽化した蜂の胸部に小さなペイントタグで印を付けます。若い蜂に印を付けた当日に、ドナーコロニーから2,503,000匹の巣内蜂を採取し、これらの未標識の蜂を準備したハイブボックスに加えます。次に、食用キャンディーで封印したケージに入った女王蜂を加えます。丈夫な成虫の働き蜂が、ゆっくりと女王蜂を放出します。最後に、 newly emerged marked bees（標識を付けた新羽化蜂）を加えます。本研究の目的は、保育蜂から採餌蜂への転換の開始およびダイナミクスを評価することである。各コロニーについて、採餌活動の人口統計学的発達を1日おきにモニタリングする。コロニー設置の5日後からカウントを開始する。モニタリングは、巣門での計数により、採餌飛行から戻るミツバチの総数を数えることで行います。これは、決められた時間に20分間の計測を3回実施して行います。方向認識飛行が行われている時間帯には、ミツバチを数えないでください。1日あたりの出入り数が100匹を超えた時点で飛行を開始します。採餌蜂へのマーキングを開始してください。蜂を捕まえやすくするため、飛行から戻ってきたマーキング済みの蜂をソフトピンセットで1匹ずつ回収します。着地後、フォームまたはメッシュを用いて巣門を狭くします。次に、日付を特定するための2回目の塗装標識を付けます。これにより、後で採餌活動開始年齢を算定することが可能になります。日ごとに異なる色または色の組み合わせを使用して、ミツバチに標識を付けてください。研究にどれくらいの数のミツバチにマーキングが必要かを検討する際は、マーキングした採餌蜂の5～10%が回収できると見込んでください。少なくとも2週間の採餌活動の後、マーキングした保育蜂と採餌蜂を同時に回収し、巣からマーキングした保育蜂を回収します。これらの蜂は、開いた育児室に頭を入れて幼虫への給餌や清掃を行っています。また、二重マーキングした採餌蜂も回収してください。すべての試験群および反復コロニーから、同数の個体を回収します。ミツバチを換気可能なケージに移し、さらなる処理を行うまで暗所で保持します。分子生物学的研究を行う場合は、回収したミツバチを速やかに液体窒素で急凍結させてください。この手順では、1つのコロニーを2つの巣箱に分離し、一方に看護蜂（B分画）、もう一方に採餌蜂の分画を配置します。これには、前節で準備した、少なくとも500匹の標識済み採餌蜂を保持し、かつ採餌蜂集団全体に標識を施した巣箱が必要です。復帰の前日に、前述の方法で2つ目の新しい巣箱を準備してください。次に、ドナー巣箱から育児圏の巣板を2枚採取します。選択した巣板から成蜂をすべて刷毛で取り除きます。また、ドナー巣箱の女王蜂を2匹（1匹はキャンディー封印ケージに入れ、もう1匹は育児圏の巣板と共に）採取します。元の巣箱内の女王蜂と育児盤を交換します。翌日には、別の女王蜂と育児盤をもう一方の巣箱に使用します。これは、後に保育蜂由来のコロニーと採餌蜂由来のコロニーの両方に、新しい巣の匂いを提供するための対照実験です。転換日の午前中に、新しい育児巣房の状態を撮影します。次に、キャンディで封印されたケージに入った新しい女王蜂1匹と、育児巣房1枚を新しい巣箱に加えます。その日の採餌のピーク時間帯に、標識を付けた外勤蜂と保育蜂を含む元のコロニーを、元の場所から少なくとも100m離れた場所へ移動させ、その後、元の場所に戻します。採餌蜂由来の分蜂用に新しい巣箱を設置します。採餌蜂が元の場所に帰還するまで2時間待ちます。これにより、採餌蜂の集団を巣内蜂からほぼ完全に分離させることができます。分離を終了させるには、元の巣箱を密閉し、少なくとも3 km離れた養蜂場へ移動させます。実験用の巣箱を定期的に確認し、健康な開いた育児圏があるかを確認してください。最初の数日間は、潜在的な病原体負荷を軽減するため、世話をされていない死んだ幼虫を、以前に蓋がされていた幼虫や生きている開いた幼虫に置き換えます。これらは、反転操作の開始から8日後の採餌蜂由来のコロニーにおける、育児活動の信頼できる指標となります。前述の方法を用いて、サンプルとしての回帰ワーカー、継続的な採餌蜂、および継続的な育児蜂をサンプリングします。実験終了後、導入した巣房を再度撮影し、通常の採餌蜂数と並行して起こるワーカータイプの分化をモニタリングしました。6つのコロニーについて評価を行った結果、10日後に採餌活性の著しい上昇が観察されました。赤色のタイムポイントで示されるいくつかの変動は、気象条件の変化によるものです。採餌タスクから保育タスクへの ontogeny の逆転は、採餌蜂由来のコロニーに導入した育児巣を検査することで検証されました。上図は、導入前の巣です。以下は、導入から8日後の同じコムである。新しく育児が行われた健康な幼虫のパッチや、育児細胞周囲の花粉貯蔵量の増加は、以前の採餌蜂が典型的な巣作りおよび育児タスクを正常に遂行したことを示している。細胞老化の高度に保存された徴候であるリポフスチンの蓄積を、年齢を一致させた育児蜂および採餌蜂の様々な蜂組織において評価した。17日間の採餌により、リポフスチン顆粒のサイズが有意に増加しました。このリポフスチンの蓄積および顆粒サイズの明確な増加は、Dの矢印で示されているように、長期の採餌期間に関連していました。これらの手順を行う際は、ワーカーのタイプを直接的に特定することが極めて重要です。例えば、方向飛行を行う日中や、採餌前の段階にあるハチのマーキングを中止することで、採餌蜂の誤認を避けてください。ミツバチの巣への出入りは、当研究室の手順に従って行います。柔軟な老化の分子的な特徴を特定するために、プロテオミクスやトランスクリプトミクスなどの他の手法を用いることも可能です。

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、薬物の全身アプリケーションによってミツバチの食欲の嗅覚コンディショニングのパラダイム（セイヨウミツバチ）の行動薬理学のメソッドを実装する方法を示します。...

ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

このプロトコルでは、我々は同時に、ミツバチの二つの遺伝子（二重遺伝子ノックダウン）を抑制の2つの戦略について説明します。その後私たちはミツバチ味覚知覚に二重遺伝子ノックダウンの効果を研究するために口先拡張応答（PER）アッセイを使用する方法を提示します。...

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

ミツバチ(Apis mellifera)のために開発されたテング拡張応答(PER)条件付けプロトコルは、多くの昆虫種における学習のいくつかの異なるメカニズムを研究するための生態学的に関連性があり、容易に定量化可能な手段を提供します。...

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

役割に関連する労働者の生理機能を解析するための便利なツール - ここでは、単一コホートミツバチコロニーの製造のための私達の詳細なプロトコルを記述します。また、労働者の行動および/または生理の調節におけるこれらのホルモンの関与を評価するために、幼若ホルモンおよびエクジソンで労働者を治療するための詳細なプロトコルを記述します。...

シングルコホートコロニーと労働者ミツバチのホルモン治療の準備は役割および/または内分泌系との生理学関連を分析します

ここで我々が提示 個々ミツバチと蜂の巣コロニーの両方に農薬汚染された食物を供給するための方法。手順は、基本的な幼虫の食事のとも蜂の巣コロニーの自然条件にin vivoで供給することにより、個々のミツバチへの農薬の影響を評価します。...

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

開花植物の殺菌剤散布が孤独な蜂花粉媒介殺菌剤残留物の高濃度にあります。生体外で実験室の実験を使用して-飼育ハチの幼虫、この研究調査ホストと非ホストの植物由来殺菌剤処理した花粉を消費のインタラクティブな効果。...

体外孤独な蜂の飼育: 幼虫の危険因子を評価するためのツール

ここでは、成人ミツバチの脳におけるタンパク質の産生を減らして抗体特異性をテストするためにCRISPR-Cas9システムを使用するプロトコルです。...

CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部における抗RDLおよび抗mGlutR1受容体抗体検査

ここでは、ミツバチの蛹を除去する方法を含む大量のミツバチ非エンベロープウイルス粒子を伝播、抽出、精製、定量すること、および2番目の2つのプロトコルについて説明します。...

ミツバチの経口感染のためのウイルス富化接種剤の調製(Apis mellifera)

このプロトコルは、ミツバチの女王とその労働者の世話人を制御された実験室で農薬に暴露し、関連する応答を注意深く監視する方法を確立することによって、農薬がミツバチ(Apis mellifera)の再生にどのような影響を与えるかの理解を深めるために開発されました。...

交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価

免疫組織化学的方法は、成虫のミツバチの中腸および下咽頭腺におけるアポトーシスおよび壊死のレベルを検出および評価するためのミツバチの研究において有用である。...

ミツバチ組織における組織学の基礎と細胞死検出

野外で採集したミツバチを安全に取り扱うための試験方法を実演します。この方法により、迅速な操作、同定、遺伝的サンプリング、およびサンプリング中に収集された花粉を介した植物と昆虫の相互作用の確認が可能になります。このアプローチは、簡単に適応でき、希少な昆虫群を研究するための費用対効果の高い非致死的な手段を提供します。...

野外でミツバチを閉じ込めて安全に扱うための迅速な方法

学ぶミツバチ労働蜂の老化動態における社会的役割の影響。看護蜂と採餌蜂の比較により、細胞老化が社会的行動によって減速・逆転可能であることを示す。行動生物学と神経科学の研究に有用である。

ハニービーモデルの老化、減速し加速し、逆に試験片を得た

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