Name: 誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶシナプス小胞リサイクルの可視化法。スチリルFM色素を用いて誘発・自発的活動中の神経終末におけるシナプス小胞動態をイメージングし、神経伝達機構の理解に貢献する実験プロトコルを解説します。

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著者らは、この作業の実行中有用な議論のために原田研究室のメンバーに感謝。この作品は、米国心臓協会、ジストニア医学研究財団、エドワード·マリンクロット·ジュニア財団、全米科学財団、およびNCHのホワイトホール財団からの補助金によって賄われていた

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

私たちは誘発、自発的な、ミニチュアシナプス活動に応答してシナプス小胞を染色し、脱色用、および脱色段階中の画像化のためのプロトコルを記載している。既存のプロトコルに加えて、我々は小型のシナプス活性に基づいて、FM脱色を観察する新しいプロトコルを含んでいた。これらのプロトコルを使用して、我々は以前に運動障害、ジストニアのモデルマウスから培養ニューロンにおける異常を同定した。野生型マウスにおけるそれらの対応物と比較して、これらのニューロンは、高活性20で刺激したときのCa 2 +依存的にシナプス小胞エキソサイトーシスを促進さ受けた。神経伝達物質の放出19のパッチクランプ電気生理学的記録により確認されたものニューロンはまた、より頻繁に小型のシナプス活性を示した。 このような分析でのFM染料を使用するためのプロトコルの重要な側面は、ASSEにあるSSと光退色を最小限に抑えます。光退色に起因する変化はシナプス活性によって引き起こされるものと比較して小さい場合FM蛍光強度の微...

シナプス小胞の機能は、シナプス伝達の重要な決定因子である。彼らは、シナプス前細胞質膜（エキソサイトーシス）と融合すると、これらの小胞は、神経伝達物質を放出し、それらは、細胞膜（エンドサイトーシス）から再生し、神経伝達物質がリロードされた後にリリースの別のサイクルのための準備が。のダイナミクスとシナプス小胞のリサイクルのメカニズムの研究が大幅にスチリルのFM染料1を導入することによって加速されています。積極的に親水性の頭部基と疎水性尾部を充電しているこれらの両親媒性分子は、（ 図1A、図1BにFM1-43の立体像における複数の色素）は、可逆的にそれらを透過することなく、脂質膜を出入りすることができます。 FM色素のグループは、彼らが発する光の範囲に影響を与える類似の特徴を共有しています。例えば、FM2-10、FM1-43、FM1-84は、2つの環状化合物との間の証つの二重結合を有するW緑色発光。両者の違いは、その疎水性を決定し、従って、膜からの出口速度が（departitioning）疎水性尾部の長さである。 FM5-95およびFM4-64の場合では、3つの二重結合は、環式化合物をリンクし、それらは、赤色発光を示す。これらの染料は、それらの親水性の部分に関して異なる。それらは親水性環境に疎水性環境の相対量子収率の増加により、生体膜に挿入されるときに、すべてのFM色素は、蛍光強度が増加する。従ってFM強度の変化は、膜ターンオーバーの変化を表す。異なる色（発光スペクトル）と疎水性は、FMは、シナプス小胞のリサイクリングにおける多目的な研究ツールを染色します。 シナプス小胞のリサイクル（ 図2）を分析する際に、これらの特徴に基づいて、FM色素は、主に以下のスキームに従って使用される。ニューロンsが、それらがエンドサイトーシス（染色）を介して形成するように、シナプス小胞（のSV）中に取り込まれることを可能にする、FM色素を含有する細胞外溶液に浸されている。染料は、その後、色素のない細胞外溶液を適用することにより洗浄されるが、これはすなわちだけ積極的に受けているエンドサイトーシスは、色素（ 図2下）がロードされ、シナプス小胞のクラスターが含まれています機能性神経終末を、明らかにしている。その後のエキソサイトーシスは、細胞外空間に、FM色素の損失と蛍光の付随する損失につながる（脱色;により親水性環境へのdepartitioning離れエキソサイトーシスのサイトからの拡散の両方に）。そのためのFM蛍光強度の変化は、シナプス小胞のエキソサイトーシスとの指標である。 FM色素は様々な生物および製剤2,3におけるシナプス小胞を染色し、脱色するために使用されている。例としては、哺乳動物のneurを含める文化4-9、哺乳類の脳スライス10,11、神経筋接合部12,13、網膜双極ニューロン14,15、および蝸牛16の有毛細胞onal。 通常、このような実験で、染色や脱色の両方を広範囲にニューロン（誘発活性）を刺激することにより誘発される。外部刺激（自発的な、ミニチュアシナプス活性）9,17-19がない場合にリサイクルを持っているとして、最近、しかし、弱い刺激に応答してシナプス小胞のリサイクルも、分析されている。自発的かつ小型のシナプス活動は、活動電位の自然発火（ 図3）を含む前者で、外部刺激の非存在下で発生するものとして定義される。これらの弱いシナプス活動は、広範囲の刺激によって誘発比べFM信号における小さな変化に関連している。測定は、FMの変化ことを必要とfluorescリファレンスの強さを正確にシナプス小胞エキソサイトーシスまたはエンドサイトーシスが、強度の人為的ではない変化を反映する。アーティファクトの原因の一つは、FM色素による細胞膜の非特異的染色の存在である。この成分の漸進的なウォッシュアウトが誤ってシナプスの活動に起因する測定された蛍​​光強度の緩やかな変化につながる。この因子は、（プロトコルを参照）適切な方法によって低減することができる。アーティファクトの最も顕著な原因は、シナプス小胞の内部に保持FM色素の光退色である。 FMの強度の光退色に関連した変化が測定される生物学（シナプス）の変化と比較して小さくなければならない。 例えば、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラ感度カメラの最近の開発は、露光時間を短縮し、フルオロフォアを励起するために使用される光の強度を弱めることにより、光退色を最小限にすることが可能となる。アーティファクトのもう一つの原因は、ドリフトIですN光学顕微鏡の焦点のレベル。イメージングセッションの間に焦点ドリフトは、機械的または熱的効果によって引き起こされることができ、誤って測定された蛍​​光強度の変化につながる。 ここで我々はそれが可能で、特に、小型のシナプス活性、微弱または無刺激の文脈においてシナプス小胞のリサイクルを分析するためにFM色素を使用することを可能にするプロトコルおよび装置を記載している。我々は、培養した齧歯類海馬ニューロンを用いて、誘発された自発的シナプス事象中の小胞の染色および脱色の例を示しており、脱色相を撮像する。我々はまた、シナプスの活動へのFM色素の損失がない場合には、FM色素の光退色の程度を評価する方法を示します。

<table><tbody><tr><td>パルス発生器</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;分離型刺激装置&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ディジティマー</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>Eclipse TS100</td><td>これは低倍率での細胞形態の評価に使用される。</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>Eclipse TiE</td><td>これは高解像度の蛍光および透過光イメージングに使用され、フォーカスのドリフトが最小限に抑えられます。</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ニコン</td><td></td><td>水没レンズが推奨される。油没レンズも使用可能であるが、カバースライス表面から観察対象の構造が深い場合には除く&lt;i&gt;例．&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>フィルターキューブ</td><td>ニコン</td><td>77032509</td><td>490/20-nm励起、510-nmデュアルクロスロングパス、520-nm-LP蛍光発光（FM1-43）</td></tr><tr><td>フィルターキューブ</td><td>ニコン</td><td>77032809</td><td>490/420 nm 励起、510 nm ダイクロイックミラー、650 nm LP 蛍光（FM4-64用）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td><td>アンドル テクノロジー</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>このEMCCDカメラは、蛍光の高感度検出に使用される。</td></tr><tr><td>液体循環式冷却装置</td><td>固体状態冷却システム</td><td>オアシス160</td><td>これは、カメラを冷たい水で連続灌流して温度を-に維持するために使用される80&amp;deg;C、 thereby ノイズを低減する。</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-カスタムインターフェース</td><td>490 nm</td><td>この光源は、蛍光励起の迅速なオン／オフ制御に使用される。</td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>アンドル テクノロジー</td><td>ソリス</td><td></td></tr><tr><td>イメージングチャンバー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>高速灌流システム</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>注意：有毒な試薬です。取り扱いに注意してください。</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>インビトロゲン</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>アルデヒド固定性FM1-43（FM1-43FX）</td><td>インビトロジェン</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>インビトロゲン</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>アルデヒド固定性FM4-64（FM4-64FX）</td><td>インビトロジェン</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス&amp;rsquo; 平衡塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地</td><td>インビトロゲン</td><td>51200-038</td><td>この溶液には蛍光イメージングを妨害するフェノールレッドが含まれていません。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>注意：有毒試薬。取り扱いに注意すること。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、fm色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

機能的な神経終末におけるシナプス小胞は、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスを受ける。このシナプス小胞の再利用を効果的に、膜ターンオーバーを明らかにするスチリルFM色素を用いて分析することができる。 FM色素の使用のための従来のプロトコルは、刺激（誘発）次のニューロンシナプス活性を分析するために設計した。最近では、プロトコルは、このような自発的またはミニチュアシナプスイベントなどの弱いシナプス活動を、同行のFM信号を分析するために利用可能となっている。 FM信号のこれらの小さな変化の分析は、撮像​​システムは、強度の小さな変化を検出するのに十分な感度でありながら大振幅の人為的変化が抑制されることを必要とする。ここでは、誘発するために適用することができるプロトコルで、自発的な、そしてミニチュアシナプスの活動を説明し、一例として、培養海馬ニューロンを使用しています。これは重要なので、このプロトコルは、FM色素の光退色率を評価する手段が組み込まれて成果物のソース強度の小さな変化を画像化する。

一例として、我々は、シナプス小胞の脱染色の時間経過（ 図4）のための代表的な結果を示す。培養海馬ニューロンは自発的シナプス活性（ステップ2.3）を使用して、FM4-64で染色し、染料を含まない溶液（溶液2すすぎ）で洗浄した。イメージングは、自発的な活動（ステップ5.3）、（連続線の最初の部分、 図4A）を使用して、初期の脱色時間経過を示す。これは、120秒毎（ステップ5.1）、10 Hzの電場刺激で誘発された活動の3つのラウンドを用いて脱色時間経過が続く。誘発脱色の量を測定する一つの方法は、小胞のリサイクル計プールのサイズに対応して両端矢印（Δfmの誘発 ）で示されている。 最初の刺激が与えられた前に、（ 図4Bに拡大）のFM強度が徐々に減少した。この減少は、脱染色で構成されていた自発シナプス活動へ（ΔfmのSPONT）と光退色（ΔfmのPB）。光退色の寄与が小さい場合には、preimagingベースライン（Δfmの...

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、海馬ニューロン培養における前シナプス小胞の放出速度を測定するために赤色蛍光色素FM...

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

FM色素は、シナプスのダイナミクスの理解に非常に貴重な助けとなった。...

スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員（SV）のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。...

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

このビデオは、チャネルロドプシンを発現するショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でのシナプス小胞のリサイクルを蛍光色素を使用して研究するプロトコルを示しています。青色光はチャネルロドプシンを活性化し、カルシウムの流入とシナプス小胞のエキソサイトーシスを引き起こします。この色素は神経膜に組み込まれ、エンドサイトーシス中に内在化されるため、蛍光が増強されます。さらにブルーライト刺激を受けると、エキソサイトーシスと色素の放出が誘発され、これは蛍光の減少によって示されます。...

ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

この論文は、シナプトブレビン2-pHluorinコンストラクトと全反射蛍光顕微鏡を使用して、神経芽細胞腫細胞における神経伝達物質小胞動態を調査する方法を提供します。また、画像処理とデータ分析のために開発された戦略についても報告されています。...

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169...

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ)...

シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

ゼブラフィッシュの幼生の神経筋接合部は、シナプス生理学を研究するための魅力的なモデルです。電気生理学や光学イメージングなど、多くの実験技術に適しています。ここでは、直立した落射蛍光顕微鏡下でpHluorinベースのプローブを使用してシナプス伝達をイメージングするためのプロトコルについて説明します。...

解剖された幼生ゼブラフィッシュの神経筋接合部におけるシナプス小胞のリサイクルのライブイメージング

学ぶシナプス小胞リサイクルの可視化法。スチリルFM色素を用いて誘発・自発的活動中の神経終末におけるシナプス小胞動態をイメージングし、神経伝達機構の理解に貢献する実験プロトコルを解説します。

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

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