マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる細胞内カーボンナノチューブの局在と相対定量(英語)

次の実験の全体的な目標は、統計的に関連性のある数の細胞におけるカーボンナノチューブの細胞内取り込みをモニタリングおよび定量化するためのナノ計測法を提供することです。これは、まず、細胞を水分散性のカーボンナノチューブで処理し、このカーボンナノチューブを濃度依存的に細胞内に侵入させることによって達成されます。これらのカーボンナノチューブは、最終的に蛍光マーカーで標識されます。

次に、固定後、各細胞をマルチスペクトルイメージングフローの明視野、暗視野、および蛍光チャネルでイメージングします。サイトメーター。カーボンナノチューブの分布と光吸収、散乱光、蛍光のレベルを視覚化するために、ナノチューブ標識は各細胞にピクセルごとに誘導します。最終的には、細胞内の固有の光吸収率と散乱により、カーボンナノチューブの局在と定量が可能になります。

したがって、この方法は、生細胞における炭素基材の影響および運命、ならびに薬物送達システムとしてのカーボンナノチューブのポットポテンシャルのようなナノ毒物学およびナノメディシン分野における新たな疑問に答えるのに役立つ。次に、ナノチューブを浴槽水で超音波処理し、摂氏20度で20分間超音波処理します。次に、ナノチューブを0、10、20、および50マイクログラム/ミリリットルの濃度で完全な培地で希釈し、次いで、20時間後に37°Cで1つの希釈あたり25平方センチメートルプレートで目的の細胞と各希釈液をインキュベートし、各プレートからインキュベーション培地を取り出し、カーボンナノチューブ標識細胞をPBSですすいでください。

洗浄後、トリプシンは各プレート上の細胞を観察し、それらを完全なDMEM培地に再懸濁します。次に、各サンプルを個々のeinor 15ミリリットルファルコンチューブに移し、次に細胞を200倍Gおよび室温で5分間スピンダウンします。各ペレットを4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で1時間再懸濁します。

固定後、細胞を再びスピンダウンし、ペレット化した各サンプルを150マイクロリットルのPBS中に10から5番目の細胞の15倍で再懸濁します。次に、個々の50ミクロンメッシュストレーナでサンプルをろ過し、画像ストリームで細胞の画像を取得します。マルチスペクトルイメージングフローサイトメーター。

まず、適合した倍率を選択し、次に目的のサンプルを画像化します。685ナノメートルのレーザーを使用して暗視野をイメージングし、フローサイトメーターを設定します。745〜800ナノメートルのバンドパスで暗電界放射を収集する6番目のチャネル。

画像解析のために、1番の明視野チャンネルと6番の暗視野チャンネルでサンプルを画像化します。まず、幅と高さのアスペクト比とセル領域のパラメトリックドットプロットを作成します。これにより、標準面積とアスペクト比が1に近い単一細胞と、大面積でアスペクト比が小さい多細胞イベントと、非常に小さな面積を示すデブリを区別することができます。

細胞画像を使用して単一細胞が正しく選択されていることを確認した後、低ルート、平均二乗勾配、低コントラストの非焦点細胞、および焦点平面内の細胞の選択を除外できるように、二乗平均勾配に対するコントラストをプロットすることにより、コントラストの高いカーボンナノチューブ標識細胞のバイパラメトリックドットプロットを設定します。次に、[最適フィーチャの検索] ツールを使用して、ラベル付きセルとラベルなしセルの間の最適な統計的分離を提供するパラメーターを決定します。たとえば、この代表的な実験では、平均ピクセルオブジェクトの特徴が最も適しています。

次に、このパラメータを正規化された周波数に対してプロットし、各実験濃度で細胞が取り込むナノチューブを定量化するためのヒストグラムをトレースします。次に、明視野上の平均ピクセルオブジェクトと暗視野上の強度のバイパラメトリックグラフをプロットします。これら2つのパラメータ間の相関を確認するために、カーボンナノチューブが強烈なダークスポットとして現れるため、ナノチューブの定量化も細胞画像上に作成することによって評価されます明視野チャネルでは、低強度の制限された範囲のピクセル、たとえばゼロから533の間を選択して、しきい値マスクを作成します。 1つは、暗磁場チャネルで明るく見えるナノチューブを視覚化するためのマスク2と呼ばれる2番目のマスクを作成するために、暗いナノチューブに正確にフィットします。

高輝度のピクセル範囲を選択します。たとえば、この実験では 150 から 4, 095 の範囲が選択されました。次に、明視野マスク1または暗視野マスク2のいずれかの領域を使用して、ナノチューブの相対的な内部化を定量化するためのドットプロットを設定します。

たとえば、マスク 2 の暗視野に対応するチャネル 6 の領域と、マスク 1 の明視野に対応するチャネル 1 の領域をプロットします。マスク1とマスク2の間の線形相関を決定した後、最初に細胞全体のマスクを作成し、次にマスクを侵食することにより、細胞質内のナノチューブを視覚化します。ここで、セルの内部を表示するために 7 ピクセルずつ M 0 1 7 を侵食することが示されました。

細胞膜内のカーボンナノチューブを可視化するには、ブール方程式M zero oneを使用し、M 0 1 7を侵食しないようにします。これは、細胞全体のマスクであり、細胞の内部から差し引かれて、膜上の暗いピクセルを評価するためだけに膜のマスクを作成します。明視野マスク1をメンブレンマスクに塗布します。

これらのマスクをすべて一度に複数のセルに適用して、標識されたサンプルと標識されていないサンプルの違いを確認します。次に、フィーチャーエリアツールでメンブレン上の黒いピクセルを選択し、細胞メンブレン上のカーボンナノチューブを定量化します。最後に、内在化されたカーボンナノチューブと膜に吸収されたカーボンナノチューブを区別します。

プロット、膜の黒い領域と細胞全体の黒い領域。1つの実験条件に対してすべてのプロットを作成したら、統計レポートテンプレートを作成します。テンプレートを A ST ファイルとして保存し、すべてのデータファイルをバッチ処理します。

イメージストリームデバイスは、3つの異なるナノチューブ標識細胞で示しているように、明視野、暗視野、蛍光チャネルなど、フローサイトメーター内の各細胞の複数の高解像度画像を生成します。これらのチャネルのオーバーレイも表示されます。カーボンナノチューブの存在は、非標識細胞と比較して、標識細胞のコントラストと勾配の両方に変化を誘発します。

したがって、バイパラメトリックドットプロットの作成は、フォーカスセルを選択するために重要です。黄色の焦点が合っていない細胞は、ナノチューブ標識の有無に関係なく、コントラストが低く、二乗平均平方根勾配が低いことで識別できます。非標識フォーカスセルも低コントラストを示しますが、フォーカスセルをナノチューブで標識すると、高いルート、平均二乗勾配を示しますが、細胞は高コントラスト、低ルート、平均二乗勾配プロファイルを示します。

内在化されたカーボンナノチューブは、特に明視野チャネルで容易に区別でき、そこでは強いダークスポットとして現れ、その領域はナノチューブの濃度とともに増加します。明視野画像の平均ピクセル信号を解析すると、ナノチューブの取り込みの相対的な定量化を決定できます。例えば、これらのヒストグラムは、ナノチューブ標識濃度が増加するたびに発生するナノチューブの取り込みの大幅な増加を示しており、カーボンナノチューブの定量化は、明視野画像内の制限された範囲の暗いピクセルに適用されるマスクを使用することによっても可能である、または暗視野内の高強度ピクセル内でも可能である。 ナノチューブが存在する領域に対応します。

これらのマスクの面積をプロットすることで、カーボンナノチューブの取り込みをさらに定量化することができます。さらに、明視野画像と暗視野画像のスポット間の相関関係は、暗視野強度と明視野平均ピクセル信号をプロットするか、明視野内のマスクの面積と暗視野内の領域をプロットすることで評価できます。次の2つの図では、細胞内部に局在するカーボンナノチューブの分析を示しています。

これらの最初の画像は、作成されたさまざまなマスクを示しています。デフォルトのセルマスクの侵食に基づくローカリゼーションマスクのロバスト性は、ラベル付きセルとラベルなしセルのコレクションで視覚的に確認する必要があることに注意してください。これらのドットプロットで示したように、細胞膜上の黒い斑点の総面積と細胞全体の黒点の総面積がプロットされ、インターナリゼーションスコアが決定されました。

摂氏4度、摂氏4度で2時間インキュベートした細胞と比較して、摂氏37度で20時間インキュベートした細胞では、カーボンナノチューブは主に膜上に位置しているのに対し、摂氏37度では、カーボンナノチューブは細胞の90%以上に取り込まれています。カーボンナノチューブの蛍光は、蛍光スポットと明暗視野チャネル内のスポットとの間の相関が低すぎるため、カーボンナノチューブの内部化の適切な指標ではありません。実際、fitzy 強度と明視野平均ピクセルの間の相関は、ピアソン相関係数がマイナス 0.2 であることを示しています。

これらの画像で示されているように、蛍光シグナルは、蛍光シグナルを部分的に消光した細胞内リソソーム内の明視野黒点、カーボンナノチューブ、閉じ込め、および凝集と確実に一致しません。対照的に、分散したナノチューブは、その開発後により信頼性の高い蛍光シグナルを発することができる。この技術は、ナノテクノロジーおよびナノメディシンの分野の研究者が、統計的ハイスループットサイトメトリー法を使用して、炭素ベースのナノ材料または高吸収および生命散乱能力を持つ任意のナノ材料と生細胞との相互作用を探求する道を開きます。