Name: ライブ癌細胞で共焦点イメージングで観測異常有糸分裂と関連付けられる細胞死 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 学ぶライブ共焦点イメージングでPJ-34処理による異常有糸分裂と細胞死の観察方法。MDA-MB-231乳がん細胞を用いたセントロソーム動態のリアルタイム解析技術です。

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本研究の資金源：テルアビブ大学の技術移転会社、运动とシェバ·メディカルセンター（M. CA及びSI）、ICRFの共同ファンド - イスラエルのがん研究財団（M. CA。）とイスラエル科学財団（ SI）。

1。細胞培養の準備 MDA-MB-231細胞は、ATCC（ アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクション ）から購入し、液体窒素中で保存した。 <ol><li>シード10 6 MDA-MB-231 Dulbeco改変イーグル培地（DMEM）、血清、1％L-グルタミン、及び1％Penstrep-アンホテリシンBのセルを許可し、10％の馬を含む10ミリリットル完全培地で92ミリメートル径シャーレ内の細胞約80-100％コンフルエントに増殖する。 </li><li>ディッシュから培地を取り外し、廃棄します。 </li><li> 0.25％血清のすべてのトレースを削除する（w / v）のトリプシン-EDTA溶液を用いて簡潔に細胞層を洗ってください。 </li><li>細胞層（通常は5〜15分以内）に分散するまで倒立顕微鏡により細胞を観察すると、皿トリプシン-EDTA溶液2.0 mlを加える。 </li><li> 18ミリリットル完全増殖培地を加え、穏やかにピペットで細胞を吸引。チューブに移します。 </li><li> 1,200 rpmで細胞懸濁液を遠心。 </li><li> CUの24ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁メディアをlture。 </li><li> 35ミリガラスボトムディッシュ（25％コンフルエント程度）とインキュベーター内の場所（5％CO 2、37℃）に細胞懸濁液2 mlを加える。 </li><li> ソリューション： <ol><li> 10％FBS、1％抗生物質（100単位/ mlペニシリンG、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシン、ペン連鎖球菌 - 両性溶液）及び2mMのL-グルタミンを含むDMEM：細胞増殖のための完全培地。 </li><li> 0.25％トリプシン-EDTAを含有するトリプシン-EDTA溶液。 </li></ol></li><li> 料理： 92ミリメートル直径ペトリ皿。 直径35mmのポリ-D-リジン被覆ガラス底培養皿。 </li></ol> 2。ライブ共焦点イメージングのための細胞の調製<ol><li>シード2×10部1で述べたように2ミリリットル完全培地中のガラス底培養皿に5 MDA-MB-231細胞。細胞培養は、60〜70％の合流を（シャーレ当たり3-4×10 5細胞程度）に達すると、トランスフェクションに進みます。 </li><li> 2つのプラスミドは、エンコーディングで細胞をトランスフェクト製造プロトコルに従って、リポソームトランスフェクション試薬ジェット-PIを使用して融合タンパク質γ-チューブリン-GFP（中心体の蛍光検出用）およびヒストン-RED（H2B-RED、染色体の蛍光検出用）をING。簡単に言えば、100μlの塩化ナトリウム（150mMの）とチューブに各プラスミドから2μgのを混在させる。第2のチューブに100μlの塩化ナトリウム（150mMの）とトランスフェクション試薬（100μL）を混合し、室温（RT）で5分間インキュベートする。その後、二つの溶液を組み合わせたミックス（軽度の渦を使用）とダウンスピン。室温で30分間インキュベートする。 </li><li>トランスフェクション混合物のインキュベーション中、PBSで1回細胞を洗浄しないサプリメントと暖かいDMEM 2mlの（37°C）で細胞培地を交換してください。 </li><li>穏やかにDMEMで細胞にトランスフェクション混合物を追加し、8時間（37℃、5％CO 2）インキュベーターにセルを返す。 </li><li> 24のためのインキュベーションの8時間後、2ミリリットル完全培地を含むDMEMを交換し、インキュベーターで細胞をインキュベートHR。 </li><li>トランスフェクション後24時間では、20μMPJ-34を含む2ミリリットル完全培地で細胞の培地を交換してください。 </li><li>さらに18時間（37℃、5％CO 2）、細胞をインキュベートする。 </li><li> 5％CO 2、37℃で細胞を維持するイメージングチャンバー内に少なくとも16時間の共焦点イメージングを生きるために件名のセル</li><li>並行して、以下のように蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクション効率36時間後にトランスフェクションを調べます<ol><li>シード2 2ミリリットルの完全培地でウェル当たり1カバースリップを含む6ウェルプレートにおいて5×10 MDA-MB-231細胞。 </li><li>セクション2.2から2.5で述べたように細胞をトランスフェクトする。 </li><li> 36時間後にトランスフェクションは、冷メタノールでのインキュベーションによりカバースリップ上に取り付け、トランスフェクトされた細胞を固定：アセトン（1:1）ソリューション、7分、-20℃を</li><li>固定液を吸引除去し、化学フードで乾燥するように取り付け細胞とカバースリップしてみましょう。 </li><li> DAPIでゴールド退色試薬を延長し、目を聞かせて適用するeはカバースリップで6時間暗所で乾燥させる。 </li><li>蛍光顕微鏡下でスライドを調べ、細胞の総人口からトランスフェクションされた細胞（赤と緑の信号）（DAPIによるDNA染色）の割合を計算します。 100-200細胞がカウントされたとき、所望のトランスフェクション率は20〜40％程度である。 </li></ol></li></ol> 3。ライブ共焦点イメージングスキャナ設定の技術的パラメータ<ol><li> SCANMODE XYZT;ホール[エアリー] 1.00;ズーム3.5、解像度8ビット;レーザーDPSS 561 nmで、アルゴン、可視レーザー488nmの;レーザー彼/ Neの見える633 nmで、客観HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV、開口数1.4;速度700 Hzのをスキャンし、屈折率1.52。 </li><li>画像3次元プレゼンテーションはIMARISイメージングソフトウェア7.0で調製した。 </li></ol> 4。固定した細胞における有糸分裂の共焦点イメージング<ol><li>シード2×10 5個のMDA-MB-231乳癌細胞（ATCC）、正常マウス胚線維芽細胞（MEF）、またはPARP1欠損ME2ミリリットル完全培地で6ウェルプレートにカバーガラス上のF（博士フランソワーズDantzerにより調製しPARP - / - ）。カバーガラスを2時間乾燥させ、6 - ウェルディッシュの各ウェルに入れ、滅菌DD水で洗浄することにより、以下の、96％エタノールで洗浄した。 </li><li>培地にPJ-34（10-30μM）を追加し、必要な期間（通常は最大96時間）のために、細胞をインキュベート。 </li><li> PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で1回カバースリップを洗って、氷冷メタノール中でインキュベーションを用いて細胞を固定：アセトン（1:1）ソリューション、7分、-20℃ </li><li>固定液を吸引し、カバースリップ（この段階では、カバーガラスが数週間のために-20℃に保つことができる）化学フード中で乾燥させてください。 </li><li>細胞膜を透過性およびRTで1時間PBST中の10％NDS（通常ロバ血清）（ &#39;ブロッキング溶液&#39;）で細胞をブロックするPBST（PBS、0.1％のTween-20を補充）で1回カバースリップを洗浄する。 </li><li>プライマリーantibodiで透過固定された細胞をインキュベート室温で2時間、ES（スピンドルと中心体染色のため）。抗αチューブリン（1:250希釈）および抗-γチューブリン（1:200希釈）：抗体は、以下のようなブロッキング溶液で希釈する。一次抗体は、次のように適用されています：6ウェルプレートカバー（カバーは逆さまである）上の各カバースリップのためのブロッキング溶液中の抗体の混合物を100μl（ドロップ）を適用。優しく抗体ドロップは、ドロップに直面して播種した細胞上にカバースリップを置く。室温で2時間撹拌抗体と対向するカバースリップをインキュベートする。 </li><li>ウェルに戻ってカバーガラスを置き、PBSTで細胞を3回洗浄する。その後、蛍光二次抗体を用いてカバーガラス上の細胞を標識するために4.6で説明したのと同じ手順を使用します。暗闇の中で、1時間、RT用の二次抗体を用いてカバーガラス上の細胞をインキュベートする。抗体は、以下のようブロッキング溶液で希釈する。;とアレクサフルーア568（1:1,000希釈アレクサフルーア488（緑1:1,000希釈）;赤）。 </li><li>使用してカバースリップはDAPI（染色体染色用）とGold退色防止試薬を延長し、乾燥させる暗闇の中で室温で一晩インキュベートマウント。 </li><li>共焦点顕微鏡によるカバースリップを調べます。 </li></ol> 5。 ATP生産により測定し、細胞の生存率 ATP産生は、発光ATP検出アッセイキットにより測定される。 <ol><li>各ウェルに800μlの培地中の種子96ウェルプレート中の細胞、約20,000のセルを。三ブランクウェルは、媒体のバックグラウンド発光を決定するために使用されるべきである。 </li><li> 100μMに約10μMからATP標準希釈系列を用意し、氷上に保つ。 </li><li>各ウェルに洗剤液50μlを加え、オービタルシェーカー、700回転で5分間プレートを振る。 </li><li>キット内の &#39;基質緩衝&#39; 5mlの &#39;凍結乾燥基質&#39;の再構成する各バイアル。 </li><li>ウェルに再構成された基質溶液50μlを加え、振とうオービタルシェーカー、700回転で5分間プレート。 </li><li> 10分間、暗闇の中でプレートを保管してください。 </li><li> ELISAマイクロプレートリーダーで各ウェルのluminiscenceを測定します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ライブ共焦点イメージングは、有糸分裂（ 図3と補足情報）の間にライブマルチ中心体細胞ではPJ-34の細胞毒性効果をリアルタイムに資料を提供した。これは、PJ-34 5-9で細胞分裂異常細胞死の誘導を示唆し、余分な中心体デクラスタリングと細胞死にヒト癌細胞におけるPJ-34の細胞毒性を帰初のライブドキュメントだった。対照的に、超正規の中心体の双方向の焦点クラスタリングは、双方向focaliクラスタ化余分中心体（ 図2、補足情報）を通常の有糸分裂を受けるライブ未処理のMDA-MB-231細胞で観察された。 これらの結果によると、トランスフェクションされた細胞のライブ共焦点イメージングは、有糸分裂5,9,15,16時のトランスフェクションされた細胞内の余分-中心体クラスタリングに関与するタンパク質の移行を検出するために有用である可能性があります。マルチcentrosでPJ-34の影響を受けたタンパク質の同定OMAL細胞は余分中心体デクラスタリングによって活性死メカニズムを理解す...

PJ-34を含むフェナントレン由来PARP1阻害剤は、ストレス条件下でのエネルギ消費PARP1媒介DNA修復（脳卒中または心筋梗塞）1によって誘導されるアポトーシス細胞死からの静止細胞を保護するように設計された。しかし、最近我々はPJ-34のことを発見し、その誘導PARP1阻害よりも倍高い濃度で、独占的にヒト癌細胞2,3における細胞死を引き起こす可能性があります。細胞の増殖であったより迅速に、細胞をより効率的に根絶であった。 PJ-34の細胞傷害活性は、有糸分裂2余分中心体デクラスタリングに起因するものであった。多くのヒト癌細胞の港4,5 multicentrosomes。静止細胞を損なうか、またはいくつかの良性の増殖細胞が有糸分裂で2中心体を保有することなく、20μMPJ-34と港過剰中心体は、効率的に72〜96時間以内にこれらの細胞を根絶ヒト乳癌細胞MDA-MB-231、のインキュベーション<suP&gt; 2,3。良性細胞は、ヒト胸腺から調製されたMCF-10ヒト乳腺上皮細胞、ヒト内皮細胞（HUVEC）とプライマリ間葉細胞を含んでいた。これらの細胞は、PJ-34の細胞傷害活性に耐性であった。 PJ-34は、96時間のインキュベーションの間に彼らの細胞周期に干渉したり、中心体と双方向の焦点紡錘体形成2,3に影響を及ぼさなかった。 バイポーラ中心体アセンブリは、有糸分裂4,5における双極紡錘体形成のために重要です。したがって、以上の2中心体を持つ細胞は、2つの極4-9で彼らの余分中心体をクラスタリング、ほとんど理解していない分子機構を開発しました。彼らの中心体の双極アセンブリの失敗は逮捕はG2 / Mの逮捕で、細胞周期、細胞死に至るが4,5分裂の失敗に起因することが多歪んスピンドルと異常な染色体の分離を引き起こす可能性があります。余分中心体デクラスタリングの基礎となる分子メカニズムは集中的に調査している&lt;&gt; 10（商標）。健康な組織の5,10を温存しながら、この死のメカニズムを理解することは、癌細胞の排他的な根絶が可能になります。 従って、細胞分裂異常細胞死を活性化する化合物は、共焦点画像は、超中心体のクラスタリングに影響する分子を同定するために使用することができることを示唆しているヒト固形cancers.Our結果の広い範囲で効率的であり得る選択的癌療法の新たなモードを提供有糸分裂2,3、薬剤候補をターゲットに、これらの化合物の癌をレンダリング。 我々は、固定やライブヒト癌細胞（有糸分裂で余分中心体の高い発生で）対正常細胞をスキャンすることによってナントPJ-34の細胞傷害活性を文書化している。ヒト癌細胞においてPJ-34の細胞傷害活性を同定するために用いられる撮像手順のステップバイステップの説明が以下に含まれる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS </td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>41965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>12657</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ペン-連鎖球菌-アンフォ溶液</td><td>生物産業、イスラエル</td><td>03-033-1B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>25030-024</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>25200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>92 mmシャーレ</td><td>Nunc、Thermo scientific</td><td>150350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mmポリD-リジンコーティングガラス底培養皿</td><td>MatTek Corporation、米国</td><td>P35GC-0-14-C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>発光ATP検出アッセイキット</td><td>Abcam</td><td>ab113849</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NDS(正常ロバ血清)</td><td>ジャクソン・イムノリサーチ</td><td>017-000-121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗 &-チューブリン抗体</td><td>Σ</td><td>T9026</td><td>1:250 希釈 (IF)</td></tr><tr><td>抗 &gamma;-チューブリン抗体</td><td></td><td>Σ T5192</td><td>1:200 希釈 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ 抗マウス IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td>1:1,000 希釈 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-10042</td><td>1:1,000 希釈 (IF)</td></tr><tr><td>ProLong Gold 褪色防止試薬 DAPI付き(マウンティング)</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>JetPEI(リポソームトランスフェクション試薬)</td><td>Polyplus</td><td>101-10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ(ドイツ、マンハイム)</td><td>TCS SP5II</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ライブ癌細胞で共焦点イメージングで観測異常有糸分裂と関連付けられる細胞死

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

強力PARP1阻害剤として作用しフェナントレン誘導体は有糸分裂におけるマルチ中心体ヒト癌細胞における過剰中心体の双方向の焦点クラスタリングを防いだ。ナントPJ-34は、最も強力な分子であった。余分中心体のデクラスタリングは、マルチ中心体細胞では分裂障害と細胞死を引き起こす。ほとんどの固体ヒトの癌は超中心体の高い発生を持っている。 PJ-34の活性はライブヒト乳癌MDA-MB-231中心体に高度に豊富である蛍光γ-チューブリン、および、蛍光ヒストンH2Bのプレゼントにコードするベクターでトランスフェクトされた細胞の共焦点イメージングによってリアルタイムで文書化されました染色。異常な染色体の手配やdeclustered中心体を表すデクラスタ化γ-チューブリン病巣はPJ-34で処理した後、トランスフェクトMDA-MB-231細胞で検出された。 2紡錘体極でアンクラスタ余分中心体は、細胞死に先行。これらの結果は、foのリンクさR初めて余分中心体細胞分裂におけるデクラスタリング、および細胞死に至る分裂不全のヒト癌細胞におけるPJ-34の最近検出された排他的な細胞傷害活性。 2中心体と双方向の焦点スピンドルと有糸分裂を受けて正常な細胞を損なうことなく、多中心体ともっぱら根絶癌細胞PJ-34、固定した細胞の共焦点イメージングにより観察前の調査結果による。 PJ-34のこの細胞傷害活性は、他の強力なPARP1阻害剤によって共有されていなかった、とPARP1阻害のその独立性を示唆し、PARP1欠損MEF宿すextracentrosomesで観察された。共焦点イメージングを生きるには、有糸分裂中の細胞を根絶する新しい分子を同定するための有用なツールを提供した。

PJ-34安定した水溶性のフェナント1（ 図1）である。我々の以前の結果は、PJ-34で処理した固定マルチ中心体癌細胞のいくつかのタイプに細胞死および非クラスタ化された余分中心体を明らかにした。対照的に、正常な増殖細胞を2,3損なわれていなかった。中心体は、2つの固定余分中心体細胞でcentrine1とγ-チューブリンに対する抗体で二重標識により同定した。 ここでは、PJ-34の細胞傷害活性は、ライブ共焦点顕微鏡を用いて、リアルタイムでこれらのライブ余分中心体細胞で記述されていました。 4,5余分中心体の高い発生を（&gt; 50％）を持っているMDA-MB-231細胞は、γ-チューブリン-GFPをトランスフェクトした細胞に焦点を当てた共焦点イメージングにより、少なくとも16時間のためにスキャンされた（ヒト乳癌ライブ蛍光γ-チューブリン巣2のラベル）とヒストンH2B-RED（蛍光ラベと染色体の玲）。六から十生きたトランスフェクションされた...

有糸分裂を受けている癌細胞でナントPJ-34の細胞傷害活性は、ライブ共焦点イメージングによりリアルタイムで文書化されました。 PJ-34根絶ヒト乳癌MDA-MB-231細胞分裂に余分中心体を保有する細胞。通常の双方向の焦点有糸分裂とは異なり、余分中心体は、PJ-34の存在下で2紡錘体極にクラスタ化されていなかった。

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

本実験の全体的な目的は、多中心体を持つヒトがん細胞の有糸分裂における、アントラキノン誘導体 PJ 34 の細胞毒性効果を観察することである。これは、トランスフェクションにより中心体を GFP gamma tubulin で、染色体を H two B read で標識することで達成される。トランスフェクションの目的は、生きた多中心体がん細胞における有糸分裂中の中心体の移動と凝集、および染色体の配列を追跡可能にすることである。第2ステップとして、トランスフェクションした細胞の一部に、余分な中心体の除去剤として作用する分子である PJ 34 を処置します。次に、トランスフェクションした生きたがん細胞を共焦点顕微鏡でスキャンし、中心体および染色体の移動に関連する有糸分裂中のイベントをキャプチャします。得られた連続画像を再構成またはクラスター化することで、生細胞の共焦点イメージングに基づいた、有糸分裂中のがん細胞における PJ 34 処置による除去効果および細胞毒性効果を示します。この手法の意義は、有糸分裂中の常染色体がん細胞のみを特異的に排除する標的がん治療への応用にまで及びます。本手法の実演は、共同研究者であるSheba Medical Center Cancer Research CenterのAsher Castillo博士と、Telaviv University Sacko School of MedicineイメージングユニットのLeonid middleman博士によって行われます。ライブ共焦点イメージングに向けてM-D-A-M-B 231乳がん細胞を準備するため、ポリスリシンコートした直径35 mmのガラスボトム培養皿に2×10⁵個の細胞を2 mLの完全培地とともに播種し、37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。細胞培養が60から70%のコンフルエンスに達した時点で、トランスフェクションが可能です。細胞には、中心体の蛍光検出用のgamma tubulin-GFPをコードするプラスミドと、染色体の蛍光検出用のhistone redをコードするプラスミドの2種類のプラスミドを導入します。トランスフェクションは、製造元のプロトコルに従い、リポソームトランスフェクション試薬jet PEを用いて行います。細胞をPBSで1回洗浄し、細胞培地を添加剤なしの温めたDMEM 2 mLに交換します。DMEM中の細胞にトランスフェクション混合液を緩やかに加え、その後、細胞をインキュベーターに戻して8時間静置します。DMEMを2 mLの完全培地に交換し、インキュベーター内で24時間培養します。24時間後、培地を20 µMのPGA 34を含む2 mLの完全培地に交換します。ライブ共焦点イメージングを行う前に、細胞をさらに18時間インキュベートします。以下は、ライブ共焦点イメージングスキャナーの設定の技術的パラメータです。スキャンモード XYZT、ピンホール airy 1.00、ズーム 3.5、解像度 8ビット、レーザー DPSS 561 nanometers、アルゴン可視光レーザー 488 nanometers、ヘリウムネオン可視光レーザー 633 nanometers。対物レンズ H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63倍 1.40 Oil UV 数値開口数 1.4。走査速度 700 hertz、屈折率 1.52。イメージングチャンバー内において、5% carbon dioxide および 37 °C の条件下で細胞を維持し、少なくとも 16 時間、生細胞共焦点イメージングを行う。トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡で確認します。まず、1ウェルあたり1枚のカバーガラスを配置した6ウェルプレートに、完全培地 2 mL とともに MDA MB 231 細胞を 2 × 10⁵ 個ずつ播種します。メーカーのプロトコルに従い、リポソームトランスフェクション試薬の Jet PE を使用して、前述と同様の方法で細胞にトランスフェクションを行います。トランスフェクションから36時間後。カバーガラス上のトランスフェクション済み細胞をPBSで洗浄し、各ウェルから培地を除去します。-20°Cで、メタノールとアセトンを1:1の割合で混合した冷却溶液に7分間浸漬し、細胞を固定します。7分後、固定液を吸引し、細胞を搭載したカバーガラスを化学薬品用フード内で30分間乾燥させます。次に、DPIを含むProlong Gold 抗退色剤を塗布し、暗所で6時間乾燥させます。蛍光顕微鏡でスライドを観察し、赤色および緑色のシグナルを示す形質導入細胞の割合を算出します。全細胞集団のうち、100～200個の細胞をカウントした際の目標とするトランスフェクション効率は約20～40%です。この手順を開始するには、6ウェルプレート内のガラスカバースリップ上にMDA-MB-231乳がん細胞を2 × 10⁵個、2 mLの完全培地にて播種します。培地にPJ34を添加し、規定の時間細胞をインキュベートします。インキュベーション期間の終了後、カバースリップをPBSで1回洗浄し、氷冷したメタノールとアセトンを1:1の比率で混合した溶液中で-20°Cで7分間インキュベートして細胞を固定します。次に、固定液を吸引し、化学薬品用フード内でカバースリップを30分間乾燥させます。カバースリップをPBSTで1回洗浄して細胞膜を透過性にし、その後、室温で1時間、PBSTで希釈した10%正常ドナキー血清を用いて細胞をブロッキングします。ブロッキング溶液に抗α-tubulinおよび抗γ-tubulin一次抗体を加え、ボルテックスして最初の抗体混合液を作成します。次に、6ウェルプレートカバー上の各カバーガラスに、抗体混合液を100 µLずつ滴下します。カバーガラスを裏返しにして、抗体液の滴の上にそっと置き、2時間インキュベートします。室温に戻します。これにより、紡錘体と中心体が染色されます。カバースリップをウェルに戻し、PBSTで細胞を3回洗浄します。次に、二次抗体（LOR 488およびLOR 568）を、6ウェルプレートカバー上のカバースリップ1枚につき1滴ずつ添加します。その後、カバースリップを抗体滴の上に裏向きに置き、室温・暗所で1時間インキュベートします。二次抗体によるインキュベーションが完了したら、カバースリップをウェルに戻し、PBSTで細胞を3回洗浄します。最後に、Prolong Gold 抗退色剤を用いてカバーガラスを封入し、共焦点顕微鏡で固定細胞を観察する前に、室温の暗所で一晩静置して乾燥させます。PJ 34は、安定した水溶性のパントロジンであり、2つの中心体と二極紡錘体を持つ正常な分裂細胞を損なうことなく、多中心体を持つ癌細胞のみを特異的に除去することが以前に観察されています。本研究では、中心体の過剰存在率が高いヒト乳癌M-D-A-M-B 231生細胞を用いて、PJ 34の細胞毒性活性を検討しました。γ-tubulin GFPを用いてγ-tubulin fociを、ヒストンH2B redを用いて染色体を標識するため、細胞にトランスフェクションを行った。MDAMB231細胞を共焦点イメージングで少なくとも16時間スキャンしたところ、以下のビデオクリップに示すように、有糸分裂期の大部分の細胞において、中心体の二焦点クラスター形成（extra centrosome bifocal clustering）が認められた。最初のビデオでは、γ-tubulinにより中心体が緑色に標識された、有糸分裂期のランダムに選択された生細胞を示している。2番目のビデオでは、ヒストンH2B-redを導入したランダムに選択されたMDA-MB-231細胞において、有糸分裂中の染色体再編成がGFPで可視化されています。この3番目のビデオは、有糸分裂を行うMDA-MB-231細胞であり、二焦点のクラスター化した中心体フォーカスが緑色に、染色体が赤色にラベルされています。対照的に、20 µMのPJ34でインキュベートし形質導入したMDA-MB-231生細胞では、クラスター化していない中心体と染色体の異常な配置が検出され、この動画に示されているように、これらの細胞における有糸分裂は細胞死に終わりました。有糸分裂中の細胞死をリアルタイムで記録した本データは、有糸分裂期に多極紡錘体を形成したヒト悪性細胞の数と、PJ 34を添加して培養した細胞における細胞死の割合との間に、以前に定義された正の相関があることを強く支持しています。PJ 34は強力なPARP one阻害剤として作用するため、PARP oneの阻害が有糸分裂不全に伴う細胞死を引き起こす可能性について検討が行われました。正常なマウス胚性線維芽細胞およびPARP one欠損マウス胚性線維芽細胞を用いて、PJ 34の濃度上昇に伴う細胞毒性活性を試験し、その結果をここに示します。左のグラフは、指定した濃度のPJ 34で48時間インキュベートした正常なマウス胚性線維芽細胞（黒線）およびPARP1欠損線維芽細胞（灰色線）において算出された多焦点紡錘体の割合を示しています。これらの割合は、3回の異なる実験で検出された計20本の紡錘体から算出されました。右のグラフは、20 µMで72時間インキュベートした正常およびPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞の生存率を示しています。PJ 34による細胞生存率は、細胞のA TP産生量によって測定されました。3回の異なる実験における各細胞株の4回の測定値の平均値を提示しています。これらの結果は、PJ 34がPARP 1欠損マウス胚性線維芽細胞において用量依存的に紡錘体の歪みと細胞死を引き起こしたが、正常な線維芽細胞では引き起こさなかったことを示しています。PJ 34がPARP1欠損細胞を死滅させたという事実、およびPARP1阻害に必要な濃度よりも高い濃度のPJ 34で培養したPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞において多極紡錘体の形成と細胞死に相関が見られたことは、PARP1欠損マウス胚性線維芽細胞における中心体の整理（decluttering）とPARP1阻害との間に因果関係があるということとは矛盾しています。これらの共焦点画像は、有糸分裂期の正常なマウス胚性線維芽細胞およびPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞を示しており、固定・透過処理後、$\alpha$および$\gamma$チューブリンに対して免疫染色が行われ、紡錘体が緑色に、中心体が赤色にそれぞれ標識されています。染色体はDPI試薬により青色に標識されています。細胞を未処理にするか、または指定の濃度のPJ 34で48時間インキュベートした。PJ 34で処理したPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞では、凝集していないγ-tubulinのフォーカス、紡錘体の歪み、および細胞死が観察されたが、PJ 34で処理した正常なマウス胚性線維芽細胞では観察されなかった。検討した細胞培養の一部は、PARP1の酵素活性を阻害する2つの強力な非アリリン系PARP1阻害剤であるABT-888およびAG-01469で処理した。テストしたPARP1阻害剤はいずれも、PARP1活性を抑制する濃度において、正常なマウス胚性線維芽細胞に影響を与えませんでした。また、これらのPARP1阻害剤は、PARP1欠損マウス胚性線維芽細胞における中心体凝集にも影響しませんでした。これらの結果は、多中心体を持つ細胞に対するPJ 34の細胞毒性活性が、他の強力なPARP1阻害剤には共通していないことを示しています。この手法は、さまざまな目的で他の生細胞種にも適用可能です。

cell-death-associated-with-abnormal-mitosis-observed-confocal-imaging

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