ライブ癌細胞で共焦点イメージングで観測異常有糸分裂と関連付けられる細胞死

本実験の全体的な目的は、多中心体を持つヒトがん細胞の有糸分裂における、アントラキノン誘導体 PJ 34 の細胞毒性効果を観察することである。これは、トランスフェクションにより中心体を GFP gamma tubulin で、染色体を H two B read で標識することで達成される。トランスフェクションの目的は、生きた多中心体がん細胞における有糸分裂中の中心体の移動と凝集、および染色体の配列を追跡可能にすることである。

第2ステップとして、トランスフェクションした細胞の一部に、余分な中心体の除去剤として作用する分子である PJ 34 を処置します。次に、トランスフェクションした生きたがん細胞を共焦点顕微鏡でスキャンし、中心体および染色体の移動に関連する有糸分裂中のイベントをキャプチャします。得られた連続画像を再構成またはクラスター化することで、生細胞の共焦点イメージングに基づいた、有糸分裂中のがん細胞における PJ 34 処置による除去効果および細胞毒性効果を示します。

この手法の意義は、有糸分裂中の常染色体がん細胞のみを特異的に排除する標的がん治療への応用にまで及びます。本手法の実演は、共同研究者であるSheba Medical Center Cancer Research CenterのAsher Castillo博士と、Telaviv University Sacko School of MedicineイメージングユニットのLeonid middleman博士によって行われます。ライブ共焦点イメージングに向けてM-D-A-M-B 231乳がん細胞を準備するため、ポリスリシンコートした直径35 mmのガラスボトム培養皿に2×10⁵個の細胞を2 mLの完全培地とともに播種し、37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。

細胞培養が60から70%のコンフルエンスに達した時点で、トランスフェクションが可能です。細胞には、中心体の蛍光検出用のgamma tubulin-GFPをコードするプラスミドと、染色体の蛍光検出用のhistone redをコードするプラスミドの2種類のプラスミドを導入します。トランスフェクションは、製造元のプロトコルに従い、リポソームトランスフェクション試薬jet PEを用いて行います。細胞をPBSで1回洗浄し、細胞培地を添加剤なしの温めたDMEM 2 mLに交換します。DMEM中の細胞にトランスフェクション混合液を緩やかに加え、その後、細胞をインキュベーターに戻して8時間静置します。

DMEMを2 mLの完全培地に交換し、インキュベーター内で24時間培養します。24時間後、培地を20 µMのPGA 34を含む2 mLの完全培地に交換します。

ライブ共焦点イメージングを行う前に、細胞をさらに18時間インキュベートします。以下は、ライブ共焦点イメージングスキャナーの設定の技術的パラメータです。スキャンモード XYZT、ピンホール airy 1.00、ズーム 3.5、解像度 8ビット、レーザー DPSS 561 nanometers、アルゴン可視光レーザー 488 nanometers、ヘリウムネオン可視光レーザー 633 nanometers。

対物レンズ H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63倍 1.40 Oil UV 数値開口数 1.4。走査速度 700 hertz、屈折率 1.52。イメージングチャンバー内において、5% carbon dioxide および 37 °C の条件下で細胞を維持し、少なくとも 16 時間、生細胞共焦点イメージングを行う。

トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡で確認します。まず、1ウェルあたり1枚のカバーガラスを配置した6ウェルプレートに、完全培地 2 mL とともに MDA MB 231 細胞を 2 × 10⁵ 個ずつ播種します。メーカーのプロトコルに従い、リポソームトランスフェクション試薬の Jet PE を使用して、前述と同様の方法で細胞にトランスフェクションを行います。

トランスフェクションから36時間後。カバーガラス上のトランスフェクション済み細胞をPBSで洗浄し、各ウェルから培地を除去します。-20°Cで、メタノールとアセトンを1:1の割合で混合した冷却溶液に7分間浸漬し、細胞を固定します。

7分後、固定液を吸引し、細胞を搭載したカバーガラスを化学薬品用フード内で30分間乾燥させます。次に、DPIを含むProlong Gold 抗退色剤を塗布し、暗所で6時間乾燥させます。蛍光顕微鏡でスライドを観察し、赤色および緑色のシグナルを示す形質導入細胞の割合を算出します。

全細胞集団のうち、100～200個の細胞をカウントした際の目標とするトランスフェクション効率は約20～40%です。この手順を開始するには、6ウェルプレート内のガラスカバースリップ上にMDA-MB-231乳がん細胞を2 × 10⁵個、2 mLの完全培地にて播種します。培地にPJ34を添加し、規定の時間細胞をインキュベートします。

インキュベーション期間の終了後、カバースリップをPBSで1回洗浄し、氷冷したメタノールとアセトンを1:1の比率で混合した溶液中で-20°Cで7分間インキュベートして細胞を固定します。次に、固定液を吸引し、化学薬品用フード内でカバースリップを30分間乾燥させます。カバースリップをPBSTで1回洗浄して細胞膜を透過性にし、その後、室温で1時間、PBSTで希釈した10%正常ドナキー血清を用いて細胞をブロッキングします。

ブロッキング溶液に抗α-tubulinおよび抗γ-tubulin一次抗体を加え、ボルテックスして最初の抗体混合液を作成します。次に、6ウェルプレートカバー上の各カバーガラスに、抗体混合液を100 µLずつ滴下します。カバーガラスを裏返しにして、抗体液の滴の上にそっと置き、2時間インキュベートします。

室温に戻します。これにより、紡錘体と中心体が染色されます。カバースリップをウェルに戻し、PBSTで細胞を3回洗浄します。

次に、二次抗体（LOR 488およびLOR 568）を、6ウェルプレートカバー上のカバースリップ1枚につき1滴ずつ添加します。その後、カバースリップを抗体滴の上に裏向きに置き、室温・暗所で1時間インキュベートします。二次抗体によるインキュベーションが完了したら、カバースリップをウェルに戻し、PBSTで細胞を3回洗浄します。

最後に、Prolong Gold 抗退色剤を用いてカバーガラスを封入し、共焦点顕微鏡で固定細胞を観察する前に、室温の暗所で一晩静置して乾燥させます。PJ 34は、安定した水溶性のパントロジンであり、2つの中心体と二極紡錘体を持つ正常な分裂細胞を損なうことなく、多中心体を持つ癌細胞のみを特異的に除去することが以前に観察されています。本研究では、中心体の過剰存在率が高いヒト乳癌M-D-A-M-B 231生細胞を用いて、PJ 34の細胞毒性活性を検討しました。

γ-tubulin GFPを用いてγ-tubulin fociを、ヒストンH2B redを用いて染色体を標識するため、細胞にトランスフェクションを行った。MDAMB231細胞を共焦点イメージングで少なくとも16時間スキャンしたところ、以下のビデオクリップに示すように、有糸分裂期の大部分の細胞において、中心体の二焦点クラスター形成（extra centrosome bifocal clustering）が認められた。最初のビデオでは、γ-tubulinにより中心体が緑色に標識された、有糸分裂期のランダムに選択された生細胞を示している。

2番目のビデオでは、ヒストンH2B-redを導入したランダムに選択されたMDA-MB-231細胞において、有糸分裂中の染色体再編成がGFPで可視化されています。この3番目のビデオは、有糸分裂を行うMDA-MB-231細胞であり、二焦点のクラスター化した中心体フォーカスが緑色に、染色体が赤色にラベルされています。対照的に、20 µMのPJ34でインキュベートし形質導入したMDA-MB-231生細胞では、クラスター化していない中心体と染色体の異常な配置が検出され、この動画に示されているように、これらの細胞における有糸分裂は細胞死に終わりました。

有糸分裂中の細胞死をリアルタイムで記録した本データは、有糸分裂期に多極紡錘体を形成したヒト悪性細胞の数と、PJ 34を添加して培養した細胞における細胞死の割合との間に、以前に定義された正の相関があることを強く支持しています。PJ 34は強力なPARP one阻害剤として作用するため、PARP oneの阻害が有糸分裂不全に伴う細胞死を引き起こす可能性について検討が行われました。正常なマウス胚性線維芽細胞およびPARP one欠損マウス胚性線維芽細胞を用いて、PJ 34の濃度上昇に伴う細胞毒性活性を試験し、その結果をここに示します。

左のグラフは、指定した濃度のPJ 34で48時間インキュベートした正常なマウス胚性線維芽細胞（黒線）およびPARP1欠損線維芽細胞（灰色線）において算出された多焦点紡錘体の割合を示しています。これらの割合は、3回の異なる実験で検出された計20本の紡錘体から算出されました。右のグラフは、20 µMで72時間インキュベートした正常およびPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞の生存率を示しています。

PJ 34による細胞生存率は、細胞のA TP産生量によって測定されました。3回の異なる実験における各細胞株の4回の測定値の平均値を提示しています。これらの結果は、PJ 34がPARP 1欠損マウス胚性線維芽細胞において用量依存的に紡錘体の歪みと細胞死を引き起こしたが、正常な線維芽細胞では引き起こさなかったことを示しています。

PJ 34がPARP1欠損細胞を死滅させたという事実、およびPARP1阻害に必要な濃度よりも高い濃度のPJ 34で培養したPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞において多極紡錘体の形成と細胞死に相関が見られたことは、PARP1欠損マウス胚性線維芽細胞における中心体の整理（decluttering）とPARP1阻害との間に因果関係があるということとは矛盾しています。これらの共焦点画像は、有糸分裂期の正常なマウス胚性線維芽細胞およびPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞を示しており、固定・透過処理後、$\alpha$および$\gamma$チューブリンに対して免疫染色が行われ、紡錘体が緑色に、中心体が赤色にそれぞれ標識されています。染色体はDPI試薬により青色に標識されています。

細胞を未処理にするか、または指定の濃度のPJ 34で48時間インキュベートした。PJ 34で処理したPARP1欠損マウス胚性線維芽細胞では、凝集していないγ-tubulinのフォーカス、紡錘体の歪み、および細胞死が観察されたが、PJ 34で処理した正常なマウス胚性線維芽細胞では観察されなかった。検討した細胞培養の一部は、PARP1の酵素活性を阻害する2つの強力な非アリリン系PARP1阻害剤であるABT-888およびAG-01469で処理した。

テストしたPARP1阻害剤はいずれも、PARP1活性を抑制する濃度において、正常なマウス胚性線維芽細胞に影響を与えませんでした。また、これらのPARP1阻害剤は、PARP1欠損マウス胚性線維芽細胞における中心体凝集にも影響しませんでした。これらの結果は、多中心体を持つ細胞に対するPJ 34の細胞毒性活性が、他の強力なPARP1阻害剤には共通していないことを示しています。

この手法は、さまざまな目的で他の生細胞種にも適用可能です。