DNAのゲル電気泳動

DNAゲル電気泳動は、サイズに基づいてDNA断片を分離し、同定するために使用される技術です。

さまざまなサイズのDNA断片を、アガロースから作られた多孔質ゲルにロードしますか?紅藻類に含まれる炭水化物。

電場が印加されると、DNAヌクレオチドの負に帯電したリン酸基のおかげで、フラグメントはゲル内を移動します。

DNAの小さな断片は、ゲルマトリックス内を移動するのが難しい大きな断片よりもゲル内を移動しやすくなります。

ゲルランが完了すると、DNAサンプルの位置を、DNAラダーと呼ばれる既知のサイズの一連のフラグメントまたはバンドと比較できます。

次に、目的のフラグメントの存在は、そのサイズに基づいて確認でき、これはテストサンプルのラダーのフラグメントとの相対的な位置を比較することによって決定されます。

アガロースゲルは、重量オーバーボリュームパーセント溶液を使用して調製されます。したがって、100mlの緩衝液に1グラムのアガロースを入れると、1%のゲルになります。 ゲルの割合が低いほど大きなフラグメントの分離が良くなり、ゲルの割合が高いほど小さなフラグメントが識別しやすくなります。ゲル作成手順を開始するには、適切な量のアガロースを三角フラスコに秤量します。

フラスコにランニングバッファを追加して、バッファの容量がフラスコの容量の1/3を超えないようにします。 次に、渦を巻いて混ぜます。

アガロース/バッファー混合物を、マイクロ波で最大電力で加熱することにより溶かします。30秒ごとにフラスコを取り外し、内容物を渦巻いてよく混ぜます。アガロースが完全に溶解するまで繰り返します。

次に、臭化エチジウムを0.5 mg / mlの濃度に添加します。臭化エチジウムは、DNAの個々の塩基対の間に収まる芳香族化合物であり、UV光の下でDNAに強いオレンジ色の蛍光を発させます。臭化エチジウムは発がん性物質であるため、この化合物を含むゲルを取り扱うときは常に手袋を着用する必要があることに注意することが重要です。

ゲルトレイが反るのを防ぐために、アガロースを65に入れて冷ましますか?Cウォーターバス。

アガロースが冷却されている間、ゲルトレイを鋳造装置に入れてゲル型を準備します。 別の方法として、テープを使用してゲルトレイの開いた端をシールし、型を作成することもできます。 ゲルにコームを入れると、DNAがロードされるウェルが作成されます。コームがDNAサンプルに適したサイズのウェルを作成することを確認してください。

溶融したアガロースをゲル型に流し込み、室温で硬化させます。

アガロースが固まったら、櫛を取り出します。ジェルをすぐに使用しない場合は、ラップで包んで4時に保管してください。使用までC。

ゲルをすぐに使用する場合は、ジェルボックスに入れてください。

この手順を開始するには、分離するDNAサンプルにゲルローディング色素を添加します。ローディング染料は通常、6倍の濃度で製造されます。 色素のローディングは、サンプルを視覚化してウェルにロードするのに役立ち、分析中にサンプルがどれだけ移動したかを判断するのに役立ちます。

電源を希望のボリュームに設定しますtage。

次に、ゲルの表面を覆うのに十分なランニングバッファーをゲルボックスに加えます。ゲルの調製に使用したものと同じランニングバッファーを使用してください。

ジェルボックスのリード線を電源に接続し、電源を入れます。 DNAは負に帯電しており、正のアノードに向かって移動し、一般的に色は赤であることを忘れないでください。 黒いリード線またはカソードをゲルボックスの底に接続しないように注意してください。ですから、黒猫は不運、またはネガティブであり、したがって黒猫はネガティブであることを忘れないでください。 ゲルを赤またはアノードに流します。ゲルボックスと電源の両方が機能していることを確認するため。電極に気泡が見えるのは、電流が流れていることを示しています。

ジェルボックスの蓋を外します。DNAサンプルをゆっくりと慎重にゲルにロードします。 ここでも、サンプル中のローディング色素により、サンプルがゲルに沈み込み、サンプルがどれだけ移動したかを追跡するのに役立ちます。DNAサイズマーカー(ラダー)は、常に実験サンプルと一緒にロードする必要があります。

蓋を元に戻します。電極が電源の正しいスロットに差し込まれていることを再確認してください。

電源を入れます。色素が適切な距離に移動するまでゲルを泳動します。

電気泳動ランが完了したら、電源をOFFにし、ゲルボックスのフタを外します。

ゲルボックスからゲルを取り出し、ゲル表面の余分なバッファーを排出します。ジェルトレイをペーパータオルの上に置き、残っているランニングバッファーを吸収します。

DNA断片を可視化するには、ゲルトレイからゲルを取り出し、ゲルを紫外線にさらします。

DNA断片はオレンジ色の蛍光バンドとして現れるはずです。 ジェルの写真を撮ります。

実験の最後に、施設の規則に従ってゲルとランニングバッファーを適切に廃棄してください。繰り返しになりますが、エチジウムブロマイドへの曝露を避けるために、常にゲルとランニングバッファーを手袋で取り扱うことを忘れないでください。

これで、DNAゲル電気泳動の実行方法を見てきました。この非常に便利な方法のいくつかのダウンストリームアプリケーションとバリエーションを見てみましょう。

ここでは、PCR産物を分離した後のアガロースゲル電気泳動結果を示します。ゲルにロードされたDNA断片は、明確に定義されたバンドとして見えます。DNA標準またはラダーは、サンプルバンドのサイズを有用な決定が可能な程度まで分離する必要があります。この例では、765塩基対、880塩基対、および1022塩基対のDNA断片を、2log DNAラダーを備えた1.5%アガロースゲル上で分離します。

目的のDNA断片の存在を確認するだけでなく、DNAゲル電気泳動はゲル精製手順と組み合わせることができます。 通常、カミソリの刃を使用して目的のDNA断片を切り取り、それを収集し、その中のDNAサンプルを回収できるようにします。

アガロースゲルエレクトロフェシスは、DNA(RNA)をセルロースメンブレンに転写し、放射性プローブを使用して電気泳動分離サンプル中の特定のDNAまたはRNA配列を同定するトランスファーブロッティングと組み合わせることもできます。

標準的なDNAゲル電気泳動は、ゲノムDNAのようにサイズが15〜20 kbを超える高分子量DNAの分離には理想的ではありません。 大きなDNAサンプルを分離するために、パルスフィールドゲル電気泳動が使用され、ゲルを異なる方向に変化する、またはパルスする電界にさらします。この手法には、ゲルの周囲に異なる向きに配列された一対の電極を備えた特殊なゲル走行装置が含まれます。 これは、異なる湖環境から採取された異なる微生物群集からのプールされたDNAサンプルのように、生物の集団間のゲノムサイズの違いを検出するために使用できます。

DNAゲル電気泳動の紹介を見てきました。 このメソッドの背後にある概念、アガロースゲルの調製方法、サンプルのロード方法、ゲルの分析方法、およびアガロースゲル電気泳動の一般的なアプリケーションについて説明しました。 ご覧いただきありがとうございます、そしてジェルの実行に頑張ってください。