Name: 人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ コラゲナーゼを用いた酵素処理法による脂肪由来幹細胞の手動分離技術。SVFの遠心分離と培養を通じて、再生医療研究に有用な多分化能を持つ細胞を効率的に取得する方法です。

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作者は認めるしたいを含む記載されているプロトコルとASCのその単離の発展に貢献し、それらの追加の研究人材、感謝博士H.ピーター·ローレンツ博士、博士宏Muzuno、MD、博士ジェリー黄、MDを博士アダム·カッツ、MD、博士はウィリアム·フトレル、MD、博士は栄チャン、DDS、PhDは、博士ラリッサロドリゲス、MD、博士はゼニアルフォンソ博士は、博士ジョン·フレイザー博士。提示された結果は、NIAMSおよびNIDCR研究所などの国立衛生研究所から研究助成金によって部分的に資金を供給されました。

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<li>De Francesco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2FCD90+ASCs+are+capable+of+growing+as+sphere+clusters%2C+producing+high+levels+of+VEGF+and+forming+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries.</a> PLoS One. 4 (8), e6537(2009).</li>
<li>Haasters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+immunocytochemical+characteristics+indicate+the+yield+of+early+progenitors+and+represent+a+quality+control+for+human+mesenchymal+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing.</a> J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).</li>
</ol>

この原稿の著者は、カリフォルニア大学とサイトリピューにライセンスが所有する特許の共同発明者である。

ASCの分離のための脂肪組織は、さまざまな形で来ることができる：注射器抽出または吸引補助脂肪形成術（ すなわち脂肪吸引）のいずれかによって得られた小さな断片に切除または脂肪形成術によって得られた組織の固体片から。競合する研究は16,17提示されているように、複数のSVF細胞（ASCは、それによって）が切除または脂肪吸引サンプルから得ることができるかどうかは不明である。それは、脂肪組織の形態のいずれかがある限り、オペレータが彼らの分離技術に堪能であるように、SVFの細胞とASCの単離のために適したよりも多い可能性があります。しかし、脂肪吸引は、その中に切除よりも有利を保持し、それは低侵襲で、大幅に少なく術後ケアを必要とします。脂肪吸引の種類は、超音波支援、パワーアシストおよびレーザ支援脂肪吸引18などの技法を含め、過去10年間に増加しているが、最も一般的なのは、腫れ上がっ脂肪吸引のままここで脂肪コンパートメントは19を吸引する前に滅菌生理食塩水、麻酔薬や血管収縮薬の大量が殺到している。技術の選択は、外科医から外科医に異なる場合があります。抽出手段は、研究...

2001年には、脂肪組織から多能性幹細胞の集団は、推定上のジャーナル·ティッシュ·エンジニアリング1に記載されている。これらの細胞は、美容整形によって得られた処理脂肪吸引組織からの派生のために名前を処理脂肪吸引またはPLA細胞を与えられた。この資料に記載されている分離方法は、脂肪組織2から間質血管画分（SVF）を単離するための既存の酵素の戦略に基づいていた。 SVFは、組織培養基質2、3に付着するには至っていない赤血球、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞および前脂肪細胞の最小限の加工集団として定義されている。経時このSVFの培養は、これらの混入細胞集団の多くを排除し、付着性、線維芽細胞集団を生じることが提案されている。これらの線維芽細胞は事前にされていると、最後の40年間の文献で確認されている脂肪細胞。しかし、我々の研究グループでは、これらの細胞は中胚葉多分化を保有し、PLA細胞として付着したSVFの人口と改名することを実証した。他の多くの研究グループによるその後の研究では、（レビュー4を参照）、内胚葉及び外胚葉の両方電位を示唆し、この潜在的に追加した。その時以来、これらの細胞のための多数の追加の用語が文献に登場している。コンセンサスいくつかのタイプを提供するために、長期的な脂肪由来幹細胞またはASCを、2 回目の年次IFATS会議で採択された。このように、長期的なASCが、この記事で使用されます。 この資料に記載されたプロトコルは、標準的な実験室装置を必要とし、そのようなリン酸緩衝化生理食塩水、標準的な組織培養培地試薬およびコラゲナーゼなどの単純な試薬を使用して比較的簡単な手順である。それは、脂肪組織量およびその後のcと出発の量に応じてASCの多数を生成することができるulture時間。しかし、脂肪組織のような大量の処理は、このプロトコルを使用してある程度まで軽減することができるいくつかの物理的な問題を提示することができる。さらに、このプロトコルは、無菌の組織培養施設を必要としませんし、それによって承認された組織培養施設の使用を必要と、バイオセーフティフードを承認した。これらは適正製造基準分離と臨床使用のための材料の拡大のために設計された（GMP）が承認した施設で隔離されていない限り、この要件には、臨床応用におけるASCの人口の有用性を減少させることができます。別の方法として、手術室に閉鎖系でのASCを単離することができる自動化されたシステムは、この重要な問題を回避するとその後のin vitroでの拡大を必要とせずにASCのすぐに使用可能にする。今日まで、ヒト組織からの細胞の単離のために市販の6つの自動化システムがある。これらのシステムは、単離することを可能にすることができるすぐに収穫後の脂肪組織に大量のからASCのかなりの数。これらのASCは、患者がこれまでに手術室を離れることなく、回生、様々な目的のために患者に再導入することができた。 ASCの手動分離を記述し、このプロトコルに加えて、セリューション·システムを使用したASCの自動化された単離するためのプロトコルも、関連記事に記載されています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>DMEM (ダルベッコ&#8217;Eagleの改造&#8217;</td><td>メディアテック セルグロ</td><td>10-013-CV</td><td>4.5 g/ml グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム</td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>10,000 IU/ml ペニシリン/10,000 &#956;g/ml ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-003-CF</td><td>250 &#956;g/ml アンホテリシン B</td></tr><tr><td>10X PBS (リン緩衝生理食塩水)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>カルシウムなし、マグネシウムなし</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>20-031-CV</td><td>0.25 % トリプシン/2.21mM EDTA</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IA 型 (Clostridium histolyticum 由来)</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>粗調製; <125コラーゲン消化ユニット/mg固体</td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)熱不活性化</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>100106</td><td>USDAソース、熱不活性化</td></tr><tr><td>10ml血清ピペットジェ</td><td>ネシーサイエンティフィ</td>ック<td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25ml血清ピペットジェ</td><td>ネシーサイエンティフィ</td>ック<td>12-1065</td><td></td></tr><tr><td>50mlポリプロピレン遠心分離管ジェ</td><td>ネシーサイエンティフィック</td><td>21-106</td><td></td></tr><tr><td>100 mm組織培養ディッシュ</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>150 mm組織培養ディッシュ</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>500 ml ステリカップ フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU05RE</td><td>PESメンブレン, 0.22 &#956;mポア</td></tr><tr><td>セルストレーナーフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>22-363-549</td><td>100 &#956;mのナイロン網</td></tr><tr><td>デキサメタゾン - 水溶性</td><td>シグマ</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸2の隣酸塩</td><td>シグマ</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-グリセロリン酸二ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>G-9422</td>はまた、牛の膵臓インドメタシンシグマ<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>I-7378</td>から作られたグリセロリン酸インスリンシグマI-6634</tr>として知られています<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アポトランスフェリン</td><td>シグマ</td><td>T-4382</td><td></td></tr><tr><td>TGF&#946;1</td><td>R&Dシステム</td><td>240-B-002</td>組<td>換えヒト</td></tr><tr><td>オイルレッドO</td><td>シグマ</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>アルシアンブルー</td><td>シグマ</td><td>A-5268</td><td></td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td>シグマ</td><td>S-0319</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>30525-89-416</td><td>%ストック</td></tr><tr>として供給<td colspan="4">[ヘッダー]</td></tr><tr><td colspan="4"> 必要な機器 </td></tr><tr><td>Class II A/B バイオセーフティフード</td><td>Thermo Scientific</td><td></td>は<td>、フードに吸引用の真空ラインがあることを確認します</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Hermle Labnet</td><td>Z383</td><td>50mlチューブ用のスイングアウトローターが必要で、1200xgの</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>が可能 フィッシャーサイエンティフィックのIsotemp</td><td>S52602Q</td><td>5-10Lの容量、37C</td></tr><tr><td>の能力自動ピペットエイド</td><td>ドラモンドピペットエイドXL</td><td>4-000-105</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>Forma 310</td><td>直接加熱または水ジャケット付き</td></tr></tbody></table>

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

2001年には、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の研究者は、彼らが最初に処理脂肪吸引細胞またはPLA細胞と呼ばれる脂肪吸引脂肪組織からの成体幹細胞の新たな集団の単離を記述した。それ以来、これらの幹細胞は、脂肪由来幹細胞またはASCをと改名され、幹細胞研究と再生医療の分野で最も人気のある成体幹細胞集団の1になるために行っている。数千件もの記事になりました骨再生、末梢神経修復および心血管工学など、再生様々な動物モデルにおいてASCの使用を記載している。最近の記事クリニックでのASCの用途の無数を記述するために始めている。この記事に示されているプロトコルは、手動および酵素的に化粧品の手順から得た脂肪吸引物、大量のからのASCを分離するための基本的な手順を説明します。このプロトコルは、簡単またはaccommodまでスケールアップすることができます脂肪吸引の量を食べ、abdominoplastiesや他の同様の手順で得られた脂肪組織からのASCを隔離するために適合させることができる。

上記のプロトコルの概要については、マニュアル、大容量の脂肪吸引サンプルからSVFを単離するための酵素法を説明しています。このSVF内にASCを含む多数の細胞集団である。多くの研究は、標準的な組織培養条件下でこのSVFを培養するASCの種類を主成分とする可能性が付着した線維芽細胞集団を選択することを提案する。これと一致して、我々は、培養されたSVFペレットが主要な混入細胞型、すなわち赤血球、平滑筋細胞および内皮系統1の細胞の本質的になることを、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光使用して、示されている。得られたASC集団は比較的外観が均質で線維芽細胞様細胞（ 図2）から構成される。これらの接着性のASCは、標準的な組織培養条件下で培養で良好に成長し、多数の分子および細胞Bに適してい倍加時間1適度な集団を示す生体内のin vitroおよび再生の研究で iology研究。しかし、単離されたSVFの不均一な性質に照らして、ASCの人口の検証が必要である。多くの研究は、 インビトロ</em...

2001年には、UCLAの研究者は、成体幹細胞の集団の単離を説明した脂肪組織から、脂肪由来幹細胞またはASCをと呼ばれる。この記事では、コラゲナーゼを使用して手動、酵素消化プロトコルを使用して脂肪吸引物からASCの分離の概要を説明します。

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

本手順の全般的な目的は、脂肪吸引物として得られた脂肪から脂肪由来幹細胞を単離することです。まず、手術用溶液を除去し、吸引物から混入した赤血球を洗浄することでこれを達成します。次に、洗浄した脂肪吸引物をコラゲナーゼで酵素消化し、幹細胞を遊離させます。次に、ストローマ血管分画（SVF）として放出された細胞を遠心分離によって回収します。最終ステップとして、上澄みを除去し、接着性のASCを選択および培養するためにSVF細胞を播種します。最終的に、これらの培養されたASCを骨、脂肪、および軟骨へとin vitroで誘導します。リネージ解析を用いることで、これらの細胞の多能性を確認することに加え、培養物内におけるこれらの細胞の存在を確認することができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞回収前の大量の脂肪吸引液を扱うというロジスティクス上の問題に苦労することがあります。滅菌済みのコラゲナーゼType I溶液と滅菌済みのコントロール培地を準備してください。吸引した脂肪組織を吸引容器に回収します。回収した脂肪組織を、滅菌済みの1Lガラスビーカーに注意深く移します。重力によって脂肪組織の層が分離したら、上層にオイル層がある場合はそれを吸引して除去します。また、下層の不純物を取り除きます。得られた脂肪組織層の量を測定してください。同量の滅菌1×PBSを加え、吸引に使用したピペットで撹拌します。2層に分離した後、10 milliliterのセロロジカルピペットを用いて上清を吸引します。脂肪層が黄金色になるまで、PBSで脂肪組織画分の洗浄を繰り返します。最後にもう一度上清を吸引し、脂肪組織画分のみを残します。ガラススピーカー内で行います。最後の洗浄後、最終的な吸引を行う前に、リッポ吸引層を5分間静置させます。フィルターユニットを用いて、滅菌済みのコラゲナーゼI溶液を調製します。脂肪分と同量の溶液を加え、滅菌フィルターでろ過します。次に、洗浄した脂肪分をコラゲナーゼ溶液に慎重に注ぎ、ボトルをしっかりと密閉します。その後、コラゲナーゼ脂肪混合液を37 °Cの恒温水槽で30分間インキュベートし、5〜10分ごとに緩やかに撹拌します。消化が進むにつれて脂肪組織層が滑らかになっているかを確認し、必要に応じて反応時間を延長して、固形脂肪塊を完全に溶解させます。消化後のコラゲナーゼ脂肪混合物が入ったフィルターユニットを70% ethanolで滅菌し、バイオセーフティキャビネットに戻します。次に、ストローマ血管分画を含む上清を25 milliliterずつ分注し、滅菌済みの50 milliliter遠心チューブに入れます。各チューブに25 millilitersのコントロール培地を加え、室温で5分間インキュベートしてコラゲナーゼを不活化させます。次に、バイオセーフティキャビネット内で1,200 ×gで10分間遠心分離し、ストローマ血管分画をペレットとして回収します。各チューブから上澄み液を吸引します。この際、最上層のオイル層と浮遊している脂肪細胞も合わせて吸引してください。次に、30 mLの調整培地を用いてSVFペレットを1本の遠心チューブにまとめ、さらに2本の新しい50 mL遠心チューブに等量ずつ分注します。遠心分離後、2つのペレットから上清を吸引除去します。赤血球（RBC）の溶血を行う場合は、これら2つのペレットをそれぞれ10 mLのRBC溶血バッファーに再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。遠心分離後、上清を吸引除去して、ストローマ血管分画（SVF）のペレットを得ます。これら2つのペレットを1本の新しい遠心チューブにまとめます。5～10 mLのコントロール培地を用い、新しい50 mL遠心チューブの上に設置した100 µmのメッシュフィルターを使用して、大きな組織粒子をろ過して除去します。次に、脂肪幹細胞を含むろ過分画を組織培養皿に分注します。その後、各ディッシュに適切な量のコントロール培地を補充します。培地で3〜4日間、交換せずに培養します。培養培地を吸引し、コンタミネーションした赤血球を除去するために、滅菌PBSで細胞を1回洗浄します。その後、培地を補充し、培養を継続します。大量の脂肪吸引サンプルからストローマ血管分画（SVF）を分離するために、この手動酵素法を使用します。得られた培養A SC集団は外見的に比較的均質であり、検証の最も一般的な手段として、線維芽細胞様細胞で構成されていることが示されます。規定の培養条件下でA SC集団をin vitro誘導すると、中胚葉、外胚葉、および内胚葉の系譜への分化が起こります。このようにin vitroで三胚葉分化能を持つことから、ASCは多種多様な再生モデルシステムに利用されています。脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への分化は、一般にASCを同定し、その多能性を確認するのに十分です。さらに、ASCは骨格筋原性および平滑筋原性細胞、外胚葉系の細胞、あるいは内胚葉系の肝細胞系へと分化させることも可能です。このビデオを視聴することで、脂肪組織から基質血管分画を分離する方法について十分に理解できるはずです。Turingにおいては、これはSCコンポーネントとなります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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成人再生療法のための機械的微細化

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根治的前立腺切除術後の勃起不全治療のための脂肪由来再生細胞の単離

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ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

ここでは、閉じたシステム装置を用いて酵素フリーの微細断片化をヒト脂肪組織に提示する。この新しい方法は、生体内移植、インビトロ培養、およびさらなる細胞単離および特性化に適した脂肪組織のサブミリメートルクラスターの取得を可能にする。...

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。...

脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。...

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

このプロトコルは、マウス脂肪組織から間質血管画分(SVF)を半自動分離して、脂肪前駆細胞を取得し、 in...

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

ここでは、処理時間&gt;90%短縮、高い細胞生存率、広範な適合性を特徴とする、脂肪由来幹細胞および脂肪細胞を効率的に単離する標準的な方法を提示します。...

豚脂肪組織から脂肪由来幹細胞および脂肪細胞の効率的な単離

学ぶ コラゲナーゼを用いた酵素処理法による脂肪由来幹細胞の手動分離技術。SVFの遠心分離と培養を通じて、再生医療研究に有用な多分化能を持つ細胞を効率的に取得する方法です。

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

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