人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

この手順の全体的な目標は、脂肪吸引物の形で得られた脂肪から脂肪由来の幹細胞を分離することです。これは、最初に外科的溶液を除去し、汚染された赤血球の吸引液を洗浄することによって達成されます。2番目のステップは、コラゲナーゼで洗浄されたリポ吸引液の酵素消化を介して幹細胞を放出することです。

次に、間質血管画分またはSVFの形で放出された細胞を遠心分離によって収集します。最後のステップは、上清とプレート、SVF細胞を除去し、付着性ASCの選択と培養を行うことです。最終的には、これらの培養ASCを骨、脂肪、軟骨に向けてin vitroで誘導します。

系統は、これらの細胞が多能性を確認するだけでなく、培養物中の存在を確認するためにも使用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、細胞採取前に大量のリポアスピリンを扱う物流のために苦労するでしょう。滅菌コラゲナーゼ1型A溶液と滅菌コントロール培地を調製します。

lippo吸引液を吸引容器に集めます。.リッポ吸引液を滅菌済みの1リットルのガラススピーカーに慎重にデカントします。リッポ吸引層が重力によって分離した場合、上部の油層が存在する場合は吸引します。

また、ボトムイネートを取り外します。得られた脂肪組織層の体積を評価します。等量の滅菌済みXPBSを加え、吸引に使用したピペットで攪拌します。

2つの層が落ち着いたら、10ミリリットルの血清ピペットを使用してinateを吸引します。脂肪層が黄色い金色になるまで、脂肪組織画分をPBSで洗浄し続けます。最後にもう一度イネートを吸引し、脂肪組織画分を残します。

ガラススピーカーで。リッポ吸引層が最後の洗浄後、最終吸引の前に5分間落ち着くのを待ちます。フィルターユニットで、滅菌コラゲナーゼ1溶液を調製します。

脂肪画分と滅菌フィルターと等しい容量を追加します。次に、洗浄した脂肪画分をコラゲナーゼ溶液に慎重に注ぎ、ボトルをしっかりと閉じます。次に、コラゲナーゼ脂肪混合物を摂氏37度の水浴で30分間インキュベートし、5〜10分ごとに穏やかに渦巻きながら、消化が進むにつれて脂肪組織層がより滑らかに見えるように評価し、必要に応じて反応時間を長くして脂肪の固形片を溶解します。

消化されたコラゲナーゼ脂肪混合物を含むフィルターユニットを70%エタノールで滅菌し、バイオセーフティキャビネットに戻します。今生殖不能な50ミリリットルの遠心分離管に間質の血管画分を含んでいるinateの25ミリリットルのアリコートをピペットで動かす。各チューブに25ミリリットルのコントロール培地を加え、室温で5分間インキュベートしてコラゲナーゼを不活性化します。

次に、Gの1、200倍で10分間遠心分離し、間質血管画分をペレットとしてバイオセーフティキャビネットに収集します。各チューブから上清を吸引します。上部の油層と浮遊脂肪細胞がこの上清で吸引されていることを確認します。

次に、30ミリリットルのコンディショニング培地を使用してSVFペレットを1つの遠心分離チューブに結合し、遠心分離後に2つの新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに均等に分割し、2つのペレットから上清を吸引します。RBC溶解が必要な場合は、これら2つのペレットをそれぞれ10ミリリットルのRBC溶解バッファーに再懸濁し、室温で10分間インキュベートできます。遠心分離後、上清を吸引して、間質血管画分のペレットを生成します。

これら2つのペレットを1つの新しい遠心分離チューブに結合します。5〜10ミリリットルのコントロール培地を使用して、新しい50ミリリットルの遠心分離チューブの上に置かれた100ミクロンのメッシュフィルターを使用して、大きな組織粒子をろ過することができます。次に、脂肪幹細胞を含むろ過された画分を組織培養皿に分注します。

次に、各料理に適切な量の制御を追加します。メディア文化。培地の交換なしで3〜4日間の細胞は、培養、培地、滅菌PBSで細胞を一度洗浄して汚染された赤血球を除去し、その後、培地を補充し、この手動酵素を使用して大量のリッポ吸引サンプルから間質血管画分を分離するときに培養を続けます。

得られた培養A SC集団は、外観が比較的均質であり、最も一般的な検証手段として細胞のような線維芽細胞で構成されています。定義された培養条件を使用してA SC集団をin vitroで誘導すると、中胚葉、外胚葉、および内胚葉系統に分化します。一方、in vitroの三胚葉層の可能性により、さまざまな再生モデルシステムにASCが使用されています。

脂肪形成細胞、骨形成細胞、および同遺伝子細胞への分化は、一般に、A SCを同定し、その多価性を確認するのに十分です。さらに、ASCは、外胚葉系譜または内胚葉性肝細胞系譜の骨格筋原性および平滑筋原性系統の細胞に分化することもできる。このビデオを見た後、Liposから間質血管画分を分離する方法を十分に理解しているはずです。

Turing の目的上、これは SC コンポーネントです。