機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

本手順の全体的な目的は、後続の機能研究および養子移行実験のために、マウスの骨髄から好中球を単離し、標識することです。まず、マウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を採取します。次に、赤血球を0.2%および1.6%の塩化ナトリウム溶液に順次懸濁させることで、浸透圧による溶血を行います。

次に、密度勾配遠心分離法により好中球を単離します。最終ステップとして、好中球をセルトラッカー染料で標識します。最終的に、フローサイトメトリーを用いて、さまざまなマウス組織に集積した養子移入好中球の数を決定できます。

血液や腹腔ではなく骨髄からマウス好中球を単離する主な利点は、定常状態および感染後のいずれにおいても、その後の機能研究や養子移送実験に十分な大量の細胞を骨髄から得られることです。マウス好中球の単離において、免疫磁気的選択やフローサイトメトリー（FACS）よりも密度勾配遠心法を用いる利点は、迅速かつ経済的であり、好中球の活性化を誘発する可能性のある抗体による標識を回避できることです。安楽死させたマウスに70% ethanolを噴霧した後、当研究室の技術者であるmuca swamiが手順を実演します。

動物の腹部中央の皮膚を切開し、下肢を含む動物の遠位部の皮膚組織を取り除きます。次に、ハサミを用いて動物の後肢から筋肉を切り離し、大腿骨頭を破損させないように注意しながら、股関節からACE beumを慎重に脱臼させます。その後、ハサミまたはメスを使用して、大腿骨と脛骨から残りの筋肉を取り除きます。

骨端を破損させないように注意しながら、膝関節で脚の骨を分離し、氷冷RPMI 1 6 4 ohを含むペトリ皿に骨を入れます。FBSと抗生物質を添加します。皿を組織培養フードへ移し、新しいペトリ皿の中で各骨の外側を70%ethanolで滅菌します。

約10〜15秒後、氷冷した滅菌PBSで3回繰り返し洗浄し、各骨の表面からエタノールを洗い流します。次に、各骨から骨端を切除し、新しい滅菌ペトリ皿に入れます。続いて、10 mLのRPMIを満たした12 ccシリンジに25ゲージの針を取り付けます。

FBSとEDTAを添加します。次に、各大腿骨・脛骨ペアの骨幹の両端から骨髄細胞を、100 µmフィルターを装着した50 mLスクリューキャップ付きFalconチューブに洗い出します。針先で骨の内面を掻き出してください。

骨が白くなったとき、細胞が十分に除去されたことになります。次に、メスを使用して骨端を0.5～1 mmの小さな断片に切り分け、2.5 mLのBioPureピペットチップの背面を使用して、それらを100 µmフィルターを通して押し潰します。回収した細胞を427 ×g、4 °Cで7分間遠心分離した後、20 mLの0.2% sodium chlorideで約20秒間、赤血球を洗浄します。

次に、20 mLの1.6%塩化ナトリウムで溶解を停止させ、細胞を遠心分離して回収し、FBSおよびEDTAを添加したRPMI 1640でペレットを再懸濁します。細胞数を計測し、再度遠心分離して洗浄したペレットを、氷冷した滅菌PBSを用いて1 mLあたり100 × 10⁶ cells以下の密度で再懸濁します。次に、18～26°CのHOPA 1119を3 mL、15 mLコニカルチューブに分注し、そこに18～26°Cの溶液3 mLをゆっくりとオーバーレイします。

Ficoll-Paque 1 0 7 7を使用します。2つの密度の溶液を調製した直後に混ぜ合わせないよう注意しながら、骨髄細胞懸濁液をFicoll-Paque 1 0 7 7の上に慎重に層状に重ねます。Brakeなしの条件で、834 ×g、25 °Cで30分間遠心分離し、Ficoll-Paque 1 1 1 9層と1 0 7 7層の界面から好中球を回収します。回収した好中球をRPMI 1 6 40、FBS、および抗生物質で2回洗浄した後、37 °Cに予熱したPBSを用いて、5 × 10⁶ cells/mLの濃度で細胞を再懸濁します。

細胞数をカウントした後、各実験サンプルの少量を分注して確保し、フローサイトメトリーで純度と生存率を測定します。次に、残りの好中球を最終濃度 5 µM のセルトラッカー染料で、37 °C の振盪水槽内、暗所で 10 分間ラベルします。最後に、染料の相互汚染を防ぐため、FBSおよび抗生物質を添加した氷冷 RPMI 1640 で細胞を 2 回洗浄し、その後、後続の競合的再集積研究のために、異なるラベルを施した好中球集団を混合します。ここでは、非感染の C57BL/6 マウスから骨髄分離および密度勾配遠心法で分離した好中球の代表的なフローサイトメトリープロットをこのパネルに示します。初期ゲーティングは、Histopaque 1119 と Histopaque 1077 の界面から回収した骨髄細胞に使用されました。

前方散乱光（forward scatter）および側方散乱光（side scatter）を用いることで、密度勾配分離された好中球の純度が90%を超え、養子移殖後少なくとも4時間は生存率が95%を超えていることが実証されています。CellTracker DIAでラベル化した好中球は、フローサイトメトリーを用いてマウスの様々な組織内で追跡可能です。例えば、本実験で示したCandidaに感染したレシピエントのC57BL/6マウスの血液、骨髄、および腎臓において、生存しているCD45⁺ Ly6G⁺ CD11b⁺細胞をゲートすることで、養子移殖されたCMTMRラベル好中球を、レシピエントマウスのCMTMR陰性かつPE陰性の固有の好中球から、PEの発現によって区別することができます。

マウス骨髄好中球の分離および標識の手法を習得すれば、3時間で完了させることができます。