遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

本実験の全体的な目的は、標的となるGタンパク質共役受容体に単一の情報プローブを導入し、シグナル伝達複合体の構造およびダイナミクスの研究を促進することです。これは、発現させたGPCRに非天然アミノ酸のzeto、フェニルアラニン、またはzeto feeを組み込むために必要な翻訳機構を発現させるプラスミドを細胞に導入することで達成されます。その後、GPCRのzeto fee変異体を3つの異なる方法で適用し、受容体の構造と機能を調査することができます。

まず、GPCRにおいて光活性化架橋剤としてzeto feeを使用することで、トリチウム標識リガンドの結合部位の特定が可能になります。次に、zeto feeを反応性化学ハンドルとして利用し、バイオ直交標識化学を介してペプチド共役体や蛍光プローブをGPCRに結合させることができます。生細胞および生化学的手法に基づき、標的写真架橋、標的エピトープタグ付け、およびGPCRの蛍光標識における分子プローブzeto feeの利用を示す結果が得られています。光親和性リガンドの使用やシステイン標識などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、標的受容体の既知の位置に、生物学的に不活性で反応性を有する非天然アミノ酸であるP zeto phenol alanineを部位特異的に導入できる柔軟性にあります。

この手法は、天然の膜環境における受容体-リガンド複合体の相互作用部位のマッピングや、バイオ直交標識に適したGPCR内の部位を特定することによる単分子蛍光研究の促進など、GPCRシグナル伝達分野における重要な疑問への解答に役立ちます。さらに、この手法はGタンパク質共役受容体の分子メカニズムに関する知見を提供できるほか、さまざまな細胞および膜タンパク質などの他の系にも適用可能です。本実験を開始する前に、HEK 293T細胞を、10%胎児牛血清を添加したKO改変イーグル培地を用い、37 °C、5% CO2雰囲気下で維持してください。

テキストのプロトコルに従い、Lipofectamine Plus試薬を用いて、10 cmプレートでコンフルエンシーが60〜80%に達した細胞にG pcr、r CD、NAをトランスフェクションします。翌日、増殖培地を10% FBSおよび0.5 mM feeを含むDMEMに交換します。トランスフェクションから48時間後、テキストの記載に従って発現解析を行います。

このビデオの後半で説明する写真、架橋、またはラベル化の手順に進んでください。トランスフェクションの48時間後に、細胞から培地を吸引し、4 mLの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に交換します。細胞をプレートから剥離させるため、37 °Cで15分間静置します。その後、1×PBSで細胞を再懸濁してFalconチューブに移し、1500 RPMで2分間遠心分離します。

細胞をペレット化するために上清を吸引し、本文のプロトコルに従って調製した、飽和結合濃度のトリチウム標識リガンドを含む1x Hanks平衡塩溶液で細胞ペレットを再懸濁します。受容体とリガンドの複合体形成を確実にするため、特定の受容体およびリガンドに応じた必要な時間、ペレットを37 °Cでインキュベートします。次に、細胞懸濁液を24ウェルまたは96ウェルプレートに移します。

次に、365 nanometersの紫外線ランプを用いて、4 °Cで15分間zeto feeを光活性化させます。この際、サンプルの加熱および細胞溶解を防ぐため、プレートを氷上に保持してください。光活性化後、細胞をエッペンチューブに移し、遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、解析に進みます。

細胞ペレットを溶解バッファーで再懸濁し、4°Cで1時間インキュベートします。次に、細胞溶解液を16,000 ×gで10分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移す前に、1D4モノクローナル抗体修飾SROs 2Bレジンを上清に加え、4°Cで一晩インキュベートし、設計したC末端1D4モノクローナル抗体エピトープを用いてGPCRを免疫精製します。翌日、ビーズを溶解バッファーで数回洗浄します。1% SDSを用い、37°Cで1時間振盪しながらサンプルを溶出させます。

EENTの一部をシンチレーション液を含む15 milliliterバイアルに移し、ベータシンチレーションカウンターで測定して、受容体に対するトリチウム標識リガンドの特異的結合量を定量します。残りの精製EENTを、標準的なプロテインラダーを用いた4〜12% SDSゲルによる標準的なゲル電気泳動で分離します。その後、セミドライ法を用いてA-P-V-D-F膜に転写し、イムノブロッティングを行います。

0.05% Tween 20を含むTBSバッファーおよび5%ミルクを用いてPVDF膜をブロッキングします。1Dモノクローナル抗体、次いでHRP標識抗US IgG二次抗体を用いて膜をプローブし、フルレングス受容体の発現を確認します。その後、強化化学発光試薬で膜を処理します。

膜をオートラジオグラフィーフィルムに露光し、バンドを可視化します。次に、カミソリで膜を切断して各サンプルレーンを分離し、特定の分子量マーカーの位置で切断します。切り出した膜の断片をシンチレーション液の入ったバイアルに移し、ベータシンチレーションカウンターで計数して、各膜断片中のトリチウム量を定量します。

GPCRとリガンドの合計に等しい見かけの分子量においてトリチウムを検出することで、正の光架橋を同定します。細胞の洗浄およびカウント後、96ウェル高吸着クリアボトムプレートを、1ウェルあたり100 µLの10 µg/mL Poly-D-lysineで前処理し、室温で30分間インキュベートします。

その後、XPBSで繰り返し洗浄し、自然乾燥させた後、トランスフェクトした細胞を1ウェルあたり60,000〜80,000個の密度で200 microliters分ずつ96ウェルプレートに播種します。その後、37 °C、5% CO2雰囲気下に置きます。翌日、

細胞を標識するための準備を行います。1ウェルあたり100 µLのXPBSを用いて細胞を3回緩やかに洗浄し、成長培地を完全に除去します。テキストプロトコルに記載されている通り、50から200 µMのflag Tri AAL PHOSPHINE標識試薬を含むバッファーを調製します。

各ウェルに60 µLずつ分注します。ラベル処理およびバッファーを用いないウェル群も用意してください。また、zeto feed GPCR変異体と比較するための野生型GPCRコントロールも含めてください。

インキュベーション後30分から4時間の間に、プレートを37°Cに戻します。未反応のラベルを完全に除去するため、1ウェルあたり100 µLのブロッキングバッファーで細胞を3回洗浄します。次に、1ウェルあたり100 µLの4%パラホルムアルデヒドを細胞に添加し、室温で20分間インキュベートします。

ブロッキングバッファーで細胞を3回洗浄します。まず、一次抗体を氷上で1.5時間インキュベートし、標準的な細胞表面EISAプロトコルに従って、標識受容体および受容体発現の検出を行います。続いて、二次抗体を室温で1時間インキュベートします。

次に、flagのflagペプチドエピトープを検出するために、希釈したAnti-Flag M two抗体を100 µL添加します。また、ラベル処理を行っていないウェルをネガティブコントロールとしてプローブします。

次に、野生型または$\text{CCR5}$$\text{GPCR}$の細胞表面発現を決定するため、希釈した抗$\text{CCR5}$抗体を別々のウェルセットに添加します。細胞をブロッキングバッファーで3回洗浄し、100 $\mu\text{L}$の希釈した$\text{HRP}$標識抗$\text{US IgG}$抗体とともにインキュベートします。

ブロッキングバッファーで細胞を5回注意深く洗浄した後、50 µLの検出バッファーを加え、室温で15分間インキュベートします。最後に、励起波長530 nm、蛍光波長590 nmで、蛍光マルチウェルプレートリーダーを用いてスペクトルデータを収集します。野生型またはzeto feeを発現している回収済み細胞10 million個を溶解し、標識手順を開始します。

1 mLの可溶化バッファー中で、4°Cで1時間、桿体オプシンの分散を行います。細胞溶解物を15,000 ×gで10分間遠心分離し、上清画分を回収します。次に、設計されたC末端1D4エピトープを用いて受容体を捕捉するため、100 µLの1D4モノクローナル抗体修飾Spheres 2 Bレジンを添加します。

4°Cで12時間インキュベートした後、テキストプロトコルに従ってレジンを3回洗浄します。次に、0.1 mMのフルオレセインホスフィンを加え、全量を0.3～0.5 mLとして、免疫アフィニティマトリックスに固定化した受容体を標識します。室温で12時間インキュベートした後、上清を除去して遠心分離します。レジンを洗浄して未反応の標識を除去し、100 µLのElianバッファーを用いて氷上で1時間インキュベートし、標識受容体を溶出させます。

還元条件下でSDS-PAGEを行い、ラベル付けした試料を分離します。ゼトフェイGPCRをインゲル蛍光法でラベル付けする前に、ゲルをPBSで短時間洗浄します。共焦点蛍光スキャナーを用い、488 nm波長のレーザーでフルオレセイン修飾受容体を検出します。

アンバーコドン抑制技術を用いて、非天然アミノ酸変異導入法により A-G-P-C-R の C 部位に分子プローブを部位特異的に導入しました。その後、光架橋技術を用いて、生細胞内における GPCR リガンド複合体の構造的側面を調査することが可能です。トリチウム標識した放射性小分子リガンドを用いて、G-P-C-R-C-C-R five 上の結合部位を特定しました。

この例では、zeto feeを発現し、トリチウム標識したRavi RockとプレインキュベートしたCCR fiveバリアント細胞にUV照射を行うことで、リガンド上の高感度放射性タグを用いて同定可能な共有結合的に架橋された複合体が形成されます。

CCR5上のいくつかの部位のうち、テストしたロイシン28およびトリプトファン86のゼトフェーは、図に示すように、有意に高いシンチレーションカウントを伴ってトリチウム標識Ravi Rockへの光架橋が可能であった。野生型受容体では、放射性リガンドへの架橋は見られなかった。バイオ直交標識化学を用いることで、部位特異的にゼトフェーを修飾することができる。

GPCRのバリアント解析の一つの戦略として、ペプチド結合ラベルであるflagペプチドを用いて、生細胞内のA-G-P-C-Rを標的としたエピトープタグ付けを行う手法があります。Tri AAL PHOSPHINE標識試薬を使用して、zeto feeを特異的かつ選択的に修飾します。ここで示すCCR5バリアントは、flagペプチドでタグ付けされた部位を特定するために用いられた、高感度で多段階のEISA検出戦略による代表的なデータです。

CCR5の検討した全部位において、ゼトフィーを調査しました。CCR5変異体を細胞表面に発現させたところ、その約半分で標的エピトープタグ付けに成功しました。野生型CCR5をエピトープタグ付けの陰性対照として用いたところ、Anti-Flagシグナルが認められませんでした。別の戦略として、界面活性剤で可溶化したゼトフィーG PCRを、anti-1D4モノクローナル抗体が結合したSpheros 2Bレジンなどの免疫親和性マトリックスに固定し、fluoro-4結合ラベルで標識しました。

Ingel蛍光画像は、GPCRオプシンが期待通り3つの異なる部位で正常に蛍光標識されたことを示しています。野生型オプシンでは、受容体の期待される分子量に蛍光バンドが見られないことから、バックグラウンド標識がなかったことがわかります。この手順を行う際は、開発後、特異的に導入した酸AOLアラニンを用いて、標的GPCRの完全なレンズ発現を確認することを忘れないでください。

この手法は、受容体生物学分野の研究者が、あらゆる受容体リガンド複合体の探索や標的受容体の標識を行うための道を切り開くものです。反応性プローブとして、部位特異的に導入された非天然アミノ酸であるp-ゼトフェノールアラニンを使用します。このビデオを視聴することで、非天然アミノ酸の新生を利用してGPCRに分子プローブを導入し、標的フォトクロスリンキングおよびバイオ直交標識技術を用いてGPCRシグナリング複合体の構造およびダイナミクス研究を促進する方法について、十分に理解することができます。