ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

この手順の全体的な目標は、プロテオミクス分析のために、フォーマル材料、固定材料、パラフィン包埋材料、またはFFPE材料からペプチドを生成し、事前に分画することです。これは、マイクロダイセクションによる目的の組織の単離と、それに続く細胞溶解によって達成されます。2つ目のステップは、サンプル処理によってペプチドを生成することです。

マルチ酵素分解フィルターの使用により、サンプル調製を支援します。次に、ペプチドのトリトファン蛍光を測定することにより、ペプチドを定量します。最後のステップは、ペプチド分画のための強陰イオン交換体ベースの分離技術を使用したペプチドの分画です。

最終的に、調製されたサンプルは、微量の材料から10, 000タンパク質の深さまでのプロテオームの分析を可能にします。ゲル化や溶液消化などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、レーザーマイクロディスクト細胞などの微量の臨床サンプルに適用できることです。この方法では、完全性と純度の高いペプチドを含むサンプルが得られます。

ヒト組織や疾患のプロテオミクス探索を促進するものは何ですか?プロトコル全体は、過去に開発および公開された手法で構成されています。これらには、高回収率のファスプ、ピペットチップ化、およびトリプトファン蛍光に基づくペプチド含有量の決定が含まれ、手順がMrs.Catina

私たちの研究室の技術者を落ち着かせますミクロトームでマイクロディスクトカット切片の組織スライスを準備し始めます。スライスの厚さはサンプルによって異なります。通常、マイクロダイセクションは7〜10マイクロメートルのスライスでうまく機能します。

メンブレンスライドにUVライトを45分間照射した後、切片を取り付けてから37°Cで2時間乾燥させます。キシレンの連続した瓶で2分半と1分半の間、2回連続してインキュベーションすることにより、取り付けられたセクションをパリゼーションします。次に、セクションを連続して水分を補給します。

無水エタノール、70%エタノール中で1分間インキュベートします。そして最後に、水です。切片をマイヤーヘマチンで20秒間染色した後。

水で1分間すすぎ、風乾させます。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムを使用して、目的の細胞集団を収集します。手のひら装置を使用する場合は、10ナノリットルの微小解剖組織に対して3マイクロリットルの組織溶解緩衝液を使用して、接着キャップにサンプルを収集します。

キャップ内のマイクロ解剖材料にバッファーを塗布し、チューブを閉じます。短時間の遠心分離後に懸濁液を回収します。次に、マイクロを解剖した組織を摂氏99度で加熱ブロックに入れ、1時間攪拌します。

粗抽出物を16, 000 Gsおよび18°Cで10分間遠心分離することにより清澄化します。限外ろ過ユニット内で、最大50マイクロリットルの清澄化されたライセートと200マイクロリットルのUA溶液を混合します。次に、14, 000 GSで遠心分離し、溶液がフィルター内に残る10マイクロリットル未満になるまで遠心分離します。

通常、このステップには10〜15分の遠心分離が必要です。次に、UA溶液の200マイクロリットルを限外ろ過ユニットにピペットで移動させ、遠心分離機にかけます。前回と同様に、50マイクロリットルのI A A溶液を限外ろ過ユニットにピペッティングする前に、収集チューブを空にします。

サーモミキサーで600RPMの室温で1分間混合し、遠心分離します。前回と同様に、このビデオに付属のテキストプロトコルで概説されているように、限外ろ過と遠心分離の手順を続けます。次に、ろ過ユニットを新しい収集チューブに移します。

エンドプロテイナーゼlic Cを含む消化緩衝液40マイクロリットルをピペットで、サーモミキサーで600RPMで1分間混合します。ユニットを摂氏37度の湿ったチャンバーで18時間インキュベートします。前と同じようにフィルターユニットを遠心分離した後、DBバッファーの160マイクロリットルをピペットで取り出し、遠心分離機にかけます。

プールされた流れが通過するフィルターユニットは、エンドプロテアーゼlic C.Nextによって放出されたペプチドを含み、テキストプロトコルに記載されているようにトリプティクペプチドを収集します。タンパク質消化物中のペプチド含有量の測定は、トリプトファン残基が溶媒によくアクセスしやすいため、希釈バッファーで行うことができます。ペプチドを定量するには、まず0.2ミリリットルのアッセイバッファーDBをクォーツQ獣医にピペットで入れます。

次に、Q vetを機器のqveホルダーに入れ、ブランクの発光スペクトルを記録します。トリプトファン標準溶液の1マイクロリットルアリコートをQ vetに追加し、バッファーdbと穏やかに混合することにより、0.1マイクログラムステップを使用して検量線を調製します。Q vetを洗浄した後、サンプルをピペットで挿入し、サンプルスペクトルを記録します。

分画前のテキストプロトコールに記載されているように、タンパク質およびペプチド濃度の計算に進みます。EMを6層積み重ねてSAXチップカラムを準備します。イオンメンブレンは、一般的な0.2ミリリットルのピペットチップに装着してお召し上がりください。サンプルごとに2つのSAXチップカラムを作成します。

次に、M4C18を3層重ねてステージチップを準備します。0.2ミリリットルのピペットチップで、サンプルごとに6つのステージチップを作成します。はじめましょう。

分画では、ly C による消化で得られたペプチド溶液を 0.2 mL の BRI および Robinson Universal バッファーで希釈します。pH 11 では、トリプシンによる消化で得られたペプチド溶液を 0.2 mL の英国製および Robinson Universal バッファーで同様に希釈します。pH 5 では、洗浄前に遠心チューブアダプターの蓋で SAX チップカラムを組み立て、テキストプロトコールで概説されているように、SAX チップカラムと C 18 ステージチップを平衡化します。

次に、C18ステージのチップにSAXチップコラムを組み立てます。サンプル溶液を平衡化SAXチップカラムにロードし、カラムを5, 000 Gで3分間遠心分離します。ピペットチップカラムを希釈したサンプル0.1ミリリットルで洗浄します。

5, 000 Gs.Transferで遠心分離によって流れを促進し、SAXチップカラムを次のC 18ステージチップに移し、テキストプロトコルに記載されているようにペプチドを溶出し続けます。C 18ステージチップを0.05ミリリットルのバッファーAで洗浄した後、0.05ミリリットルのバッファーBでフラクションをバイアルに溶出し、後で質量分析計の代表者と組み立てられた液体クロマトグラフィーシステムにサンプルを注入するために使用されます。タンパク質の抽出と消化の結果を以下に示します。

10マイクロメートルのスライスから25平方ミリメートルの微小解剖領域に対応する250ナノリットルの組織の溶解は、エンドプロテアーゼスライスCとトリプシンを用いた絶食形式での2段階連続消化に続いて、約45マイクログラムの総タンパク質の収量をもたらします。ここに示されているのは、ペプチド含有量の代表的な蛍光測定値であり、トリトファン標準試料とサンプルのスペクトルは350〜360ナノメートルで最大を示しています。蛍光の強度は、トリトファン含有量に比例します。

このビデオを見た後、マイクロダイセクション技術、サンプル処理、およびペプチド分画を使用してプロテオミクス分析のために高組織からサンプルを準備する方法についてよく理解しているはずです 一度習得すると、この技術は3〜4時間に加えてタンパク質の消化不良に必要な時間で行うことができます。この手順を試みている間、作りたての組織スライスを使用することを忘れないでください その開発後。この技術は、プロテオミクスの分野の研究者が、固定材料とパレン埋め込み材料にアルバルを使用して、組織や細胞のプロテオーム、およびヒトの異常を探求する道を開きました。