末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

本手順の総合的な目的は、喉頭神経損傷モデルにおける嗅細胞および鞘細胞を用いた細胞移植モデルを提示することです。まず、反回喉頭神経を切断し、吻合を行います。次に、嗅粘膜または嗅球から得られた嗅細胞および鞘細胞を移植します。

その後、手術から2〜3ヶ月後に、喉頭鏡検査および筋電図によって動物の評価を行います。最後に、組織学的研究のために反回神経を分離します。最終的に、喉頭鏡検査、筋電図、および組織学的測定を通じて、嗅球細胞および鞘細胞が反回神経の軸索再成長と声帯の機能回復を改善することを示す結果を得ることができます。

この手法を用いることで、軸索成長の測定や回復機能の定量化など、末梢神経損傷の分野における重要な課題を解決することができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、反復的な神経吻合にマイクロサージェリー（微小外科）の技術が必要となるため、習得に苦労することがあります。記載の手順に従って、GFPでラベル化した嗅球（OB）および嗅粘膜（OM）の初代培養細胞を調製した後、すべての器具をオートクレーブで滅菌し、手術の準備を行います。

ケタミンとクロルプロマジンの腹腔内注射によってラットを麻酔させた後、足指つまみ試験（toe pinch test）を行い、鎮静レベルを確認します。手術部位を剃毛し、ラットを背臥位に固定して、アルコールとベタジン溶液を用いて交互に皮膚を消毒します。その後、滅菌済みの手術環境を整え、手術中は終始滅菌操作を維持してください。

メスを用いて、内側頸皮に2 cmの切開を加えます。次に、内側白線に沿って、下甲状舌骨筋間に起立性リトラクターを挿入し、下甲状舌骨筋を垂直に切開します。喉頭を露出し、次に反回神経（RLN）を露出させます。

次に、手術用顕微鏡下で、マイクロシザーを用いて第7気管輪のレベルで神経を完全に切断し、11 T縫合で1点固定します。移植の直前に、喉頭を脱神経するために吻合を行います。0.05%trypsin EDTAを用いて、ディッシュからOBおよびOM細胞を除去します。

次に、細胞を 432 G で 5 分間遠心分離した後、加温した培地 5 mL を加えて消化を停止させます。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を算出し、本モデルにおける細胞濃度を調整します。マイクロ遠心チューブに入れた 30 µL の DMEM/F12 中に 1.2〜6 × 10⁶ 個の細胞を用いました。細胞と、成長因子および低濃度Matrigelの比率を 1:2 に調製し、移植の直前に氷上に置きます。

チューブを氷から取り出し、保持して混合物を温めます。ピペットを使用して、細胞Matrigel溶液を吻合部位に滴下し、混合物が固まって損傷神経上で自己組織化するまで待ちます。4-0縫合糸を用いて筋肉と皮膚を縫合します。

ラットを個別のケージに入れ、保温ランプの下で24時間保持します。手術から約2か月後、麻酔をかけた後、その後5日間にわたって鎮痛剤を投与します。本ビデオの前半で述べた通り、足指へのピンチテストを行い、鎮静状態にあることを確認してください。

ラットを背臥位にし、30度のビデオ喉頭鏡を挿入します。各記録で同じ視野を再現できるよう、喉頭が最もよく見えるように調整します。後交連、OIDの声帯突起に挿入される右声帯、およびOIDの声帯突起に挿入される左声帯などの解剖学的指標を確認します。

最大外転と最大内転を連続して行う動作を3回記録します。喉頭機能を分析するために、声帯の最大外転と最大内転の間の移動量の差を測定し、絶対角度移動量を決定します。また、移動振幅を測定してダイナミックスコアを決定し、不随意運動（シンキネシス）および奇異性運動を測定してファンクショナルスコアを決定することで、筋電図検査を実施します。

反回神経吻合術で示された通りに喉頭と気管を露出させた後、ラットのハムストリング筋に電極を配置します。輪状甲状軟骨を露出させます。次に、マイクロ鋏を用いて輪状甲状軟骨を開き、後輪状甲状筋（PCA筋）を露出させます。

自発呼吸下の動物の筋肉にモノポーラ針電極を挿入します。収集システムを用いて、PCA筋の電気的な筋活動を記録します。以下のスケールを用いて0から3までの定性的スコアを割り当て、筋活動の豊富さと呼吸との同期性の観点から分析します。

0は吸気中に増加が見られない、試行されていないトレースを意味します。1は吸気とともに増加するリズム付きのトレースを意味し、2はより活発な活動を伴うリズム付きのトレース、そして3は非常に豊かなリズム付きのトレースを意味します。これは、最大意図的活動に類似した干渉パターンを構成します。

次に、RLNは非常に細いため、損傷を避けるために迷走神経を露出させ、そこに電極を取り付けて刺激を行います。PCA筋肉における潜時および電位持続時間を記録します。最後に、顕微鏡下でペントバルビタールの過剰投与により動物を安楽死させた後、吻合部を確認し、吻合部から喉頭の間のRLN遠位端を縫合して切除します。

嗅覚、粘膜および嗅球の初代培養細胞を移植した後、ここに示すテキストプロトコルに従って組織学的解析を行います。呼吸中のPCA筋から得られたEMG波形の例です。対照群の動物は、吸気時に増加する豊かな筋電気活動を示しましたが、Rerated群では認められませんでした。この図では、トルイジンブルー染色によるRLNの組織学的解析により、正常、再神経支配、および移植後の動物における典型的な線維プロファイルが示されています。

この測定により、ここに示すように、有髄線維の数、線維の平均サイズ、および髄鞘の平均厚さを定量化することができます。組織学的解析を完了するため、坐骨神経への神経内移植後、GFP陽性細胞のトラッキングを行いました。

RLNではサイズが小さいため神経内移植が困難であることから、本部位が選択されました。反回神経の手端吻合は、適切に処置されれば15分で完了します。これらの手法により、末梢神経損傷分野の研究者がラットモデルを用いて細胞移植の利用を探索するための道が開かれました。

このビデオを視聴することで、反回神経損傷モデルにおける細胞移植の方法と、筋電図、内視鏡検査、および組織学的測定を用いた声帯の機能回復の評価方法について、十分に理解することができます。