Name: 宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶ画像サイトメトリーを用いた宿主細胞内の病原性酵母の定量化法。マクロファージを用いた真菌感染症研究において、従来のCFU法に代わる迅速で効率的な代替手法を確立し、宿主と病原体の相互作用解析を促進する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1。 H.とマクロファージの感染カプスラーツム、C.アルビカンス <ol><li> 16感染前にHR、24ウェルプレート中で所望の密度でシードマクロファージ。このプロトコルでは、ウェル3.0×10 5細胞の密度/を使用した。 </li><li>感染の所望多重度（MOI）で対数増殖期における真菌細胞を追加します。このプロトコルは、MOI（ - 5.0 0.2）の範囲を収容することができます。 H.とRAW264.7マクロファージの感染カプスラーツム 、私たちは、MOI 0.2を使用していました。 </li><li>食作用を可能にするために1.5時間後に、細胞外の菌を除去するためにPBSでマクロファージを三回洗浄する。 </li><li>試料分析の前に、所望の数の時間インキュベートする。 （我々の実験では0.2）、低MOIで感染したマクロファージ細胞は数日間生存したままで、そしてサンプルは、およそ12〜24時間を分析することができる。 </li></ol> 2。マクロファージ溶解<ol><li>マクロファージ細胞から真菌を解放するには、メディアを取り出し、PBSで3回洗浄し、0.5ミリリットル滅菌水を追加します。これらの条件下では、マクロファージが溶解され、真菌細胞は、そのまま残ります。 </li><li>室温で5分間インキュベートする。 </li><li>滅菌チューブにライセートを移し、氷上に保つ。 </li><li>別のチューブに20μlのライセートを移し、その後20μlのAO / PIソリューションを追加します。ステップ5に直接進んでください： &quot;画像サイトメトリー分析のためのサンプルの準備&quot; </li></ol> 3。 CFUメッキ<ol><li>メディアにおける溶解物の10倍希釈（ステップ2.3から）実行します。 </li><li> HMM-アガロースプレート上重複の各希釈のプレートを100μl、、。 7-8日、5％CO 2で37℃で加湿チャンバー内のプレートをインキュベートする。 </li><li>手動で100の最小値と1,000異なるコロニーの最大値を表示するプレート上のコロニーを数える。 </li></ol> 4。ライブマクロファージ内の菌の可視化<ol><li>ライブマクロファージを収集するには、PBSで細胞を3回洗浄する。 4℃で30分、0.5 mlのPBSとインキュベートを追加</li><li>組織培養ウェルからマクロファージを削除するには、軽く数回上下にピペッティングし。滅菌チューブに液体を移し、氷上に保つ。 </li><li>別のチューブに20μlのサンプルを転送し、次に20μlのAO / PIソリューションを追加します。 &quot;画像サイトメトリー分析のためのサンプルの準備&quot;：ステップ5に直接進んでください。 </li></ol> 5。画像サイトメトリー分析のためのサンプル調製<ol><li>徹底的にターゲットサンプルをピペットで、その後使い捨て細胞計数室にサンプルを20μlを移す。 </li><li>細胞は、30秒のためにチャンバー内に定住することができます。 </li><li>画像サイトメーターにカウントチャンバーを挿入します。 </li></ol> 6。 Cellometer機器設定<ol><li>システムにVB-535から402とVB-660から502まで、それらが所定の位置にロックされていることを確認してください：蛍光光学モジュールを挿入します。 <ol><li> VB-535から402（475 nmで励起、535 nmでの発光）がアクリジンオレンジおよびGFPの検出に用いられる。 </li><li> VB-660から502（excitati上で540nmで、660nmの放射）を、ヨウ化プロピジウムの検出に用いられる。 </li></ol></li><li>画像サイトメーターの電源を入れ、付属のソフトウェアを開きます。 </li></ol> 7。 Cellometerソフトウェアのセットアップ<ol><li>プリセット &quot;アッセイタイプ&quot;とアッセイドロップダウンメニューで &quot;セルの種類&quot;を選択します。 <ol><li>生存率については、アッセイは、アクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム検出のために最適化されている。 </li><li> カンジダ·アルビカンス感染の検出のために、アッセイはGFP検出のために最適化される。 </li></ol></li><li>上部の &quot;オプション&quot;を選択し、 &quot;を取る背景画像&quot;をクリックし、操作を完了することができます。 </li><li> &quot;プレビュー明視野像&quot;をクリックしてください。 </li></ol> 8。画像の取得手順<ol><li>画像サイトメーターに準備試料室に挿入します。 </li><li>フォーカスノブを使用して、フォーカスを調整します。 </li><li>一度ピントで、 &quot;カウント&quot;をクリックし、画像取得操作を完了することができます。 </li><li>レモ使い捨てカウンティングチャンバーをもらって適切に処分する。 </li></ol> 9。画像データ解析<ol><li>濃度及び生存率測定<ol><li>カウントが完了すると、標的細胞の濃度及び生存率を結果ページに表示される。 </li><li> カンジダ·アルビカンス感染実験におけるGFPの細胞集団の解析のためにFCSエクスプレス4にデータをエクスポートするには、 &quot;エクスポート&quot;をクリックしてください。 </li></ol></li><li> カンジダ感染細胞のFCSエクスプレス分析<ol><li> FCSエクスプレス4へ &quot;。NXDAT&quot;ファイルをインポートし、蛍光ヒストグラムの結果をプロットします。 </li><li> カンジダ·アルビカンス感染細胞の集団のパーセンテージを決定するためにヒストグラムに細胞集団ゲートを適用する。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li>
<li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li>
<li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+yeast%3A+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li>
<li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li>
<li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis%2C+mitochondrial+potential%2C+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
<li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micro.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

作家レオ李英ちゃんとベンジャミンパラディはNexcelomバイオサイエンスLLCの従業員です。

イメージサイトメトリーにより、ユーザは高品質の画像をキャプチャし、特殊なソフトウェアを使用して、細胞の迅速な定量化を行うことができる。病原微生物学分野における画像メトリーの適用つの潜在的課題は、カウントされる微生物は、哺乳動物宿主細胞を含む細胞の混合集団中に存在することである。ここでは、イメージサイトメトリーをin vitroマクロファージ感染中に生存可能な病原性酵母の定量に使用することができることを実証している。我々の方法論は、in vitroでマクロファージ感染アッセイ間に観察真菌の増殖と生存に忠実に再現するの動向だけでなく、伝統的なCFUアッセイ13に比べて改善された感度を表示するだけでなく。 酵母細胞の定量化のためのCFU列挙またはフローサイトメトリーのいずれかと比較した場合、画像メトリは、いくつかの実用的な利点があります。 CFUのをメッキすると、研究室の労働者はいくつかのプレートdilutマスト非常に労働集約的なことができ、各プレート上の細胞の可算数を確保するためのイオン。イメ...

彼らのホストおよび/または宿主細胞に伴う病原性真菌の研究は、多くの場合、時間経過を介して、または別の感染条件下で実行可能な真菌細胞の定量化を必要とする。コロニー形成単位（CFU）の列挙は、生菌数を測定したが、この手法はいくつかの欠点と限界を有することによって標準的な方法である。まず、多くの真菌種は成長が遅いです。固体培地上に見えるコロニーの成長が著しく、研究のペースを遅くする、1〜2週間かかる場合があります。いくつかの希釈がコロニーの可算数を確保するためにメッキしなければならないので、第二に、CFUメッキ中にサンプルの操作は、骨の折れるプロセスです。メッキ効率がよく、100％を下回っているので、第三に、CFU数が蒔い生菌の数よりも一般的に低くなっています。例えば、二形真菌病原体ヒストプラスマカプするめっき効率は90％と高いよいが、日常的な限り低くすることができ30％とは、関連する真菌dimorphのParacoccidioidesのパラゴムノキ 1、2のために（10％）であっても低くなっています。 カンジダ用めっき効率も変動3の対象となります。最後に、固体培地上で成長を確立することができる唯一の​​ライブと活発に分裂する細胞のためのCFU分析アカウントは、多くの状況で、一方、それは死んで、および/または代謝的に不活性な細胞の存在と濃度を決定することは有用であろう。 以前は、いくつかの病原性真菌種の定量化のためのフローサイトメトリーの方法は4-6に記載されている。ただし、共有フローサイトメーター上のバイオセーフティレベル2（BSL2）またはBSL3レベルの病原体の使用に関わるバイオセーフティ封じ込めの問題のために、この手法の採用が限定されている。フローサイトメトリーのように、イメージサイトメトリーは、細胞の定量化の感度かつ迅速な方法である。しかし、画像サイトメトリーを同等の結果7と数分の一のコストで行うことができます-11。ここでは、宿主細胞に伴って病原性真菌のイメージサイトメトリーを実行するための方法が記載されている。我々は2つの人間の真菌病原体を使用して、私たちの方法を実証： ヒストプラスマカプとカンジダをH.。カプは、呼吸器疾患を引き起こす二形真菌病原体であり、ヒトでは、出芽酵母として成長し、肺胞マクロファージ内で複製カンジダは時折カンジダ症の原因となる人間の共生種である。我々は、画像メトリが可視化機能と一緒に、これらの酵母の迅速な定量化を可能にすることを示している。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Solution</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て計数室</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セロメータビジョンソフトウェア</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

例えば、 カンジダ·アルビカンス 、 ヒストプラスマカプ 、およびクリプトコッカス·ネオフォルマンスなどの病原性酵母の細胞病原性機構の研究は、一般に、単位分析またはフローサイトメトリーを形成するコロニーを用いて酵母定量化に続いて、哺乳動物宿主又は宿主細胞（ すなわち、マクロファージ）の感染を用いる。コロニー形成単位の列挙は、フィールドで最も一般的に使用される方法であったが、この技術は成長を比較するときに特に懸念される固体培地および低および/または可変メッキ効率、上のいくつかの真菌種のゆっくりとした成長を含めて、不利な点と制限があります野生型および変異株である。フローサイトメトリーは、酵母の生存率に関する迅速な定量的情報を提供することができるが、病原性酵母のフローサイトメトリー検出の適用は、その高コスト及び生物学的安全性の考慮を含む実用的な理由の数が限られている。ここでは、イメージベースのデモンストレーションマクロファージとの共培養中の生存病原性酵母の定量化のためのCellometerビジョン（バイオサイエンスNexcelom、LLC）を使用してフローサイトメトリーの方法論。 2人間の真菌病原体の検出に関する我々の研究の焦点： ヒストプラスマカプとカンジダH.。カプはマクロファージファゴソーム内で複製することによって肺胞マクロファージコロニーを形成し、ここで、我々は定量H.の成長を評価するイメージサイトメトリーと組み合わせて、アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム染色を用いてRAW 264.7マクロファージにおけるカプ酵母。我々の忠実方法従来のコロニー形成単位の列挙によって測定された反復するの成長傾向が、大幅に増加した感度。さらに、我々は直接Cの GFP発現株でライブマクロファージの感染性を評価アルビカンス 。我々の方法論は、アソシエーションのウィットに重要なヒトの真菌病原体の検出および定量のために、迅速、正確、かつ経済的な手段を提供しています時間宿主細胞。

我々は、H.の成長を監視するCellometerビジョン画像サイトメーターを用いマクロファージ細胞内カプスラーツム 。 RAW 264.7細胞はH.に感染していたカプ酵母細胞及び様々な時点で、サンプルは画像ベースのサイトメトリー解析に続いAO / PI染色を行った。並行して、サンプルは、従来のCFU列挙によって分析した。各時点において、サンプルは、マクロファージを溶解するために水でインキュベートし、遊離した酵母細胞をCellometerビジョンソフトウェア（ 図1aおよび1b）で同定した。各時点（ 図1c）での画像ベースのサイトメトリー分析およびCFU列挙体によって検出された私たちは、実行可能な酵母の濃度で高度に匹敵する傾向を観察します。予想通り、AO / PI染色によって検出し、ライブ酵母の絶対数は、符号を強調し、CFU分析によって評価した固体培地上のコロニー形成が可能な酵母の数よりも常に高かった実行可​​能な、非耕作細胞のificant番号。 <p cl...

ここでは、イメージサイトメトリー、培養中の宿主細胞に対応付けて病原性真菌の定量に使用することができる方法を示す。この技術は、CFU列挙の代替として使用することができる。

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

本手順の目的は、コロニー形成単位（CFU）のプレート播種を行うことなく、宿主細胞に付随する病原性酵母を定量化することです。まず、マクロファージ細胞にH capsulationまたはC albicans酵母細胞を感染させ、感染したマクロファージ細胞をacridine orangeおよびpropidium iodideで染色して、生存している酵母細胞を可視化します。次に、イメージングサイトメーターを用いて一連の画像をキャプチャし、サイズと形状のパラメータを解析することで、酵母細胞を正確に計数します。イメージサイトメトリーの結果は、宿主細胞に関連する病原性酵母の定量に効果的に利用できます。私がこの手法を考案したのは、真菌の病原性に関する研究を行っていたときのことでした。当時、病原性真菌であるHistoplasma capsulatumの定量のために、繰り返し平板培養を行い、コロニー形成単位を計測する必要がありました。CFU計数という標準的な手法に対するイメージサイトメトリーの主な利点は、宿主細胞内における野生株と変異株の増殖を比較する際に、平板培養、培養、および多数の連続希釈サンプルのCFU計数という、手間と時間がかかる工程を排除できるため、速度が向上することにあります。この手法により、固体培地上で質の高い増殖を開始させる能力の差によって生じる潜在的なバイアスを排除できます。一般的に、この手法に不慣れな方は、イメージサイトメトリーの装置およびソフトウェアの操作に苦慮する可能性があります。まず、マクロファージを目的の密度で培養して手順を開始します。24ウェルプレートに対数増殖期の真菌細胞を加え、食細胞作用を促すため90分間インキュベートします。次に、細胞外の真菌を除去するためにマクロファージをPBSで3回洗浄し、サンプル解析前の実験的に定義された時間までインキュベートします。低感染多重度（MOI）の場合、感染したマクロファージ細胞は数日間生存するため、約12〜24時間ごとにサンプルを解析することが可能です。PBSで3回洗浄した後、感染させたマクロファージ細胞に滅菌水を0.5 milliliters加えます。室温で5分間インキュベートし、マクロファージ細胞から真菌を遊離させます。その後、ライセートを滅菌チューブに回収し、氷上で保持します。ライセート 20 µL を別のチューブに移します。即座にイメージサイトメトリー解析を行うため、アニリンオレンジ・プロピジウムヨード溶液 20 µL を加えます。培地を用いてライセートを10倍希釈します。次に、各希釈液 100 µLをHMM arosプレートに2連で分注します。プレートを、37 °C、5% CO2の加湿チャンバー内で7〜8日間培養します。プレート上のコロニーを手動で計測し、100個以上1000個以下の独立したコロニーが表示されていることを確認します。生きたマクロファージを回収するため、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、0.5 millilitersのPBSを加え、4 °Cで30分間インキュベートします。穏やかなピペッティングにより、組織培養ウェルからマクロファージを除去します。液体を滅菌チューブに移し、氷上で保存します。アクセレロメーター装置をセットアップするには、蛍光光学モジュールをシステムに挿入し、確実に固定されていることを確認します。ソフトウェアのアッセイドロップダウンメニューでイメージサイトメーターをオンにします。生存率用のプリセットアッセイタイプと細胞タイプを選択してください。このアッセイは、Candida albicans感染を検出するためのacridine orangeおよびpropidium iodide検出用に最適化されています。このアッセイはGFP検出用に最適化されています。次に、オプションタブを開き、「take background image」をクリックします。操作が完了したら、「preview brightfield image」をクリックしてA OPI生存率測定を行います。20 µLのサンプルと20 µLのA OPIを混合し、Candida albicans感染率を測定するために計数室にピペッティングします。サンプルを十分に混ぜ合わせ、カウントチャンバーに直接ピペットで分注します。細胞がチャンバー内で沈降した後、画像取得のためにカウントチャンバーをイメージサイトメーターに挿入します。サンプルに焦点を合わせ、「count」をクリックします。画像取得操作が完了したら、使い捨て計数チャンバーを取り外し、適切に廃棄してください。A OPI測定では、計数結果ページに濃度と生存率の結果が表示され、これにより candida albicans の感染率を判定します。計数結果を得た後、「export」をクリックしてください。次に、GFPの細胞集団解析のため、データをFCS express 4に送信します。FCS expressでデータファイルをインポートし、結果を蛍光ヒストグラムとしてプロットします。続いて、ヒストグラムに細胞集団ゲートを適用し、Candida albicans感染細胞の集団割合を決定します。この実験では、hcaps Lotum酵母に感染したマクロファージ細胞の増殖を、規定の時間経過に沿って追跡します。サンプルを染色し、イメージサイトメトリーによって解析します。マクロファージから放出された酵母細胞は、Soter visionソフトウェアを用いて同定されます。ここでは、検出された生存酵母の絶対数が、固体培地でコロニー形成可能な酵母よりも多いことが分かります。これらのデータは、生存しているが培養不能な細胞が相当数存在することを強調しています。これらの骨髄由来マクロファージに、A DH oneプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現するC albicans酵母細胞を感染させました。感染多重度（MOI）を0.1から10の範囲で設定したところ、感染マクロファージ内のGFP強度はもと infekマクロファージの総割合とともに段階的に増加しました。この手法を習得すれば、適切に実施することで1サンプルあたりわずか数分で完了できます。本手順を行う際は、宿主細胞ではなく真菌細胞のみをカウントするようにパラメータを設定することが重要です。このビデオを視聴することで、イメージサイトメトリーを用いて宿主細胞に関連する病原性酵母を定量化する方法について、十分な理解を得られるはずです。病原性真菌の取り扱いは極めて危険であるため、個人用保護具を着用し、適切なバイオハザード廃棄物処理手順に従うことを忘れないでください。

use-image-cytometry-for-quantification-pathogenic-fungi-association

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ヒト白血球によるFITC標識病原性真菌胞子の食作用を定量化する方法を示しています。食作用した胞子は、対比染色によって細胞付着胞子から識別され、続いてフローサイトメトリー分析が行われます。...

ヒト食細胞による真菌性胞子食作用の定量的フローサイトメトリー測定

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核...

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

ここでは、生細胞ビデオ顕微鏡と一緒に蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してリアルタイムに初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性を評価し、フローサイトメトリーするプロトコルを記述します。生成されたデータは、殺菌活性、食作用、細胞遊走および真菌の成長の阻害のような宿主細胞- アスペルギルス相互作用への洞察を提供します。...

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em&gt; A。フミガーツス</em

ゴモリの変更された methanamine 銀染色組織切片の定量化による侵襲性アスペルギルス症マウスにおける肺真菌負担を決定するプロトコルについて述べる。このメソッドの使用は肺真菌 DNA の定量的 PCR...

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。...

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。...

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

このプロトコルの目的は、哺乳動物の消化管におけるカンディダ・アルビカンス細胞の形状および局在を可視化することである。...

上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いたヒト一次食細胞によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの貪食を定量的に測定し、単なる接着から白血球へのコニジアの貪食を判別するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。...

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。...

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば...

発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

我々は、細胞数を識別するために一般化可能な領域ベースの画像解析アプローチを利用する方法を提示する。異なる細胞集団の分析は、適応アルゴリズム内の異なる細胞型間の有意な細胞高さおよび構造の違いを利用した。...

マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム

学ぶ画像サイトメトリーを用いた宿主細胞内の病原性酵母の定量化法。マクロファージを用いた真菌感染症研究において、従来のCFU法に代わる迅速で効率的な代替手法を確立し、宿主と病原体の相互作用解析を促進する。

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

さらに動画を探す