宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

この手順の全体的な目標は、コロニー形成ユニットをプレーティングせずに、宿主細胞と関連して病原性酵母を定量することです。まず、マクロファージ細胞にHカプセル化またはCアルビカンス酵母細胞を感染させたマクロファージ細胞をアインオレンジとヨウ化プロピジウムで染色して、生存可能な酵母細胞を強調表示します。次に、イメージングサイトメーターを使用して一連の画像をキャプチャし、サイズと形状のパラメーターを分析して、酵母細胞を正確に列挙します。

イメージサイトメトリーの結果は、宿主細胞と関連した病原性酵母の定量に効果的に使用できます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、病原性真菌であるヒストプラズマカプセルを定量するために、コロニー形成単位を繰り返しプレートしてカウントする必要があった真菌の病因の分野で研究を行っていたときでした。標準的なCFU列挙法に対するイメージサイトメトリーの主な利点は、宿主細胞内の野生型株と変異株の増殖を比較する際に、CFUの複数の段階希釈のプレーティング、インキュベーション、カウントの労力と時間のかかるステップを排除するため、速度が向上することです。

この方法により、固体媒体で品質成長を開始する能力の違いによってもたらされる潜在的なバイアスが排除されます。一般に、この方法に不慣れな個人は、イメージサイトメトリーによって挑戦される可能性があります。インストルメンテーション、およびソフトウェア。

マクロファージを所望の密度で培養することから手順を開始します。24ウェルプレートに、対数期増殖中の真菌細胞を添加し、90分間インキュベートして食作用を促します。次に、マクロファージをPBSで3回洗浄して細胞外真菌を除去し、サンプル分析前の実験的に定義された時間インキュベートします感染の多様性が低い場合、感染したマクロファージ細胞は数日間生存可能であり、サンプルは約12〜24時間ごとに分析できます。

PBSで3回洗浄した後、感染したマクロファージ細胞に0.5ミリリットルの滅菌水を加えます。室温で5分間インキュベートして、マクロファージ細胞から真菌を遊離させます。その後、ライセートを滅菌チューブに回収し、氷上に保ちます。

20マイクロリットルのライセートを別のチューブに移します。20マイクロリットルのaine orangeヨウ化プロピジウム溶液を添加して、即時の画像サイトメトリー解析を行います。培地中のライセートを10倍希釈します。

次に、各希釈液の100マイクロリットルを二重にプレートします。HMMのarosの版で。プレートを摂氏37度の加湿チャンバーで5%の二酸化炭素と7〜8日間インキュベー

プレート上のコロニーを手動でカウントし、最小100個、最大1000個の異なるコロニーを表示します。生きたマクロファージを採取するには、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、0.5ミリリットルのPBSを加え、摂氏4度で30分間インキュベートします。

組織培養ウェルからマクロファージを静かにピペッティングして除去します。液体を滅菌チューブに移し、氷上に保存します。加速度計装置をセットアップするには、蛍光光学モジュールをシステムに挿入し、所定の位置にロックされていることを確認します。

ソフトウェアのアッセイドロップダウンメニューでイメージサイトメーターの電源を入れます。生存率のために、プリセットされたアッセイタイプと細胞タイプを選択します。このアッセイは、カンジダ・アルビカンス感染の検出のためのアインオレンジおよびヨウ化プロピジウムの検出に最適化されています。

このアッセイはGFP検出に最適化されています。次に、[オプション]タブを開き、[背景画像の撮影]をクリックします操作が完了したら、AOPI生存率測定のプレビュー明視野画像をクリックします。20マイクロリットルのサンプルと20マイクロリットルのA OPIを混合し、カンジダ・アルビカンスの感染率の会計室にピペットで移します。

サンプルをよく混合し、カウンティングチャンバーに直接ピペットで移します。細胞がチャンバーに落ち着いたら、カウントチャンバーを画像サイトメーターに挿入して画像を取得します。サンプルにピントを合わせ、カウントをクリックします。

画像取得操作が完了したら、使い捨ての計数チャンバーを取り外し、適切に廃棄してください。A OPI測定の場合、濃度と生存率の結果がカウント結果ページに表示され、カンジダ・アルビカンスの感染率が決定されます。カウント結果を取得したら、エクスポートをクリックします。

その後、GFPの細胞集団解析のためにデータをFCS express fourに送ります。FCS expressで、データファイルをインポートし、結果を蛍光ヒストグラムにプロットします。次に、ヒストグラムに細胞集団ゲートを適用して、カンジダ・アルビカンスに感染した細胞の集団の割合を決定します。

この実験では、定義された時点でhcaps Lotum酵母に感染したマクロファージ細胞の増殖をモニターします。サンプルは、画像ベースのサイトメトリーによって染色および分析されます。混入マクロファージから遊離した酵母細胞は、Soterビジョンソフトウェアによって同定されます。

ここで、検出される生きた酵母の絶対数は、固体培地でコロニー形成が可能な酵母よりも多くなっています。これらのデータは、生存可能だが培養不可能な細胞が多数存在することを示しています。これらの骨髄由来マクロファージを、A DHワンプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現するCアルビカン酵母細胞に感染させた。

0.1〜10の範囲の感染の多様性は、感染したマクロファージ内のGFP強度の漸進的な増加をもたらし、また、一度習得すると感染したマクロファージの総割合も増加した。この手法は、適切に実行されれば、サンプルごとにわずか数分で実行できます。この手順を試行する際は、宿主細胞ではなく真菌細胞のみがカウントされるようにパラメータを設定することを忘れないでください。

このビデオを見れば、イメージサイトメトリーを使用して宿主細胞と関連した病原性酵母を定量する方法を十分に理解できるはずです。病原性真菌の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、個人用保護具を着用し、適切なバイオハザード廃棄物処理手順に従ってください。