コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

この記事では、マウスの脳にウイルスベクターを顕微注入すると、その後買収、絶滅と回復期を含む条件付け場所嗜好パラダイムでテストする方法を説明します。

この手順の全体的な目標は、条件配置選好パラダイムの個別のフェーズで標的遺伝子を選択的にアブレートして、この行動への寄与を経時的にテストすることです。これは、クリーリコンビナーゼを発現する組換えeno関連ウイルスベクターを最初に定位マイクロ注射することによって達成されます。次に、マウスを自宅のケージで10〜14日間回復させて、Cの再活性化

手順の3番目のステップは、獲得、消滅、回復の段階を含む、条件付けられた場所の好みでマウスをテストすることです。手順の最後のステップは、マイクロインジェクションマウスの組織学的検査を実施して、正しいマイクロインジェクションの配置を検証することです。最終的には、条件配置選好行動試験を通じて、遺伝子ノックアウトに応答した獲得、消滅、および/または復帰行動の変化を示す結果を得ることができる。

CREロックP嵌合システムのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、遺伝子ノックアウトのより特異的なタイミングと解剖学的特異性を離散的に可能にし、行動の各段階での遺伝子の損失の調査を可能にすることです。この技術の意味するところは、文脈上の手がかりへの曝露がコカイン関連の記憶を引き起こし、中毒者の渇望と再発を引き起こす可能性のある方法の根底にある遺伝的基盤をよりよく理解することを含むため、中毒性行動の治療にまで及びます。まず、マウスケージに寝具を敷き詰めたマウスケージをヒートロックの上に置いて、術後の回復のために温めます。

頭を剃るための電気カミソリを設置し、エタノールとヨウ素を頭皮の除菌に充てます。70%エタノールを使用して、5マイクロリットルのハミルトンシリンジを使用して、ステレオアタックのイヤーバーとマウスホールドを拭きます。5マイクロリットルのウイルスベクターを引き出し、シリンジホルダーにセットします。

マイクロ波加熱パッドまたは電気パッドをステレオアタックに置きます ケタミンキシラジンカクテルのIPインジェクションをマウスに注入した後。テキストプロトコルに従って、テールピンチを実行して鎮静のレベルを確認します。次に、耳と目の間の頭を剃り、滅菌綿のアプリケーターを使用して、エタノールとヨウ素を交互に洗ってその部分をきれいにします。

次に、マウスをステレオアタックゼロの加熱パッドに移します。歯のバーとイヤーバーはスケールし、マウスの歯を歯のバーにセットし、銃口と耳のバーをねじ込みます。小刻みに動く動きやひげの動きが見られる場合。

ケタミンキシラジンカクテルのブースター用量を投与します。.次に、目が乾燥するのを防ぐために目を滑らかにします。次にメスカットで頭皮を耳のすぐ後ろまで開きます。

頭皮の角にブルドッグクリップを当てて、頭蓋骨から皮膚をはがします。Bgma と Lambda が見やすいことを確認します。bgmaからラムダへの縫合糸が整列していることを確認し、必要に応じて頭の位置を変えます。

ステレオアタックの設定がゼロになっていることを確認したら、針先をbmaの所定の位置に置きます。BMAとラムダの両方の背側、腹側、内側、外側、および前部の後座標を測定します。次に、BMAとラムダの腹側座標が互いに0.02ミリメートル以内になるまでヘッドを調整します。

針先を bgma に再度中心に置き、その点から前方後方向に目的の座標に移動します。次に、目的の座標でボアホールを掘削します。針が頭蓋骨に邪魔されずに入ることができることを確認してから、針を目的の腹側座標まで下げます。

座標に達したら、その下に0.015ミリメートルを約10秒間浸して、ウイルスベクター用の小さなポケットを毎分約0.1マイクロリットルの速度で作成し、ウイルスベクターが拡散するのを3分間待った後、必要な量のウイルスベクターを注入し、針先を0.015ミリメートル上げてさらに2分間待ちます。注射が完了したら、ボーンワックスを塗布して両方の穴を塞ぎ、頭皮を縫合します。最後に、負傷した部分に神経ブロックを塗ります。

マウスをステレオアタックから取り外し、ヒートブロックの上の暖かいケージに入れて、45分から1時間回復します。マウスを少なくとも10日間回復させて、最大限の再活性化を可能にします。動物に水を与え、回復後の痛みに必要な場合は1日2回、食物とブプレノルフィンを柔らかくし、ギロチンのドアを閉じた状態で62回目の慣れ期間、マウスを3つの部屋の場所優先装置の中央の部屋に置きます。

慣れたら、ギロチンのドアを開けて、マウスが3つの部屋すべてを1200秒間自由に探索できるようにします。Med PC 4ソフトウェアを使用して、テキストプロトコルのガイドラインを使用して、各チャンバーで過ごした動物の時間を記録します。マウスをプレテスト中のパフォーマンスに基づいてコンディショニングチャンバーに割り当てます。

次の3日間、午前中のセッションで1キログラムあたり10ミリグラムのコカインを注射し、すぐに割り当てられたチャンバーで1200秒間それらを混ぜ合わせます。マウスを自宅のケージに4時間戻し、生理食塩水を注射し、すぐにマウスを反対側の部屋に1200秒間閉じ込めます。取得をテストするには、マウスをギロチンのドアを閉じた状態で中央の部屋に置き、62回目の慣れ期間を確保します。

ギロチンのドアを開けて、1200秒間自由に探索したり、録音したりできます。すべてのチャンバーで過ごした時間は、コカインペアチャンバーで過ごした時間から生理食塩水ペアチャンバーで過ごした時間を差し引くことによって選好を計算します。マイクロインジェクションマウスでCPPを実行した後、彼らは特定のチャンバーに対する好みを獲得したと考えられます。

コカインの好みが、コカインペアチャンバーで過ごした時間から生理食塩水ペアチャンバーで過ごした時間を差し引いたものとして定義され、ベースラインの好みスコアと比較して有意に高い場合。コホート対照として注射されたマウスがコカインペアチャンバーまたはショーの好みを示さない場合、嫌悪配置は組織学によって直ちに確認され、誤った配置を持つマウスは研究から除外されます。選好が通常、対照注射されたコホートによって獲得される場合、パラダイムは絶滅を開始することによって拡張されます。

マウスは、特定のチャンバーに対する薬物誘発性の選好を消滅させたと考えられています。連続する2日間の絶滅日におけるコカイン選好が、この時点での獲得選好スコアと比較して著しく低い場合、薬物プライムで復帰することができます。薬物プライムの投与後の選好スコアが取得時のそれと統計的に区別できない場合、そのコホートは定量的PCRを使用して薬物対チャンバーに対する薬物誘発性選好を回復したと言われる。

この図は、L型カルシウムチャネルアイソフォームであるRAAVのCAV 1.2群を持つ側坐核にRAAV Cree GFPをマイクロインジェクションした後、マイクロインジェクションマウスで目的の遺伝子が実際にノックアウトされたことを示しています。クリーを注入したパンチは、ここに示すA-A-V-G-F-Pを注入したマウスと比較して、遺伝子発現の有意な減少を示しています。GFP の側坐核の免疫組織化学的分析により、この手順に続いてマイクロ注射された RAAV Cree の適切な両側配置が明らかになりました。

定量的リアルタイムPCRやウェスタンボディなどの他の手法は、関心のある他の遺伝子の発現レベルに対する遺伝子のノックダウンの影響に関する質問に答えるために実行できます。このビデオを見た後、定位固定装置マイクロインジェクションウイルスベクターを使用してマウス脳内の標的遺伝子を選択的にアブレートする方法をよりよく理解し、これらの遺伝子が獲得的消滅と条件場所選好パラダイムの回復における役割を選択的にテストする方法を理解する必要があります。