Name: コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぶ マウス脳へのウイルスベクター定位マイクロインジェクション法。コカイン条件付け場所嗜好パラダイムの獲得・消去・再発現段階における標的遺伝子の役割を神経科学・行動解析で研究する。組織学的検証で正確性を確認する。

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著者は、拡張された条件付け場所嗜好プロトコルを確立する彼らの助けのためにアンニリーとモーリーンバーンに感謝したいと思います。

すべての手順は、ワイルコーネル医科大学制度動物実験委員会の規則に従って行われている。 1。ウイルスベクターの定位配信のための準備とセットアップ<ol><li>楽器、滅菌綿棒、または滅菌手袋を着用して手が非滅菌表面に接触し、破棄するかホットビーズ滅菌器を使用して再滅菌する器具によって汚染されている場合は、新しい滅菌手袋に綿棒または変更を破棄します。 </li><li>術後の回復のために温めるヒートブロックで寝具とマウスのケージを置きます。 </li><li>頭皮を殺菌するために頭とエタノールとヨウ素を剃るための電気かみそりを設定します。 </li><li> 70％エタノールでstereotaxの耳のバーや口のホールドを拭う。 </li><li> 5μlのハミルトンシリンジを用いて、ウイルスベクター（1×10 6ウイルス粒子/μl）を5μlのを策定し、stereotaxにシリンジホルダーに設置した。 </li><li>マイクロ波加熱パッドまたは上の電気パッドを回すstereotax上番目の場所。火傷のリスクを軽減するために、クリーン吸収パッドでカバーしています。モニタ、マウス体温（97から99.5°Fの間に）頻繁に手順全体。 </li><li>ケタミン（100 mg / kg体重）およびキシラジン（20 mg / kg体重）の混合物でマウス（22〜35グラムの間で計量）を注入。マウスを麻酔したら、マウスの反射神経をチェックして、マウスが十分に麻酔であることを保証するために、任意の動きや反応を注意するの尾先端をつまむ。 </li><li>耳と目の間に頭を剃る。 </li><li>エタノールとヨウ素滅菌綿アプリケーターを交互に坊主頭を清掃します。 </li><li> stereotax上の加熱パッドにマウスを転送します。 </li></ol> 2。ウイルスベクターの定位マイクロインジェクション<ol><li>手術全体に滅菌手袋を着用してください。手袋非滅菌表面に触れることにより、任意の時点で汚染されている場合は、手袋を変更してください。 </li><li>ゼロの歯バーと耳のバースケール。 </li><li>歯バーに歯をセットします。 </li><li>銃口のネジ。揺らすまたはウィスカ移動した場合リーメントはいつでも注目される、ケタミン（100 mg / kg体重）およびキシラジン（20 mg / kg体重）の混合物の腹腔内ブースター用量（0.05〜cc）で管理する。 </li><li>耳バーのネジ。 </li><li> PuraLubeで目に注油。 </li><li>メスでただ後ろに耳に開いて頭皮をカットします。 </li><li>皮膚剥がれ頭蓋骨から頭皮の角の上に置いてブルドッグクリップ。ブレグマとラムダが簡単に表示されるはずです。 </li><li>ブレグマからラムダへの縫合糸がまっすぐに整列していることを確認してください。縫合糸は、頭部の曲がっ再調整ポジショニングである場合。 </li><li> stereotax上のすべての設定がゼロにされていることを確認してください。 </li><li>ブレグマで所定の位置に針先を入れてください。 </li><li>ブレグマとラムダの両方のすべての座標を測定します。これは、腹側/背内側/横と前方/後方の座標が含まれています。 </li><li>ブレグマとラムダのために腹座標が互いに0.02 mm以内になるまで頭を調整します。 </li><li>一度内側/横（M / L）座標に内側に出かけるブレグマから、整列。ことを確認してください左右両側が互いに0.02 mm以内に整列される。 </li><li>ブレグマ上で、そこから再センター針の先端は、目的の前方/後方の座標に（/ P）前方/後方方向に移動する。 </li><li>必要に応じて、角度一方向に針とstereotaxがロックされていることを確認してください。 （ - 1.52 + / - ）左M / Lの座標に出て行く</li><li>ボーリング孔を掘削した後にリファレンスとして使用するために頭蓋骨の上部の腹の位置を測定します。 </li><li>希望の座標に無菌のドリルビットを使用して掘削孔を開けます。針が頭蓋骨を通して中断なく入力することができますことを確認します。 </li><li>希望の腹側の座標に針を下ろし。 </li><li>一度座標はディップ0.015ミリメートルはウイルスベクターのための小さなポケットを作成するために〜10秒以下、到達する。 </li><li> 〜0.1μL/分の速度でウイルスベクターの所望の体積を注入する。完全に拡散するウイルスベクターのために3分待ちます。針先0.015ミリメートルを上げ、さらに2分待つ。 </li><li>反対方向に針を（斜め注射を行う場合）を浸します。繰り返しになりますが、頭蓋骨の上部の基準として腹位置を記録。 </li><li> （二国間の注射をしている場合）の反対側にウイルスベクターを注入する第一の側と同じ手順を繰り返します。 </li><li>滅菌綿棒先端の木製の終わりを使用してそれらを密封するために、両方の穴に骨ワックスを適用します。 </li><li>頭皮を縫合。 </li><li>負傷者の領域に神経ブロックを適用します。 </li><li> 45分間回復するためのヒートブロック上で温めケージにstereotaxから、マウスと場所を削除します。 </li><li>含む痛みの兆候を監視します、全体的な活動や落ち着きのなさを減少させた食品や水の消費または増大発声を減少させた。ブプレノルフィン（0.05から0.2 mg / kg体重）は、痛みのため、必要に応じて一週間、毎日二回投与することもできる。許容可能な選択肢が含まれます：メペリジン（20-60 mg / kg）を、ペンタゾシン（10 mg / kg）を、ナルブフィン（4-8 mg / kg）を。 </li></ol> 3。条件付け場所の人種：Acquisitionは、絶滅、そして復活<ol><li>ギロチンドアが60秒の馴化期間の3室の場所嗜好装置（メッドアソシエーツ社、セントオールバンズ、VT、USA）の中央の室へ場所マウスは閉じた。 </li><li>馴化後、オープンギロチンドアやMedPC IVソフトウェア（メッドアソシエイツ社）を用いて記録されている各チャンバーに費やされる時間と1200のためのすべての3室のマウス自由探査秒、許す。 </li><li>プレテストの間に彼らのパフォーマンスに基づいて空調室にマウスを割り当てます。ベースラインの事前テスト中に最も好まれたコンパートメントとのその後の3日間、バイアス設計、ペア薬物投与を使用。 </li><li>午前中のセッション中に、注射の直後1200秒、割り当てられた部屋でそれらを閉じ込める、次の3のコンディショニング日の間に、コカイン（IP 10 mg / kg体重）をマウスに注入する。セッションの後に自分のホームケージにマウスを返します。 4時間後、生理食塩水（0.01ミリリットル/ gのマウスに注入する体重）と1,200秒午後のセッションのために反対室にそれらを閉じ込める。 </li><li>取得のためにテストするには、ギロチンドアと中央のチャンバー内の場所のマウスは60秒の馴化期間のため閉鎖。オープンギロチンドアやMedPC IVソフトウェア（メッドアソシエイツ社）によって記録されたすべての室で過ごした時間を1,200秒のための無料の探査を可能にします。コカインペア室に費やされる時間の量から生理食塩水対のチャンバ内で費やされた時間を減算することにより優先順位を計算する。 </li><li>同一装置で毎日無料探査の2 20分のセッションにマウスを公開、場所嗜好を消​​すためには、買収のためのテスト後24時間を開始し、少なくとも2時間で区切られています。すべてのチャンバに費やされた時間は再度記録し、初期CPPの大きさがそれぞれ消光セッションのそれと比較されるべきである。 </li><li>マウスはPAR用かどうかの好みを評価することによって、薬剤誘発性の好みを消滅しているかどうかを判断する二つの連続消光日にわたるticular室は、取得嗜好に比べて著しく低い。 </li><li>コカインのプライミング用量（5または10 mg / kg体重、腹腔内）でマウスを元に戻すと無料探査を許可装置に再公開し、各区画にかかった時間を記録します。 </li><li> Euthasol安楽死溶液（150 mg / kg）を管理します。 Transcardially 4％パラホルムアルデヒド（PFA）をマウスに灌流し、正しいマイクロインジェクションの配置を検証するための組織学的検査を行う。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

絶滅と復職段階を含むCPPと組み合わせてウイルスベクターの定位マイクロインジェクション経由地域と時間的に特異的な遺伝子アブレーションは中毒性の​​ような行動の3つの異なる段階に遺伝子の特定の貢献の調査を可能にします。伝統的なCRE-のLoxPシステムを利用して達成され、条件付きノックアウトは空間、時間的制限遺伝子アブレーションに提供していますが、定位loxP導入マウスの離散的な脳領域にCRE-リコンビナーゼをマイクロインジェクションすると、いつ、どこで遺伝子がノックアウトされているのであっても厳密に制御することができます。また、これは時々ノックアウトマウスで観察された限られた表現型変異を占める現像中に発生する代償変化の可能性を回避する。また、行動時の様々な時点で微量注入したマウスのコホートを使用して、遺伝子発現の変化や行動の変化との間に作られるべき因果関係を可能にすることができる。 IMPOrtantly、この技術は自己投与及び精神運動感作を含むいくつかの異なるコカインの行動パラダイムに適用することができる。 これは、Creリコンビナーゼの最大活性が20を発生...

コカインは非常に強化精神刺激薬である。反復暴露に続いて、いくつかの分子や細胞適応が強迫的になると考えられている報酬関連脳回路で発生する薬物探索重大な臨床的問題1ポーズ再発率の高さを促し、行動を。コカインは、遺伝子発現を調節することによって、これらの長期的な行動効果を発揮する。慢性コカインの使用から生じる適応を研究するために、前臨床げっ歯類モデルは、広く使用されている。そのようなモデルは、条件付け場所嗜好（CPP）パラダイムである。このモデルは、以前に中立的な環境とコカインのやりがいの特性と学び関連の開発が含まれます。特定の室とコカインのいくつかのペアリング後、動物を自由にコカインペアと非コカインペア環境を探索するために許可されていると、彼らは薬物ペアコンパートメントを好む場合は、それらは、コカイン誘発性のプラクを取得していると言われています電子好み。また、絶滅の訓練期間の後、このパラダイムはコカイン探索行動のコンテキスト固有の復職を研究するために使用することができます。 より正確に中毒性の模倣するように考えられているような長期的なコカイン誘発行動と分子可塑2,3と自己管理（SA）を研究するために使用されている精神感、などの中毒性のような行動、他のビヘイビア·モデルに比べのような人間に見られる行動、CPPパラダイムは、コカイン文脈学習4を勉強するための簡単な手順です。 CPPプロトコルは便利に薬物渇望のメカニズムと再発5-7との調査を可能にSA、同様に、絶滅と復職段階を含むように拡張することができ、人間の薬物探索行動と薬物で発生するものの側面を要約すると考えられている-とキュー誘発再発8-10。 その根底に一つのメカニズム買収、絶滅、そして復職など、CPPの異なる相のそれぞれの特徴であるコカイン誘発性行動の可塑性、異なる脳領域内の遺伝子発現のユニークな署名の活性化である。直接コカイン誘発性の行動変化を仲介報酬関連脳領域内のどの遺伝子テストするには、それは、地域固有の方法で選択的にそれらを操作できるようにすると便利です。これを達成する1つの方法は明白CreリコンビナーゼはloxP部位（loxPにはさまれたマウス）に挟まれた標的遺伝子を有するマウスの脳の異なる領域に、定位手術を使用している組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）ベクターを顕微注入することである。この方法では、いつ、どこで遺伝子が11-13免疫応答を誘発することなく、両方の分割および非分割ニューロンにおいて、アブレーションさにわたって非常に正確な時間的·地域的に制御できます。このレベルの制御は、loxP導入マウスのw繁殖の伝統的なCRE-のLoxP技術上の重要な利点を表しという点で、内因性遺伝子プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現するマウスは、i番目のタイミングおよび遺伝子欠失の分布をより強固に規制することができる。また、ウイルスベクター媒介遺伝子ノックアウトは、伝統的なノックアウト戦略を使用して発生する可能性のある潜在的な発達代償効果を回避。 ここに記載されているコカインCPPに加えて、特定の遺伝子の役割を評価するためのloxPにはさまれたマウスの脳内のrAAV-Creのマイクロインジェクションは、自己投与及び精神運動感作を含む別々の相を含む行動のパラダイムに遍在的に適用することができる。例えば、我々の研究室では、コカイン精神運動感14中のCa V 1.2 L型Ca 2 +チャネルの役割を研究するためのrAAV-Creの技術を利用しています。具体的には、するrAAV-Creをを実証するためにコードする遺伝子のCa V 1.2 loxP導入によるマウスの側坐核（NAC）にマイクロインジェクションしたことのCa V </suロ&gt; 1.2この領域を仲介に精神感14,15の発現位相を演技。精神感中のCa V 1.3 L型Ca 2 +チャネルの役割を評価する際に、目的のloxP導入遺伝子を持つマウスが存在しない場合は、するrAAV-Creの戦略を使用することができない、などの私たちの経験であった。条件付きマウスは、関心のある特定の遺伝子のために存在しない場合、したがって、のrAAV-Creリコンビナーゼを用いた制限は、それ自身を示す。しかし、我々はカルシウムバージョン 1.3チャンネル14,15の役割を調べるために行ったように明白なsiRNAは、ノックダウンの標的遺伝子に使用することができることrAAVs。 loxP導入マウスの離散的な脳領域にするrAAV-Creををマイクロインジェクションした後、CPPパラダイムでそれらをテストする中毒性のような行動の様々な段階を媒介し、彼らが行動している特定の遺伝子の調査を可能にします。このパラダイムを使用するには、本質的に繰り返しコカイン投与がBrをハイジャックする方法についての我々の理解で支援しているAINSの報酬回路は中毒状態1,16,17につながることを分子シグナル伝達経路と遺伝子発現の不適応な変化を引き起こす。

<table><tbody><tr><td>条件付けされた場所優先活動室</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>マウス用定位固定装置アライメントシステム</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>model 900</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringes</td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにcreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

興味のある選択的にノックアウト遺伝子に異なるマウス脳領域にCreリコンビナーゼを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）ベクトルをマイクロインジェクションすると、既存の方法に比べ、遺伝子欠失の強化された時間的及び地域固有の制御を可能にします。条件付き欠失はまた、loxPにはさまれた遺伝子を有するマウスと特異的遺伝子プロモーターの制御下でマウスを発現するCreリコンビナーゼを交配することによって達成することができるが、定位マイクロインジェクションは、関心のある実験的に決定時点で離散的な脳の領域の標的を可能にする。コカイン条件付け場所嗜好のコンテキスト、および撤退、消滅、および/または復職段階を含むことができるような自己管理や精神運動感など他のコカイン行動のパラダイムでは、この手法では、これらの個別に標的遺伝子のユニークな貢献を探索に特に有用であるコカイン誘発性可塑性のビヘイビア·モデルの位相。具体的には、この手法は、時間を越え行動への貢献をテストするための行動の離散段階で標的遺伝子の選択的切除が可能になります。最終的には、このような理解は、中毒性の行動の各段階の間に自分自身を提示する最も強力なリスク要因に対処する最善のことができる、よりター​​ゲットを絞った治療を可能にします。

CPP マイクロインジェクションマウスでCPPを実行した後、一方は制御注入のコホート（のrAAV-GFP）マウスは、通常の薬物ペアリング室（ 図1A、1B）の優先順位を取得していることを確認する必要があります。マウスは、コカインの好み（生理食塩水ペアリング室で過ごしたコカインペア室マイナス時間で費やされた時間）がベースライン嗜好（ 図1B、対B）に比べて有意に高いときに、特定のチャンバーの優先順位を取得していると考えられている。コホートとして、コントロールを注射したマウスは、コカインペア室のための優先順位を表示したり、嫌悪感を示していない、場合は、配置は組織学（rAAVの注射の項を参照）、誤った配置を持つマウスを介してすぐに確認してくださいは破棄されるべきである。 設定が正常に制御注入コホートに買収されている場合、人はその後（ 図1A開始絶滅によってパラダイムを拡張することができます</strオング&gt;; 6日目以降）。マウス...

この記事では、マウスの脳にウイルスベクターを顕微注入すると、その後買収、絶滅と回復期を含む条件付け場所嗜好パラダイムでテストする方法を説明します。

コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

本手順の目的は、条件付き場所好みのパラダイムにおける特定のフェーズで標的遺伝子を選択的にアブレーションし、時間の経過に伴うこれらの遺伝子の行動への寄与を検証することである。これは、まず、Creリコンビナーゼを発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを定位的に微量注入することで達成される。次に、Creの活性化を最大化させるため、マウスをホームケージ内で10～14日間回復させる。手順の第3段階では、獲得、消去、および再燃相を含む、条件付き場所好みのテストをマウスに行います。手順の最終段階では、マイクロインジェクションを施したマウスの組織学的検査を行い、注入部位が正確であるかを確認します。最終的に、条件付き場所好みの行動テストを通じて、遺伝子ノックアウトに応答した獲得、消去、および／または再燃行動の変化を示す結果を得ることができます。CRE lock P mating systemなどの既存の手法と比較して本手法の主な利点は、遺伝子ノックアウトのタイミングと解剖学的部位を個別に、より特異的に制御できるため、行動の各フェーズにおける遺伝子欠失の影響を調査できる点にあります。この手法の意義は、依存行動の治療への応用にまで及びます。なぜなら、文脈的キューへの曝露がどのようにコカイン関連の記憶を誘発し、依存症患者における渇望や再発を促すかという、その根底にある遺伝的基盤をより深く理解することにつながるためです。まず、術後の回復のために温めるため、床敷きを入れたマウスケージをヒートロックの上に設置します。頭部を剃るための電気シェーバーと、頭皮を滅菌するためのエタノールおよびヨウ素を用意します。70%ethanolを用いて、ステレオタキシック装置のイヤバーとマウスホルダーを拭き上げます。5 µLのハミルトンシリンジを用いて、5 µLのウイルスベクターを吸引し、ステレオタキシック装置上のシリンジホルダーにセットします。ケタミン・キシラジン混合液をマウスに腹腔内投与した後、立体定位固定装置の上に電子レンジ加熱パッドまたは電気パッドを設置します。テキストプロトコルに従い、尾をつまんで鎮静レベルを確認します。次に、耳と目の間の頭部を剃毛し、滅菌綿棒を用いてエタノールとヨードで交互に洗浄し、当該部位を清浄します。その後、マウスを実体顕微鏡下の加熱パッドに移動させます。歯固定バーと耳固定バーのスケールを確認し、マウスの歯を歯固定バーにセットして、マズルバーと耳固定バーをネジで固定します。このとき、体の揺れやひげの動きが見られないか確認してください。ケタミン・キシラジン混合薬のブースター投与を行います。その後、眼球の乾燥を防ぐため、眼球に潤滑剤を塗布します。次に、メスを用いて、耳の直後まで頭皮を切開します。ブルドッグクリップを頭皮の四隅に装着し、頭蓋骨から皮膚を剥離します。このとき、BgmaおよびLambdaが容易に確認できるようにしてください。BgmaからLambdaに至る縫合線が直線上に並んでいることを確認し、必要に応じて頭部の位置を調整します。ステレオタキシス装置の設定がゼロ点にあることを確認した後、針先をbmaの位置に合わせます。BMAとlambdaの両方の背腹方向、内側・外側方向、および前後方向の座標を測定します。その後、BMAとlambdaの腹側座標の差が0.02 mm以内になるまで頭部を調整します。針先をbgmaに合わせ直し、そこから前後方向に目的の座標まで移動させます。次に、目的の座標に穿孔します。針が頭蓋骨に遮られずに挿入できることを確認し、目的の腹側座標まで針を下げます。座標に到達したら、約0.1 µL/minの速度で0.015 mmまで下降させ、約10秒間保持してウイルスベクター用の小さなポケットを作成します。その後、ウイルスベクターを拡散させるために3分間待機し、所定量のウイルスベクターを注入します。次に、針先を0.015 mm上昇させ、さらに2分間待機します。注入が完了したら、ボーンワックスを塗布して両方の穴を封鎖し、頭皮を縫合します。最後に、患部に神経ブロックを施します。マウスをステレオタキシス装置から取り出し、ヒートブロック上の暖かいケージに移動させて45分から1時間回復させます。最大限の再活性化を促すため、少なくとも10日間マウスを回復させます。回復後、動物に水と軟らかい餌を与え、疼痛がある場合は必要に応じてブプレノルフィンを1日2回投与します。その後、ギロチンドアを閉じた状態で、3チャンバー好みに基づく場所好みの装置の中央チャンバーにマウスを入れ、60分間の慣らし期間を設けます。馴化後、ギロチンドアを開き、マウスが3つのチャンバーすべてを1200秒間自由に探索できるようにします。テキストプロトコルのガイドラインに従い、Med PC fourソフトウェアを使用して、動物が各チャンバーで過ごした時間を記録します。プレテスト中のパフォーマンスに基づいて、マウスを条件付けチャンバーに割り当てます。続く3日間、午前のセッションでコカインを10 mg/kg投与し、直ちに割り当てられたチャンバーに1200秒間閉じ込める。マウスをホームケージに戻して4時間待機させた後、生理食塩水を投与し、直ちに反対側のチャンバーに1200秒間閉じ込める。習得を確認するため、ギロチンドアを閉じた状態でマウスを中央チャンバーに配置し、62回目の馴化期間を設ける。ギロチンドアを開き、1200秒間または記録終了まで自由に探索させます。すべてのチャンバーで過ごした時間を測定し、コカインペアチャンバーで過ごした時間から生理食塩水ペアチャンバーで過ごした時間を差し引くことで、嗜好性を算出します。マイクロインジェクションを施したマウスにCPPを行った後、特定のチャンバーへの嗜好性を獲得したとみなされます。コカイン好みの定義を、コカイン対のチャンバーでの滞在時間から生理食塩水対のチャンバーでの滞在時間を引いた時間とし、それがベースラインの好みスコアと比較して有意に高い場合を好みの獲得とする。コホート対照注射マウスがコカイン対のチャンバーへの好みを認めないか、あるいは嫌悪を示した場合は、直ちに組織学的解析により配置を確認し、配置が不適切であったマウスは研究から除外する。対照注射コホートにおいて通常通り好みが獲得された場合は、消去を開始し、パラダイムを延長する。マウスが、特定のチャンバーに対する薬物誘発性選好を消去したと見なされる条件について説明します。2日連続の消去日にわたるコカイン選好性が、この時点での獲得時の選好性スコアと比較して有意に低い場合、薬物のプライミングによって再発させることができます。薬物プライムの投与後の選好性スコアが獲得時と統計的に差がない場合、そのコホートは定量PCRを用いて、薬物ペアリングされたチャンバーに対する薬物誘発性選好を再発させたと言えます。この図は、L型カルシウムチャネルアイソフォームCAV 1.2を保有するマウスの側坐核にRAAV Cre GFPを微量注入した結果、目的遺伝子が実際にノックアウトされたことを示しています。RAAV Creを注入したパンチ試料では、ここに示すAAV GFPを注入したマウスと比較して、遺伝子発現の有意な減少が認められます。側坐核の免疫組織化学的解析でGFPを確認したところ、本手順によるRAAV Creの微量注入が適切に両側へ行われていることが明らかになりました。ある遺伝子のノックダウンが他の目的遺伝子の発現レベルに及ぼす影響に関する疑問を解消するために、定量リアルタイムPCRやウェスタンブロッティングなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、条件付け場所好みのパラダイムにおける獲得、消去、および再出現におけるこれらの遺伝子の役割を選択的に検証するために、脳定位固定マイクロインジェクションによるウイルスベクターを用いてマウス脳内の標的遺伝子を選択的に除去する方法について、より深く理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Behavior

行動

出典: Chen, S., et al., Stereotacic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウスの子犬線条体における遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

出典: Pereira, M. et al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Gial Cells into Interneurons by Intentrebral Injection of Viral Vectors.J. Vis.

マウスモデルにおけるグリア細胞リプログラミングのためのウイルスベクターの定位注射

出典: Fricano-Kugler, CJ, et al.定位注射による高力価CRISPR Retroおよびレンチウイルスの設計,パッケージングおよび送達J. Vis. 経験。(2016年)このビデオは、マウス脳における正確なニューロン遺伝子編集のための定位固定性ウイルス注射を示しています。このプロトコルは、歯状回への正確なウイルス送達を保証し、蛍光標識とCRISPRを介した遺伝子ノックアウトを可能にして、in...

マウス脳における標的ニューロン遺伝子編集のための定位固定性ウイルス注射

マイクロRNAは、脳の構造と機能に重要な役割を持っている。ここでは、設計されたmiRNAの発現レンチウイルスの定位注射を使用して過剰発現海馬のmiRNAを強制する方法について説明します。このアプローチは、評価するための比較的急速な方法として役立つことができる...

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。...

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

cDNAを発現するレンチウイルスまたはshRNAの定位注射は、マウスの特定の脳領域における遺伝子発現を調節することができます。ここでは、そのようなオープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）のような行動のタスク、と定位注射を結合するためのプロトコルを提示します。...

定位注入法を適用すると、動物の行動の遺伝的影響を研究するために、

げっ歯類は、行動の分子基質や複雑な精神障害を調査するための適切なモデルです。覚醒しているげっ歯類の脳マイクロインジェクションは、疾患基質の解明に使用できます。効率的でカスタマイズ可能な脳マイクロインジェクション法と、モチベーションを定量化するオペラントパラダイムの実行が提示されます。...

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。...

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

CRISPR / Cas9システムは、科学界にターゲットを絞ったゲノム編集がアクセス可能で、手頃な価格にする可能性を提供しています。このプロトコルは、CRISPR / Cas9システムを使用して、目的の遺伝子をノックアウトしてから、成体マウスの脳に定位的にそれらを注入するウイルスを作成する方法を実証することを意図しています。...

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

新生児マウス脳の線条体にマイクロインジェクション試薬は自家製頭固定デバイスに定位手術のプロトコルについて述べる。この手法では、新生児マウス脳の特定の領域の神経細胞で遺伝子操作ことができます。...

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

ここで説明する方法は、ラットの行動関連回路におけるコカイン誘発可塑性を光遺伝学的に逆転させるために使用される手順を概説する。視床-扁桃体シナプスの持続的な低周波光刺激は、長期うつ病(LTD)を誘発します。コカインを経験したラットにおける in vivo 光遺伝学的に誘導されたLTDは、その後の手がかり動機による薬物探索の減弱をもたらした。...

オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する

学ぶ マウス脳へのウイルスベクター定位マイクロインジェクション法。コカイン条件付け場所嗜好パラダイムの獲得・消去・再発現段階における標的遺伝子の役割を神経科学・行動解析で研究する。組織学的検証で正確性を確認する。

コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

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