マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離
October 12th, 2013
筋線維芽細胞は、正常および疾患状態の両方において重要な生理学的プロセスを調節、胃腸管の有力な間質細胞である。我々は、マウスおよびインビトロ実験のために利用することができるヒト結腸組織の両方からの一次筋線維芽細胞の単離を可能にする技術が記載されている。
この手順の全体的な目標は、マウスまたはヒトの結腸組織から一次筋線維芽細胞を単離することです。これは、最初にドナーマウスから結腸を採取し、氷冷したPBSですすぐことによって達成されます。次に、上皮細胞は、一連の洗浄と酵素処理を通じて剥離されます。
次に、上皮細胞懸濁液を組織培養皿に播種し、インキュベートします。最後に、非接着性細胞を洗い流して筋線維芽細胞を分離します。最終的には、免疫組織化学的染色による初代筋線維芽細胞の単離を示す結果を得ることができます、手順を実証することは、私の研究室の技術者と共有されます。
すべての実験は、カリフォルニア大学動物研究監督局によって承認され、マウスを吸入したイソフッ素で安楽死させ、その後子宮頸部脱臼を行った。腹側の正中線を切開することから始めます。腸を引っ込めて結腸の位置を特定し、膀胱を横方向に引っ込め、細かいはさみを使用して恥骨を特定します。
骨を切って直腸を露出させ、直腸と結腸の背側間膜を解剖し、結腸を肛門から盲腸まで固定します。次に、それを切除して結腸を小腸から切断します。試料を氷冷したPBSに置きます。
10ccのシリンジに氷冷剤を入れた後、PBSは結腸の内腔を数回洗い流して内容物を透明にします。次に、はさみを使用して結腸を縦に切り開き、20ミリリットルの氷冷を含む50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。PBSは、液体が粒子状物質なしで透明になるまでPBSを置き換え続けます。
手術前に患者から書面によるインフォームドコンセントを得ることを含む、外科患者からヒト組織を採取するためのプロトコルは、カリフォルニア大学のヒト研究保護プログラムのオフィスによって承認されました。標準的な手順を使用して行われた結腸切除から結腸壁の半インチの全層切片を取得し、すぐに氷冷PBSの上に置きます。結腸間膜およびエピロイック付属器をすべて取り除きます。
脂肪の存在は消化過程に影響を与えるため、マウスの結腸全体をHBSS中の25ミリリットルの5ミリモルEDTAを含む50ミリリットルの円錐管に入れ、摂氏37度の振とう空気浴で15分間インキュベートします。溶液を慎重に注ぎ、時計を合計5回繰り返します。人間の組織を処理するため。
ハサミを使用して4つの等しいサイズにカットし、HBSSの5ミリリットルEDTAの25ミリリットルを含む2つの50ミリリットルチューブのそれぞれに2つのピースを入れます。組織を5回洗浄すると、マウスサンプルについて実証されています。次に、マウスとヒトの組織を20ミリリットルの氷冷PBSで2回簡単に洗浄します。
次に、組織を、20ミリリットルのRPMI 5単位と10単位のディスクペースト、マウス組織用の2000単位、またはヒト組織用の20単位と4,000単位のコラゲナーゼDを含む新しい50ミリリットルのチューブに移します。チューブを立てて摂氏37度の振とうエアバスに入れ、250RPMで最大60分間、またはティッシュが糸状に見え始めるまで振とうします。チューブを2〜4回振って組織をバラバラにします。
次に、サンプルを摂氏4度で200Gで5分間ペレット化し、筋線維芽細胞を分離して培養します。消化された組織から上清を注ぎ出した後、各ペレットを10ミリリットルの冷たい塩化アンモニウムカリウムまたはCK溶解緩衝液に懸濁し、摂氏4度、200Gで5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ピペットを使用して各ペレットを10ミリリットルのRPMI 5に再懸濁します。
10ミリリットルのピペットを使用して、細胞懸濁液の半分を70マイクロメートルのメッシュストレーナーに通し、100ミリメートルのTC処理皿に入れます。各皿にさらに15ミリリットルのRPMI 5を追加します。残りの5ミリリットルの懸濁液を別々のTC処理皿に濾します。
10%二酸化炭素インキュベーターで37°Cのインキュベーターでサンプルを3時間インキュベートします。次に、培養物をHBSSで2回洗浄して非接着性細胞を除去し、新しいRPMI 5を加えます。接着細胞は、上皮細胞、マクロファージ、筋線維芽細胞から構成されます。
播種後1週間で筋線維芽細胞のみが分裂し、マクロファージ細胞と上皮細胞が分裂します。最初の継代後、細胞トリプシンはそれらを見て、それらを2対1に分割します。単離された初代ヒト筋線維芽細胞は、細胞培養で増殖させ、最大4回の継代に使用できます。
ここに示すように。細胞は、アルファ平滑筋アクチンおよび発酵陽性およびデスミン陰性として特徴付けられる。腸の上皮下筋線維芽細胞と一致して、それらはまた特徴的な星状の形態を持っています。
初代筋線維芽細胞は、細胞株で同定された実験結果を確認するために使用できます。例えば、18個のco細胞を炎症誘発性サイトカインに曝露します。TNFアルファは、EGF受容体発現の時間依存的な増加をもたらしました。
これは、EGF誘導性COXの2発現およびP 42 44 MAキナーゼのリン酸化の増強と相関していました。これらの実験結果を検証するため。実験は、結腸直腸癌患者の外科的に切除された結腸から単離された初代ヒト筋線維芽細胞を使用して繰り返されました。
これらの図は、初代ヒト筋線維芽細胞が、18 co細胞株の整列で最初に同定された実験結果と密接に類似していることを示しています。このビデオを見た後、マウスまたはヒトの結腸組織から初代筋線維芽細胞を分離する方法を十分に理解しているはずです。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、マウスおよびヒトの結腸組織から一次筋線維芽細胞を分離する技術について説明しています。筋線維芽細胞は、健康と疾患において様々な生理学的プロセスに影響を与える消化管において重要な役割を果たしています。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 消化器生理学
- 間質細胞研究
背景
- 筋線維芽細胞は消化管における重要な間質細胞です。
- それらは主要な生理学的プロセスを調節します。
- その分離の理解は、in vitro 研究にとって重要です。
- この技術はマウスとヒトの両方の組織に適用できます。
研究の目的
- 一次筋線維芽細胞を分離するための信頼できる方法を提供すること。
- これらの細胞によるin vitro 実験を容易にすること。
- 健康と疾患における筋線維芽細胞の機能の理解を深めること。
使用された方法
- ドナーマウスから結腸組織を採取すること。
- 組織を氷水冷却のPBSで洗浄すること。
- 洗浄と酵素処理を通じて上皮細胞を剥離すること。
- 上皮細胞懸濁液を培養してインキュベーションすること。
主な結果
- 一次筋線維芽細胞の成功的な分離。
- 免疫組織化学的染色による検証。
- 実験技師による手順のデモンストレーション。
結論
- 記述された技術は筋線維芽細胞を効果的に分離します。
- この方法は様々なin vitro 研究に利用できます。
- 筋線維芽細胞の生物学の理解は消化管研究にとって重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue provides a physiologically relevant model for studying stromal cell contributions to gastrointestinal pathophysiology. This approach reduces reliance on immortalized cell lines, enhancing target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery. The method supports translational continuity by enabling direct comparison of findings across species and disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a disease-relevant stromal cell system.
- Operational Value: Provides a biologically de-risked model for functional target validation.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by confirming cell line findings in primary human cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible primary cell preparations for assay readiness.
- Operational Value: Yields quantitative outputs such as marker expression and morphological characterization.
- Scientific Value: Facilitates reliable compound evaluation in a native stromal context.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through direct isolation from human colon tissue.
- Operational Value: Enables preclinical validation with cells reflecting patient-derived biology.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions via mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early biology and enabling scalable assay development for lead identification.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking using primary stromal cells.
- Screening: Delivers reproducible, adherent cell populations suitable for compound screening.
- Analytics: Provides immunohistochemical and morphological readouts for condition comparison.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work through human tissue-derived models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, cross-species platform for stromal cell research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation and reduces mechanistic ambiguity in GI disease models.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across mouse and human tissue workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating findings in primary human cells.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on translational biomarker alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and cell culture techniques.
- Dependent on access to fresh mouse and human colon tissue under compliant protocols.
- Necessitates sterile culture conditions and equipment for enzymatic treatment and plating.
- Involves optimization of collagenase and dispase concentrations for species-specific tissue digestion.
- Limited by finite proliferative capacity of primary myofibroblasts in culture.
