二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

本手順の全体的な目的は、2段階のコラゲナーゼ還流法を用いてヒト肝細胞を単離することです。まず、灌流カニューレを用いて肝組織片の血管にカニュレーションを行い、続いてコラゲナーゼを用いて肝組織片の還流および消化を行うことでこれを達成します。

第3ステップは、グリソン鞘を除去して解離した肝細胞を放出させることです。最終ステップは、低速遠心分離を行い、肝細胞を単離することです。最終的に、肝細胞は位相差顕微鏡または免疫細胞化学によるアルブミン染色で同定でき、肝細胞の生存率と収量はトリパンブルー排除試験を用いて決定します。

カニューレ挿入と消化のステップは習得が困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要です。これは、カニューレ挿入には熟練した技術を要し、また消化の完了を判断することが難しいためです。本手技に不慣れな方向けに、私の研究室の技術者であるNatalie Lunが手順の実演を行います。

本デモンストレーションでは、ヒトの肝組織の代わりに羊の肝臓の一部を使用します。肝組織の灌流用装置を次のようにセットアップし、溶液が肝組織に到達した際に37 °Cになるよう、ウォーターバスを適切な温度に設定してください。溶液1、2、および3については41 °Cが適しています。一方で、ジャケット付きガラス凝縮器を通る溶液4については、コラゲナーゼ活性の低下を抑えるため、37 °Cに保つ必要があります。灌流の直前にガスレギュレーターをオンにします。病理医から、理想的にはグリソン鞘がほぼ完全または完全に維持されており、切除面が1面のみである肝組織を入手してください。

穿孔フィルターディスクを備えたブフナー漏斗の上に肝臓片を置いた状態で、低流量で溶液1を用いて灌流システムのプライミングを行います。切り口にある肝臓片の太い血管に、オリーブチップ付きの曲がり灌流カニューレを挿入してください。血液が肝臓から洗い流されるにつれて、灌流が良好な領域の組織は色が薄くなります。使用するカニューレの数は、肝臓のサイズによって異なります。

一般的に、20 g未満から80 g超までの肝臓に対しては、4本から8本のカニューレを使用します。カニューレのゲージは、ぴったりと確実に固定されるものを選択してください。緩衝液が組織から排出されるよう、小さな血管は開放したままにしておきます。

次に、ペリスタルティックポンプの流量を110から460 milliliters per minuteの間に上げます。使用した流量において、肝片全体の色が淡くなっていれば、灌流が良好であると言えます。灌流速度は肝臓のサイズによって異なり、大きな肝臓ほど高い灌流速度を使用します。

一般的に、さまざまな肝重量において、カニューレ1本あたり平均44 milliliters per minuteの灌流速度が理想的です。選択した流量により、肝片がわずかに膨張する状態にする必要があります。灌流中は、生理食塩水に浸したガーゼで肝片を覆い、湿った状態を維持してください。

組織を溶液1で1リットル灌流し、肝組織内に残っている血液を洗い流します。灌流液を溶液2に変更し、10分間灌流します。次に、灌流液を溶液3に切り替え、0.5リットルで灌流します。

次に、灌流液をコラゲナーゼを含む溶液4に変更します。この灌流を、肝臓が十分に消化されるまで、または9～12分間、再循環方式で実施します。肝組織は、グリソン鞘の下でわずかに分解され始めたように見えるはずです。

メスのできあがり（鈍端）で触れた際、肝臓が軟化したと感じられる必要があります。過剰な消化は肝細胞の生存率低下を招き、不十分な消化は肝細胞の回収率低下につながるため、肝臓組織を適切な時間消化することが重要です。まず、ペリスタルティックポンプの電源を切り、肝臓組織からカニューレを取り除きます。

次に、組織を100から200 millilitersの溶液が入った結晶化皿に入れます。5. グリステンスカプセルを慎重に取り出し、細胞を優しく振り出します。十分に灌流されていない領域がある場合は、メスを用いてそれらの領域を切断し、内部に含まれる細胞を放出させます。

必要に応じて溶液5を追加し、最終的に溶液5の容量を500 millilitersにします。次に、細胞懸濁液を2回ろ過します。まず、細胞を210 micronのナイロンメッシュでろ過し、1 literのコニカルフラスコに回収します。

次に、細胞を70 micronのナイロンメッシュでろ過し、1 literのコニカルフラスコに回収します。細胞懸濁液を等量ずつ2本の200 milliliter遠心チューブに分注します。その後、ろ過した細胞懸濁液を4 °Cで72 Gsにて5分間遠心分離します。

上清を吸引し、細胞ペレットを約 200 milliliters の溶液で穏やかに再懸濁します。5. 遠心分離と再懸濁を3回繰り返します。最後の遠心分離後、細胞を冷 storage solution で再懸濁し、最終濃度を 2 to 5 million hepatocytes per milliliter に調整します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を正確に測定するには、tripan blue アッセイを使用できます。

ここに示すのは、648回の分離で得られたトリパンブルー染色済みの肝細胞である。分離したヒト肝細胞の平均生存率は77 ± 10%であった。肝細胞の平均回収量は、免疫蛍光法により、肝組織1gあたり13 ± 11 × 10⁶個であった。アルブミンで緑色に陽性染色された分離肝細胞の純度は、肝細胞の純度を決定した結果、94 ± 1%であった。

免疫蛍光染色は、1回の試験につき5つのレプリケートを用いて4回実施しました。位相差顕微鏡により、細胞サイズが大きく多角形であるといった肝細胞の形態学的特徴が示されています。このビデオを視聴することで、2段階コラゲナーゼ灌流法を用いてヒト肝細胞を単離する方法について十分に理解できるはずです。