Name: 二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学ぶ二段階コラゲナーゼ灌流法によるヒト肝細胞の分離技術。血管カニュレーションと低遠心分離を用いて高生存率・高収量の肝細胞を得られ、肝臓再生や薬物動態学・毒性学研究に応用可能です。

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この作品は、研究のためのヒト組織を利用できるようになり、ヒト組織および細胞研究財団、によって可能になりました。そしてHepacult社、この仕事のための財政支援は、連邦教育研究省（：バーチャル肝ネットワーク、助成金番号0315759助成名）から受信されました。私たちのおかげで、また肝灌流および肝細胞の分離を実施するための肝臓サンプルおよび細胞単離基盤施設からの技術的なアシスタントの収集のためGrosshadern病院組織バンクからの技術的なアシスタントにアクセスしてください。特に、我々はビデオでこの手順を実証するためのNataljaレーヴェンに感謝したいと思います。最後に、我々は、ビデオの概略の図1のためのイラストや図形を作成するためのNataljaレーヴェンとEdeltraud Haneschに感謝したいと思います。

1。灌流および分離された溶液の調製<ol><li>肝臓片と、表1によると、肝細胞の単離灌流のために必要なソリューションを準備します。溶液は使用時まで4℃で保存することができる。 </li><li>無菌フィルター0.22μmのフィルターを使用して、すべてのソリューションを提供しています。 </li><li>肝臓と接触するすべてのソリューションは無菌でなければならない。 </li></ol> 2。灌流機器とソリューションの作成<ol><li> 図1に示すように、肝臓片の灌流のための機器は、セットアップする必要があります。 </li><li>水浴は、それらが肝臓片に到達したときに溶液が37℃の温度であるように、各特定の実験設定で異なる適切な温度に設定されるべきである。この場合には、水浴を溶液1,2および3とジャケット付きガラス凝縮器を温めるために41°Cに設定されている。溶液4に温めべきであるコラゲナーゼ活性の損失を低減するために使用するための別個の水浴中で37℃で。 </li><li>まもなく肝灌流の前に、酸素化装置（ 図1E）をガスに95％のO 2/5％CO 2を含むガスのタンクのレギュレータをオンにします。 </li></ol> 3。肝臓の灌流<ol><li>肝臓ピースできるだけ多くそのままグリソン鞘と、理想的には唯一の1切断面には、灌流のための病理学者から入手する必要があります。 </li><li>有孔フィルターディスク（ 図1B）が含まれてブフナー漏斗上、この肝臓ピースを置きます。 </li><li>灌流システムは、ソリューション1で下塗りする必要があります。 </li><li>低流量で、オリーブ先端を有する湾曲灌注カニューレは、肝臓片の切断面に大きな血管内に挿入されるべきである。血液が肝臓から洗い流すように、組織はよい潅流地域で軽くなる。様々なサイズのために使用さカニューレの数肝臓の図2Aに示されている。選択されたゲージのサイズが所定の位置にカニューレを保持するぴったりフィットをもたらすべきである。小さい血管が肝臓片の外に排出する灌流液のためオープンにしてください。 </li><li>肝臓（ 図2B）のサイズに応じて、ml /分110-460の間に蠕動ポンプでの流量を増加させる。これは、カニューレあたり44±16 ml /分（ 図2C）の平均流量をもたらす。選択した速度は、肝臓片に依存し、肝臓片のわずかにプランピングアップにつながるはずです。いくつかの場合においては、上述したわずかなプランピングを達成するために、微小血管クランプを備えた開放血管の一部を遮断クランプする必要があるかもしれない。肝臓片は全体を通して明るい色である場合に良好な灌流を観察することができる。 </li><li>生理食塩水に浸したガーゼで覆うことにより、灌流中の湿った肝作品を保管してください。 </li><li>任意のRを洗い流すためのソリューション1 1Lで灌流肝臓枚で血をemaining。 </li><li>解決策2に灌流液を変更し、10分間灌流する。 </li><li>解決策3に潅流液を切り替えて、0.5 Lで灌流</li><li>コラゲナーゼ（ 表2）の0.1から0.15パーセントを含む溶液4に灌流液を変更します。 </li><li>肝臓が十分に消化されるまで、このステップでは、灌流は9月12日分の再循環方法で実施あるいはすべきである肝組織はグリソン鞘の下に離れて少し破っての鈍側でプローブ時に軟化感じるように表示されます小刀。 </li></ol> 4。肝細胞を単離する<ol><li>蠕動ポンプの電源を切り、肝臓片からカニューレを取り外します。 </li><li>ソリューション5 100〜200 mlを含む結晶皿で肝ピースを置きます。 </li><li>慎重にグリソン鞘を外し、静かにセルを横に振る。よく灌流されていない領域がある場合は、外科用メスを介して切断するために使用することができるこれらの領域は、中に含まれる細胞を放出する。プロセス中に必要に応じてより多くのソリューション5を追加します。 </li><li> 500ミリリットルの最終体積に達するまで、より多くのソリューションの追加5。 </li><li>二回細胞懸濁液をフィルタリング、最初の70ミクロンのナイロンメッシュに続いて210ミクロンのナイロンメッシュ。次に、30mlを200ml遠心管に細胞懸濁液を注ぐ。 </li><li> 4℃で5分間、72 gで細胞懸濁液を遠心分離上清を吸引し、ゆっくりと溶液5の200ミリリットル中に静かに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>洗浄工程数4.6 3回繰り返します。最後の遠心分離ステップで、（材料のリストを参照）低温貯蔵溶液中で細胞を再懸濁。細胞は血球計数器ベースのトリパンブルー排除アッセイを用いて収量と生存性の評価のためのミリリットル当たり約2から5000000肝細胞である必要があります。 </li><li>トリパンブルー排除アッセイを実施するために、パンブルーsolutiの0.5ミリリットルを含む微量遠心管に（≈2から5000000 / ml）を適切に希釈した細胞の0.1ミリリットルを追加オン（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、0.4％トリパンブルー）と0.4mlのPBS。完全に細胞懸濁液を混合した後、懸濁液を血球計数器をロードし、100Xの倍率で顕微鏡下で調べる。生きた細胞は染色されていない表示されている間、顕微鏡下では、死んだ細胞が青く染色されます。血球計数器上にマークさ1ミリメートル2のグリッドのそれぞれに住んでいて、全細胞の数を数える。生存率（％）、生細胞（中低温貯蔵溶液あたり百万肝細胞（CSS）又はg肝臓肝細胞あたり百万）の収率は以下の式を用いて計算することができる。 </li></ol><img alt="式（1）" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" /> 注：この場合には、トリパンブルー希釈係数は10であり、血球計係数は、10,000である。

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<li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue%3A+a+one+hundred+liver+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222(2011).</li>
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</ol>

このプロトコルの最適化は、部分的にHepacult社からの助成金によって賄われていた。博士ヴォルフガングThaslerはHepacult社の創設者の1であり、この会社では取締役会のメンバーの一つである。 Maresa Demmelの雇用がHepacultにより部分的にである。マリアHaunerはHepacult GmbHが採用されている。 Hepacultは同意と研究目的のためのオープンアクセスをヒト肝細胞を提供しています大学からスピンオフバイオテクノロジー会社である。

このプロトコルは、高い生存率および純度のヒト肝細胞を単離することになる。これらの結果を達成するためには、肝臓の適切な個数で開始することが重要である。肝臓の一部は、1切断面を除くすべての表面上でそのままグリソン鞘を持つ必要があります。別の重要な要因は、異なるバッチの消化後11肝細胞の生存率の著しい違いをもたらすことができるように、使用されるコラゲナーゼの特定のバッチである。したがって、コラゲナーゼの異なるバッチを試験されるべきであり、最高の生存率肝細胞を生成するバッチを大量に得られるべきである。最後に、適当な消化時間は、得られた細胞の収率および生存能力に基づいて選択されな​​ければならない。例えば、低利回りの高い生存率が不十分な消化時間を示している可能性があり、低生存能力の高収量は消化時間が長すぎることを示している可能性があります。 この方法では、tは適合させることができるO同じ肝臓片から非実質細胞と肝細胞を分離します。これを行う一つの方法は、非実質細胞の単離12に直接最初の遠心分離ステップ（ステップ4.6）からの上清を使用することである。...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

肝細胞懸濁液を機械的または酵素的方法によって肝臓から調製することができる。全体の肝細胞を調製するために使用される機械的な方法は、チーズクロス2を介して肝臓を強制カーンシェーカー3におけるガラスビーズの肝臓片を振盪、長年にわたりなど緩い乳棒4,5有するガラスホモジナイザーを用いて、機械的な方法は、外に落ちて含むにより、細胞膜の損傷と単離肝細胞6,7の機能喪失に有利に働く。したがって、酵素的方法の使用は、現在、肝細胞の単離のための主要な方法である。 ベリーと友達8は 、ラットにおける門脈経由で肝臓をコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼを灌流したとき、酵素法を用いて肝細胞の単離は大きく改善されました。この灌流過程を導く、酵素は細胞の大部分に密着できるようにするために血管系を利用した肝細胞8の収量の6倍の増加。さらに、この方法は、事実上孤立小胞への小胞体の変換なしなしミトコンドリア損傷8で、その構造的完全性を保持された細胞が得られた。 この方法は、肝細胞の単離のために二段階灌流手順を開拓Seglen 1によって改変した。この手順では、ラットの肝臓のCa 2 +を含有する1コラゲナーゼ緩衝液で灌流、続いてのCa 2 +を含まない緩衝液で灌流される。第二工程におけるCa 2 +の添加は、最適なコラゲナーゼ活性1,9に必要とされている間第一工程におけるCa 2 +の除去は、デスモソームを破壊するのに役立つ。 上記の発表された研究は、ラットで行われたことを考えると、この記事では、ハムから高い生存して肝細胞の単離に使用することができます変更された手順を実証することを目的と肝臓。ヒト肝細胞の使用は、トランスレーショナル研究のための動物モデルを用いた実験を検証するための重要なままです。本研究で用いたヒト肝臓片を、ヒト組織および細胞研究基金、国営の非営利財団10を通じてガバナンスの同意を得て取得した。病理学者は、診断のために必要であったものを除去した後、肝臓片を残りの組織から採取した。病理学者によって区画さ組織は、形態学的に肝切除後の切除縁から得た健康な組織だった。

<table><tbody><tr><td>バブルトラップ</td><td>Ga&szlig;グラステニク</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスジャケットコンデンサーGa</td><td>&szlig;グラステニク</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>41度;C ウォーターバス</td><td>ジュラボ</td><td>35723-H24/EG&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>37度;C ウォーターバス</td><td>GFL</td><td>1083</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>圧縮ガスボンベ(95 % O2/5 % CO2)</td><td>Linde</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガス透過性チューブ</td><td>Neolab</td><td>2-4440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Ismatec</td><td>IP65</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>メス</td><td>フェ</td><td>ザー320010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>オムニラボ</td><td>5171014</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>円錐形フラスコ 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>円錐形フラスコ 5 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121673</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>ショット・デュラン</td><td>2110654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 ml遠心分離管ベ</td><td>クトンディキンソン</td><td>352075</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>結晶化皿</td><td>オムニラボ</td><td>5144063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ボールチップ付き湾曲灌漑カニューレ</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロ血管クランプ</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>B&uuml;chner漏斗</td><td>カールロス</td><td>HT38.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ210 &mu;m</td><td>ネオラボ</td><td>4-1413</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ70 &mu;m</td><td>ネオラボ</td><td>4-1419</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.22 以上 μ;m 滅菌フィルター</td><td>Peske</td><td>99505</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>500mlボトルショット</td><td>デュラン</td><td>2180144</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1 Lボトルショット</td><td>デュラン</td><td>2180154</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Peske</td><td>06-0001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mlチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120,086</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mlコニカルチューブBD</td><td>Biosciences</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>ネオラボ</td><td>1508454</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>滅菌パスツールピペット</td><td>ブランド</td><td>747715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>電動ピペットフィラー(ピペットボーイacu)</td><td>インテグラ155017</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>層流</td><td>ケンドロ</td><td>ヘラ安全-KS9</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アスピレーター(低流量医療用吸引ポンプ)</td><td>Atmos</td><td>C361</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>実験室用ガスバーナー</td><td>インテグラ</td><td>Fire Boy eco</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>使い捨て白衣</td><td>Paperlynen GmbH</td><td>MD0202414</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>バイザー付きサージカルマスク</td><td>Kimberly-Clark</td><td>48247</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>手術用フード</td><td>Barrier</td><td>42072</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ラテックス手袋</td><td>Semper Care</td><td>CE0321</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ(バッチ番号 NB 4G)</td><td>Serva</td><td>17465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td>メル<td>ク</td><td>2382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Roth</td><td>9265.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヘペス</td><td>ロス</td><td>9105.3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Serva</td><td>26868</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アルブミン</td><td>バイオモール</td><td>01400-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>セルバ</td><td>22700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>Serva</td><td>30180</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.4%トリパンブルー溶液</td><td>ロンザ</td><td>17-942E</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>冷蔵ソリューション</td><td>Hepacult GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

肝臓、例外的な再生能力を有する器官は、解毒、代謝及び恒常性などの機能の広い範囲を実行する。このように、肝細胞は、研究課題の多種多様のための重要なモデルである。特に、ヒト肝細胞の使用は、薬物動態、毒性、肝再生および翻訳研究の分野で特に重要である。したがって、この方法は、Seglen 1によって記載されるように肝細胞を単離するために2段階コラゲナーゼ灌流手順の修正版を提示する。 以前に、肝細胞は、機械的な方法によって単離されている。しかし、酵素法は、肝細胞が分離した後にその構造的完全性と機能を保持するように優れていることが示されている。ここで紹介するこの方法は、77±10％の生存と肝細胞の大規模な収率でヒトの肝臓片と結果に対するラットの肝臓のために以前に設計された方法を適応させる。メインこの手順の違いは、血管のカニューレ挿入するプロセスである。また、ここで説明する方法はまた、匹敵する肝臓または血管サイズを有する他の種由来の肝臓に適用することができる。

灌流セットアップ肝灌流に必要な機器は、 図1に応じて設定する必要があります。 単離されたヒト肝細胞の生存率および収量単離されたヒト肝細胞の平均生存率は77±10％であった肝細胞の平均収量は、平均値±標準偏差として表される値を使用して、13±1100万肝細胞/ g肝臓であった。肝細胞の単離の数は、648アイソレーションは、1999年1月から2012年12月から実施されたこれらの平均を得るために実施。 適切な灌流パラメータ成功したフラッシングおよび肝臓の灌流を行うために、使用されるカニューレの数は、肝臓（ 図2A）の重量に応じて変化すべきである。一般的に、4〜8カニューレは20グラム、下から80グラム以上に及ぶ肝臓のために使用されるべきである。潅流の適切な速度また、肝臓重量に依存する、肝臓（ 図2B<...

ヒト肝細胞の単離のための修飾された二工程コラゲナーゼ灌流手順が記載されている。この方法はまた、他の哺乳動物の肝臓にも適用することができる。単離された肝細胞は、それらのような肝臓の再生、薬物動態および毒物学などの分野での科学的研究に適したモデル作り、高い収率および生存度で提供されています。

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

本手順の全体的な目的は、2段階のコラゲナーゼ還流法を用いてヒト肝細胞を単離することです。まず、灌流カニューレを用いて肝組織片の血管にカニュレーションを行い、続いてコラゲナーゼを用いて肝組織片の還流および消化を行うことでこれを達成します。第3ステップは、グリソン鞘を除去して解離した肝細胞を放出させることです。最終ステップは、低速遠心分離を行い、肝細胞を単離することです。最終的に、肝細胞は位相差顕微鏡または免疫細胞化学によるアルブミン染色で同定でき、肝細胞の生存率と収量はトリパンブルー排除試験を用いて決定します。カニューレ挿入と消化のステップは習得が困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要です。これは、カニューレ挿入には熟練した技術を要し、また消化の完了を判断することが難しいためです。本手技に不慣れな方向けに、私の研究室の技術者であるNatalie Lunが手順の実演を行います。本デモンストレーションでは、ヒトの肝組織の代わりに羊の肝臓の一部を使用します。肝組織の灌流用装置を次のようにセットアップし、溶液が肝組織に到達した際に37 °Cになるよう、ウォーターバスを適切な温度に設定してください。溶液1、2、および3については41 °Cが適しています。一方で、ジャケット付きガラス凝縮器を通る溶液4については、コラゲナーゼ活性の低下を抑えるため、37 °Cに保つ必要があります。灌流の直前にガスレギュレーターをオンにします。病理医から、理想的にはグリソン鞘がほぼ完全または完全に維持されており、切除面が1面のみである肝組織を入手してください。穿孔フィルターディスクを備えたブフナー漏斗の上に肝臓片を置いた状態で、低流量で溶液1を用いて灌流システムのプライミングを行います。切り口にある肝臓片の太い血管に、オリーブチップ付きの曲がり灌流カニューレを挿入してください。血液が肝臓から洗い流されるにつれて、灌流が良好な領域の組織は色が薄くなります。使用するカニューレの数は、肝臓のサイズによって異なります。一般的に、20 g未満から80 g超までの肝臓に対しては、4本から8本のカニューレを使用します。カニューレのゲージは、ぴったりと確実に固定されるものを選択してください。緩衝液が組織から排出されるよう、小さな血管は開放したままにしておきます。次に、ペリスタルティックポンプの流量を110から460 milliliters per minuteの間に上げます。使用した流量において、肝片全体の色が淡くなっていれば、灌流が良好であると言えます。灌流速度は肝臓のサイズによって異なり、大きな肝臓ほど高い灌流速度を使用します。一般的に、さまざまな肝重量において、カニューレ1本あたり平均44 milliliters per minuteの灌流速度が理想的です。選択した流量により、肝片がわずかに膨張する状態にする必要があります。灌流中は、生理食塩水に浸したガーゼで肝片を覆い、湿った状態を維持してください。組織を溶液1で1リットル灌流し、肝組織内に残っている血液を洗い流します。灌流液を溶液2に変更し、10分間灌流します。次に、灌流液を溶液3に切り替え、0.5リットルで灌流します。次に、灌流液をコラゲナーゼを含む溶液4に変更します。この灌流を、肝臓が十分に消化されるまで、または9～12分間、再循環方式で実施します。肝組織は、グリソン鞘の下でわずかに分解され始めたように見えるはずです。メスのできあがり（鈍端）で触れた際、肝臓が軟化したと感じられる必要があります。過剰な消化は肝細胞の生存率低下を招き、不十分な消化は肝細胞の回収率低下につながるため、肝臓組織を適切な時間消化することが重要です。まず、ペリスタルティックポンプの電源を切り、肝臓組織からカニューレを取り除きます。次に、組織を100から200 millilitersの溶液が入った結晶化皿に入れます。5. グリステンスカプセルを慎重に取り出し、細胞を優しく振り出します。十分に灌流されていない領域がある場合は、メスを用いてそれらの領域を切断し、内部に含まれる細胞を放出させます。必要に応じて溶液5を追加し、最終的に溶液5の容量を500 millilitersにします。次に、細胞懸濁液を2回ろ過します。まず、細胞を210 micronのナイロンメッシュでろ過し、1 literのコニカルフラスコに回収します。次に、細胞を70 micronのナイロンメッシュでろ過し、1 literのコニカルフラスコに回収します。細胞懸濁液を等量ずつ2本の200 milliliter遠心チューブに分注します。その後、ろ過した細胞懸濁液を4 °Cで72 Gsにて5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを約 200 milliliters の溶液で穏やかに再懸濁します。5. 遠心分離と再懸濁を3回繰り返します。最後の遠心分離後、細胞を冷 storage solution で再懸濁し、最終濃度を 2 to 5 million hepatocytes per milliliter に調整します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を正確に測定するには、tripan blue アッセイを使用できます。ここに示すのは、648回の分離で得られたトリパンブルー染色済みの肝細胞である。分離したヒト肝細胞の平均生存率は77 ± 10%であった。肝細胞の平均回収量は、免疫蛍光法により、肝組織1gあたり13 ± 11 × 10⁶個であった。アルブミンで緑色に陽性染色された分離肝細胞の純度は、肝細胞の純度を決定した結果、94 ± 1%であった。免疫蛍光染色は、1回の試験につき5つのレプリケートを用いて4回実施しました。位相差顕微鏡により、細胞サイズが大きく多角形であるといった肝細胞の形態学的特徴が示されています。このビデオを視聴することで、2段階コラゲナーゼ灌流法を用いてヒト肝細胞を単離する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ない細胞株が存在しないと肝類洞内皮細胞（SECS）の研究は、動物から得られた初代培養細胞を使用して実行する必要があります。このメソッドは、その後の培養と実験のためのSECの浄化のための肝臓の消化および分画遠心法に依存しています。...

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

ラット肝臓からポータル線維芽細胞を単離するための手法が説明されています。肝臓を灌流し、消化され...

ラットポータル線維芽細胞の分離により、<em&gt;その場</em&gt;肝灌流

同じドナーからヒト肝細胞と非実質肝細胞を分離する技術が説明されています。さまざまな肝細胞タイプが、機能的な肝臓モデルと組織工学の基礎を構築します。この新しい方法は、肝細胞を高収量で生存率で単離することを目的としています。...

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

このプロトコルの目的は、肝臓から高生存率および肝細胞と類洞内皮細胞の高収率を取得することです。これは、灌肝門脈、肝細胞と類洞内皮細胞を取得する差動遠心分離の続くタイプ IV...

精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

これは、肝臓から組織外細胞小胞(EV)を分離するためのプロトコルです。このプロトコルは、コラゲナーゼ灌流を含む2段階のプロセスを記述し、その後、肝臓組織EVを分離するための差動超遠心分離を行う。...

肝臓からの組織外細胞小胞の分離

ここで提示するプロトコルは、修飾コラゲ素灌流技術を用いた成体マウス肝臓からのマウス肝細胞の単離のためのプロトコルである。また、3Dコラーゲンサンドイッチ設定における肝細胞の長期培養と、胆道形成および治療に対する応答を研究するための細胞骨格成分の免疫標識についても説明する。...

インビトロにおける胆道カネラ形成における細胞骨格の役割を研究する原発マウス肝細胞の単離と3Dコラーゲンサンドイッチ培養

このプロトコルは、特別な静脈内カテーテル、標準化された滅菌使い捨てチューブ、リアルタイムモニタリングによって補完される温度制御、および単離された初代ラット肝細胞の生存率、収量、および機能性の一貫性を改善するための2段階コラゲナーゼ灌流手順のための警報システムの使用を詳述する。...

多パラメータ灌流制御による原発性ラット肝細胞の単離

脂肪酸β酸化は、肝細胞を含む多くの異なる細胞型においてエネルギーを生成する役割を担う必須代謝経路である。ここでは、...

単離したてのマウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

脂質を含んだ肝細胞は肝臓の再生に固有のものですが、通常は密度勾配遠心分離で失われます。ここでは、脂肪肝細胞を保持する最適化された細胞分離プロトコルを提示し、マウスの部分肝切除後に再生肝細胞の代表的な集団を生み出します。...

マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro...

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

学ぶ二段階コラゲナーゼ灌流法によるヒト肝細胞の分離技術。血管カニュレーションと低遠心分離を用いて高生存率・高収量の肝細胞を得られ、肝臓再生や薬物動態学・毒性学研究に応用可能です。

二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

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