Name: 単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御法。リアルタイムモニタリングで低酸素状態のグルコース応答とプレコンディショニング効果を可視化し、膵島移植の現場での低酸素障害の定義に貢献する。

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この作業は、National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO)、NSF 0852416 (DTE)、Chicago Diabetes Project の支援を受けました。

1. マウス島の準備
<ol>
	<li>C57BL/6マウスを解剖し、コラゲナーゼ消化とFicoll密度勾配分離により膵島を分離します。(2,3で参照されているJOVEの記事を参照してください)。</li>
	<li>10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 20 mM HEPES をペトリ皿 (37 °C、5% CO2) に含む RPMI-1640 培地で膵島をインキュベートします。分離後、実験で使用する前に24時間膵島を培養します。一貫した結果を確保するために、1〜2日以内に小島を使用してください。</li>
</ol>
2. マイクロ流体プラットフォームを作る
<ol>
	<li>各デバイス層の透明フォトマスク上に、1)入口と出口、2)ペリフュージョンチャンバー付きグルコースマイクロ流体層(直径8 mm x 3 mm、150 μl)、3)マイクロウェル付き200 μmメンブレン(直径500 μm、深さ100 μm)、4)ガスマイクロ流体層の微細構造形状を生成します。</li>
	<li>入口層と出口層を製造するには、脱気した予混合PDMSをブランクのペトリ皿に1.5mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。</li>
	<li>グルコースマイクロ流体層を作製するには、SU8-2150の2つの350μm層を回転させて、4inシリコンウェーハ上に単一の700μm層を形成します。
	<ol>
		<li>適切なフォトマスクを介してUV光を露光し、開発後にSU8にマイクロチャネルパターンを転写し、高さ700μmのマスターを生成します。</li>
		<li>脱気し、予混合したPDMSをこのマスターに3mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。このPDMSをカミソリの刃で形を整えます。</li>
		<li>直径2mmの入出力ポートと直径8mmのチャンバーをパンチします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>マイクロウェルで200μmのメンブレンを作製するには、SU8-2100を100μmに回転させ、同じUVリソグラフィーを適用して、この高さ100μmのマスターにマイクロウェルパターンを転写します。
	<ol>
		<li>このマスターにPDMSを900rpmで30秒間スピン脱気し、予混合し、80°Cで10分間硬化させます。同じ条件で最初の層の上に2番目の層を回転させ、マイクロウェルパターンを含む200μmのPDMSメンブレンを生成します。</li>
		<li>このメンブレンに直径2mmの入出力ポートをパンチします</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ガスマイクロ流体層を作製するには、SU8-2100を100μmに回転させ、同じUVリソグラフィーを適用して、この高さ100μmのマスターにガスマイクロ流体パターンを転写します。
	<ol>
		<li>脱気し、予め混合したPDMSをこのマスターに1.5mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。</li>
		<li>このレイヤーに直径2mmの入出力ポートを打ち抜きます</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多層を接着するには、スコッチテープで洗浄し、コロナアークにさらした後、次の順序で手で位置合わせして準備します。
	<ol>
		<li>マイクロウェルを上に向けて、メンブレンを下部のガス層に接着します。</li>
		<li>グルコースマイクロ流体をマイクロウェルメンブレンの上に接着します。</li>
		<li>入口層と出口層を最上部に接着し、アセンブリ全体をカプセル化します。</li>
		<li>1kgの重りを上に増やし、100°Cで3時間焼いて接着を補強します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成したデバイスを水層に水を入れ、デバイス全体を水中に沈めてリークテストします。次に、空のシリンジでガス層に空気を流します。</li>
	<li>漏れのないデバイスを70%エタノールで水層を通して滅菌し、PBSバッファーでフラッシュし、デバイスを4°Cで保存して使用します。</li>
</ol>
3. マイクロディスペンサーのセットアップ
<ol>
	<li>2つのマイクロディスペンサー、5Vおよび20VのDC電源、および酸素混合と供給のセットアップを構築するためのデジタルI/Oボードを入手します。
	<ol>
		<li>マイクロディスペンサーのコントロールリード線を付属のドライバーユニットに接続します。</li>
		<li>Labview制御器に対応するポートでドライバをデジタルI/Oボードに接続します。</li>
		<li>5 Vおよび20 Vの電源をドライブユニットの対応する接点に接続します。</li>
		<li>デジタルI/Oをラップトップに接続して、ガス制御用のLabviewコードを実行します(付録)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1つのマイクロディスペンサーを窒素に接続し、もう1つのマイクロディスペンサーを圧縮空気に接続し、どちらも5%のCO2で接続します。両方のガスを2psiに設定します。マイクロ流体デバイスに入る前に、ディスペンサーの出力をT字路につない</li>でください。
	<li>リークテスト済みのデバイスを使用して、マイクロディスペンサーを5〜21%の酸素間で循環させることにより、酸素変調の過渡応答を特徴付け、光ファイバー酸素センサーで水中の溶存酸素を測定します(機器リストと代表的な結果を参照)。</li>
</ol>
4. 顕微鏡でのセットアップ
<ol>
	<li>デバイスを倒立顕微鏡の加熱ステージに取り付けます。</li>
	<li>0%および21%O2ガスをデバイスに接続し、酸素センサーで校正します。</li>
	<li>グルコースマイクロフルイディクスの出力ポートをフラクションコレクターに接続します。</li>
	<li>Krebs Ringer 重炭酸塩緩衝液(KRB)を調製します:129 mM NaCl、5 mM NaHCO3、4.7 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1 mM CaCl2·2H2O、1.2 mM MgSO4·7H2O、10 mM HEPES pH 7.35-7.40、2 mM 基礎グルコース、および5% FBS。</li>
	<li>37°Cの水浴に浸した50 mLのコニカルチューブに、それぞれ2 mMおよび14 mMのグルコースを含む2つの緩衝液を調製します。</li>
	<li>ペリスタルティックポンプを接続して、250 μl/minのバッファーをチューブに吸引します。マイクロ流体デバイスに入る前に、37°Cのホットプレートにチューブを流します。</li>
	<li>膵島を染色するには、2 mLのKRBに100%エタノール中のFura-2 AMおよび100%エタノール中のRh123を添加して、それぞれ5 μMおよび2.5 μMの最終色素濃度に到達します。</li>
	<li>10 μLのピペットで膵島をピックアップし、37°Cで30分間色素にインキュベー</li>トします。
	<li>約20個の膵島をグルコースマイクロチャネルインレットを介してデバイスにロードします。出口から入口にバッファーを呼び戻すことにより、膵島をチャンバーに向けます。</li>
	<li>膵島をバッファーで10分間灌流し、余分な色素を洗い流します。</li>
</ol>
5. 酸素とグルコースの同時刺激の実行
<ol>
	<li>KRB2 によって確立された 5 分間のベースラインでグルコース刺激パルスを送達し、続いて 15 分間の 14 mM 刺激を行い、KRB2 で 15 分間洗浄します。</li>
	<li>Fura-2の励起波長を340/380 nm、Rh123の発光波長を534 nmに記録</li>。
	<li>各実験の前に、正常なパルス(14 mM normoxic)を測定します。</li>
	<li>酸素変調(低酸素/間欠性低酸素)の場合、対流障害を最小限に抑えるために、刺激および洗浄ステップ中にのみバッファーフローを適用し、他のステップではフローを適用しません。</li>
	<li>グルコース出口から排出物を1分間隔で収集し、ELISAインスリンアッセイを行います。</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この膵島低酸素症技術に統合された複数のモダリティは、トラブルシューティングのためにここで言及されているいくつかのポイントを示しています。まず、単離された膵島は、腺房細胞からの消化酵素により、培養中で分解および崩壊し続けます。したがって、膵島分離後1〜2日で実験を標準化することは、一貫した結果を得るために重要です。第二に、層流と拡散の境界での対流クリアランスを防ぐために、低酸素症および断続的な低酸素症中に水流を停止しました。これにより、膵島のプレコンディショニングの期間が制限されるようです。将来的に水性チャネルにガス交換を統合することで、膜での迅速なガス変調を可能にしながら、この小さなクリアランスを排除できます。第三に、膵島にロードしている間、気泡が閉じ込められないように、水性チューブを逆の順序で慎重に再接続する必要があります (出口、入口)。最後に、将来のデバイスは、ファンアウトされたマイクロ流体ディストリビューターで拡張され、膵島のクラスターをチャンバー全体に分散させることができ、その底部にはトラッパーポケットの配列でパターン化できます。ポケットアレイに加えて、このマイクロ流体分布は、ハイスループット実験のための膵島の位置配列を作成す...

動的低酸素症は生物学、特に膵島移植において重要です
動的低酸素症は、多くの生体組織において重要な生理学的および病態生理学的パラメータです。例えば、酸素の変化は、血管新生における強力な発生シグナルです。さらに、低酸素症の空間的および時間的パターンはHIF1-αを調節し、膵臓癌などの疾患で役割を果たします。低酸素症は、膵島移植の結果に影響を与える交絡因子でもあります。近年、低酸素症の時間的振動、または間欠性低酸素症(IH)が「プレコンディショニング」膵島1で効果を発揮しています。しかし、膵島の生理学に対する静的および一過性の低酸素の影響は、主に膵島の微小環境を制御するための適切なツールが不足しているため、まだ十分に理解または研究されていません。
膵島は生体内で血管新生が良好
膵島は、グルコース恒常性に関与するベータ細胞やアルファ細胞を含む内分泌細胞の50〜400μmの回転楕円体凝集体です。膵島が血液中の刺激性グルコースにさらされると、取り込みと解糖がATP産生につながり、ATP感受性カリウム(KATP)チャネルが開き、インスリン顆粒のエキソサイトーシスを引き起こすカルシウム流入がもたらされます。酸素はこの代謝性の高いプロセスを促進するために重要であり、インスリン分泌は、グルコース勾配に加えて、血流と酸素供給のダイナミクスに大きく影響されます。膵島は、毛細血管から1細胞長以内の膵臓で高度に灌流されているため、このグルコース-インスリン応答をin vivoで容易に実行できます。しかし、膵島内毛細血管の密集したネットワークは、膵島単離中にコラゲナーゼによって除去されます2,3。その結果、拡散の制限により、酸素と栄養素の両方の供給が100μmの周囲に制限されます。
現在の技術は、膵島の微小環境を再現する上での成果が限られています
生理学的および病態学的条件をモデル化するための鍵となる、膵島の本来の酸素とグルコースのダイナミクスを再現することは、精巧な流れを必要とし、膵島の機能の継続的な監視が不足している標準的な低酸素チャンバーでは達成困難です。さらに、I型糖尿病の移植療法は、孤立した膵島を低酸素症にさらしますpO 2 (<2%, 5-15 mmHg) 生理学的膵臓 (5.6%, 40 mmHg) よりもはるかに低い移植後、膵島移植片は血行再建術に2週間以上かかります。低酸素曝露は、膵島のグルコース-インスリン結合メカニズムを損なうことが実証されています。刺激-分泌カップリング因子の中で、カルシウムシグナル伝達、ミトコンドリア電位、およびインスリン動態は、マイクロ流体工学を使用して簡単に監視できます。私たちの以前のマイクロ流体技術は、単一の島5,6の周りの水性微小環境の正確な変調によるこのリアルタイムモニタリングを実証しました。しかし、膵島の低酸素障害の定量化は、同時刺激とモニタリング技術の欠如によって妨げられています。したがって、酸素のマイクロ流体制御と膵島のモニタリングを組み合わせることで、膵島の低酸素症の研究を改善することができます。
マイクロ流体工学は、水性および酸素の微小環境を再現および調節できます
組織および培養低酸素症研究の標準的な技術は、低酸素チャンバーに基づいています。一般に、低酸素チャンバーは、10~30分で平衡化時間で単一の酸素濃度を提供し、分単位の動的低酸素とは互換性がありません。最近の2つの研究では、マウス全体に対する断続的な低酸素曝露に小さなカスタムチャンバーが使用され、グルコース誘発性インスリン応答については矛盾する結果が得られました7,8。動物全体のレベルでは、呼吸器系の制御により、呼吸された酸素は膵島毛細血管pO2に直接変換されないことに注意してください。さらに、これらの研究には標準化された酸素レベルがなく、膵島の組織レベルでのリアルタイムの測定も提供されていません。
一方、酸素マイクロ流体工学は、ガスチャネルネットワークを介して酸素を制御することにより、これらの制限を超えることができます。さらに、マイクロ流体工学は、酸素変調中のライブイメージングに適合しており、これは現在、標準的な低酸素チャンバーでは不可能な偉業です。これらの新しいマイクロ流体アプローチの多くは、ポリジメチルシロキサンのガス透過性を利用して、酸素濃度をマイクロチャネルに溶解し、標的細胞9-14上に媒体を流します。また、これらのデバイスには、複数の個別の酸素濃度、蛍光ベースの酸素センサー、さらには化学的酸素生成がオンチップで統合されています。
液体溶媒和ベースのマイクロ流体工学は、流れ条件に敏感な対流混合に依存するため、安定した連続的な勾配を維持するのに苦労しています。それに比べて、ここで使用する手法は、酸素供給の拡散経路を減らすことに焦点を当てています。ガス溶媒和とせん断流は、細胞または膵島組織を播種した膜全体に酸素を直接拡散させることによって排除されます。これにより、溶媒和を制御するために必要な余分なマイクロ流体工学が除去され、それ自体がインスリン放出を引き起こす可能性のある膵島への不必要なせん断応力が防止されます。このプラットフォームは、細胞培養1,15において、高酸素と低酸素の両方の極端(2-97%O2)で活性酸素種(ROS)のアップレギュレーションを実証するために使用されています。酸素の直接供給とせん断流の除去により、当社の拡散ベースのプラットフォームは、膵島低酸素症の研究に最適なマイクロ流体ソリューションを提供します。
マルチモーダルな刺激とモニタリング
拡散ベースのマイクロ流体工学は、膵島の微小生理学の研究に適応すると、追加の利点ももたらします。膜を拡散バリアとして使用することにより、液体を酸素調節から分離することができ、低酸素刺激とは独立して水系グルコース刺激を制御することができます。これにより、サンドイッチのような同時刺激が生まれ、空間的にピンポイントで島への配送が可能となります。さらに、ガスはコンピュータ化されたマイクロインジェクターを介して一時的に調整されるため、酸素濃度を21〜0%からデジタルで変調し、過渡時間は60秒未満です。顕微鏡での酸素およびグルコース微小環境の動的制御により、標準的な低酸素チャンバーでは不可能または非常に面倒なリアルタイムのマルチモーダルプロトコルが可能になります。このデバイスを使用して、カルシウムシグナル伝達 (Fura-AM)、ミトコンドリア電位 (Rhodamine 123)、およびインスリン動態 (ELISA) をモニターし、低酸素下での動的グルコース - インスリン応答の全体像を提供しました。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬/材料</td></tr><tr><td>スピナー</td><td>ローレル</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>デジタルホットプレート</td><td>PMCデータプレート</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>UV硬化ランプ</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>ダウケミカル</td><td>シルガード184</td><td></td></tr><tr><td>コロナワンド</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr>真空<td>チャンバーBel-Art</td><td>420220000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロディスペンサー</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5 Vおよび20 V DC電源</td><td>ラジオシャック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ギルソン</td><td>ミニパルス 2</td><td></td></tr><tr><td>酸素センサー</td><td>オーシャンオプティクス</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>フラクションコレクター</td><td>ギルソン</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>フィンピペット II 100&mu;l</td><td></td></tr><tr><td>倒立落射蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 蛍光色素</td><td>分子プローブ、ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ ローダミン 123 蛍光色素</td><td>分子プローブ、ライフテクノロジー</td><td></td><td></td>ズ</tr><tr><td>カルチャーメディア</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 in シリコンチューブ</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 in x 1/8 in</td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-connectors</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16インチおよび4mm</td></tr><tr><td>シリンジコネクタ</td><td>コールパーマー</td><td></td><td>メスルアープラグ 1/16インチ</td></tr><tr><td>ストレートコネクタ</td><td>コールパーマー1</td><td></td><td>/16インチ</td></tr>エル<tr><td>ボーコネクタ</td><td>コールパーマー1</td><td></td><td>/16インチ</td></tr></tbody></table>

単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

単一の技術におけるグルコース刺激-分泌カップリング因子の同時酸素化とモニタリングは、特に移植環境における膵島低酸素症の病態生理学的状態をモデル化するために重要です。標準的な低酸素チャンバー技術では、両方の刺激を同時に調節することも、グルコース刺激と分泌の結合因子をリアルタイムでモニタリングすることもできません。これらの困難に対処するために、多層マイクロ流体技術を適用して、拡散膜を介して水相変調と気相変調の両方を統合しました。これにより、透明ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイス内のマイクロスケールの膵島の周囲に刺激サンドイッチが作成され、蛍光顕微鏡による前述の結合因子のモニタリングが可能になります。さらに、ガス入力は一対のマイクロディスペンサーによって制御され、0〜21%の酸素の定量的なサブミニッツ変調を提供します。この断続的な低酸素症は、膵島のプレコンディショニングの新たな現象を調査するために応用されています。さらに、マルチモーダル顕微鏡を武器に、これらの低酸素イベント中のカルシウムとKATPチャネルのダイナミクスを詳細に調べることができました。私たちは、マイクロ流体低酸素症、特にこの同時二相法を、膵島や多くのex vivo組織を研究するための貴重なツールとして想定しています。

この膵島低酸素技法の核心は、同一のマイクロ流体チャンバー内で、分単位の過渡応答を伴う液相および気相の刺激を調節できる能力にあります。図 1は、a) 二重刺激およびb) 膵島チャンバー内で測定された高速変調の代表的な結果です。チャンバーへのフルオレセインの導入によって示される液相の変調は、3〜4分間の混合で平衡に達します。さらに、酸素濃度を5-21%の間で高速な過渡応答とともに段階的に変化させることができ、最短2分の周期で酸素濃度のサイクリングが可能です。図 2に示すように、異なるサイクリング幅および周波数も実現できます。
このサイクリングを適用して膵島に間欠的低酸素状態を作り出すことで、通常の正常酸素パルスと比較して、低酸素に対する膵島のプレコンディショニングの有用性を観察することができます（図 3a）。インスリン分泌のシグナル伝達機構である細胞内カルシウムフラックスをリアルタイムでモニタリングしているため、低酸素およびIHの影響を、カルシウム・トランジェントのオーバーシュートと振...

マイクロ流体酸素制御は、生物学実験のための低酸素チャンバーよりも利便性とスピード以上のものを提供します。特に、膜を介した拡散を介して実装された場合、マイクロ流体酸素は、マイクロスケールレベルで液体と気体の相を同時に調整することができます。この技術により、膵島の病態生理学の研究に不可欠なダイナミックなマルチパラメトリック実験が可能になります。

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

この手順の全体的な目的は、分単位でスケールされた間欠的低酸素状態をマイクロスケールの膵島に適用し、プレコンディショニング効果を調査することである。これは、まず薄いガス透過性膜を備えたマルチモーダル・マイクロフルイディクスデバイスを作製し、次にコンピューター制御の酸素調節システムを構築することによって達成される。次に、アイレットを慎重に装置に装填し、液体および酸素のマイクロフルイディクスを接続します。最終ステップとして、酸素調節中に変化するアイレットのパラメータを可視化するために、顕微鏡観察とマルチモーダル・マイクロフルイディクスを同期させます。最終的に、アイレット間欠性低酸素法を用いて、低酸素状態においてグルコース応答が明らかに損なわれていることを示します。低酸素状態を時間的に調節することで、眼球組織の機能低下を抑えつつ応答させる訓練が可能です。溶解酸素や低酸素チャンバーを用いた既存の手法に対するこの技術の主な利点は、複雑な流れによる剪断応力を伴わずに、極めて短く微小な時間間隔で正確な酸素濃度を眼瞼に供給できる点にあります。また、フローサイトメトリーおよび顕微鏡によるリアルタイムモニタリングも可能です。この手法は、移植部位における低酸素状態による障害の定義や、移植成績を向上させるためのプレコンディショニング regimens など、同種移植分野における重要な疑問への回答に寄与します。したがって、本手法は同種移植における低酸素状態についての知見を提供することができます。本手法は、中枢神経系、心臓組織、腎臓、その他の移植臓器などの他の組織や系にも適用可能です。デバイスの作製やアイレットの取り扱いなど、多くの工程があるため、本手法のビデオによる実演は非常に重要です。この技術は学際的な性質を持つ斬新なものであるため、各手順を習得するのは困難ですが、挑戦的な部分や習熟が必要な部分が含まれています。まず、マイクロ流体デバイスのカバー層の作製から開始してください。これを達成するために、あらかじめ混合したPDMSを空白のペトリ皿に1.5 millimetersの高さまで注ぎ、80 degrees Celsiusで2時間硬化させます。次に、4インチのシリコンウェハー上に350 micron厚のSU 8 21 50を2層スピンコートして、単一の700 micron層を形成し、プロフュージョンチャンバーマスターを用いてグルコースマイクロ流路層を作製します。その後、グルコースマイクロ流路層用フォトマスクを用いてUV光を照射し、マイクロチャネルパターンをSU 8層に転写します。SU-8現像液で未露光領域を洗い流します。次に、あらかじめ混合したDGAのPDMSをMA上に3 mmの高さまで注ぎ、80 °Cで2時間硬化させます。硬化後、グルコースマイクロ流体層を形状に合わせて切り出し、2 mmのパンチで入口および出口ポートを、8 mm径のパンチでメインチャンバーを形成します。次に、清潔な4インチシリコンウェハ上に100 µm厚のSU 8 2100をスピンコートし、UVリソグラフィを用いてマイクロウェルパターンをこの層に転写することで、まぶた固定用のマイクロウェルマスターを作製します。マイクロウェルマスターが完成したら、現像液で未露光領域を洗い流します。PDMSを900 RPMで30秒間スピンコートし、その後80 °Cで10分間キュアリングして1層を作成する工程を2回繰り返し、100 µmの層を2層追加します。完了後、直径2 mmの入口ポートおよび出口ポートを開けます。最後に、前の層と同様にSU 8 2100をスピンコートして厚さ100 µmにし、UVリソグラフィーを用いてガスマイクロ流路パターンを再度転写することで、ガスマイクロ流路マスターを作製します。現像液で未露光領域を洗い流します。次に、PDMSを1.5 millimeterの厚さでガスマイクロ流路マスターの上に流し込み、80 °Cで2時間硬化させます。その後、カミソリ刃を用いてPDMSを形状に合わせて切り出します。さらに、複数の層を接合させるため、他の層のポート位置に合わせて、カバー層に直径2 millimeterの入口ポートと出口ポートをパンチで開けます。まず、表面をスコッチテープで清浄し、コロナ放電処理を行った後、以下の順序で手作業で各層をアライメントして準備します。まず、マイクロウェル面を上に向けた状態で、メンブレンを底面のガス層に接合します。次に、マイクロウェルメンブレンの上にグルコースマイクロ流体層を接合します。最後に、最上層にインレットおよびアウトレット層を接合し、アセンブリ全体を封止します。アセンブリの上に1 kgの重りを載せ、100 °Cで3時間焼成することで、強固な接合を促します。その後、リークテストを行います。水相層に水を充填し、デバイスを浸漬させ、シリンジで気相層に空気を流して、リークがないか確認することでデバイスをテストします。最後に、リークのないデバイスに70% ethanolを水相層に通して1〜2分間流し、滅菌します。まず、マイクロディスペンサーの制御リードを付属のドライバーユニットに接続して、マイクロディスペンサーをセットアップします。次に、ドライバーをLabVIEWコントロールに対応するデジタルIOボードのポートに接続します。続いて、5Vおよび20VのDC電源をドライブユニットの対応する接点に接続し、デジタルIOをラップトップに接続して、付属のテキストプロトコルの付録に記載されているガス制御用のLabVIEWコードを実行します。その後、一方のマイクロディスペンサーを窒素に、もう一方を圧縮空気に接続します（いずれも5%の二酸化炭素を含むものとし、両方のガスを2 PSIに設定します）。マイクロ流体デバイスに入る前に、ディスペンサーの出力をT字型ジャンクションで結合させます。次に、デバイスを倒立顕微鏡の加熱ステージ上に設置し、0%および21%の酸素をデバイスに接続します。続いて、デバイスの流出側に光ファイバー式酸素センサーを配置し、流出液中の溶存酸素量をリアルタイムで測定します。その後、デバイスをペリスタポンプに接続し、250 µL/minの速度でデバイス内に水を流し始めます。マイクロディスペンサーを5%と21%の酸素の間でサイクルさせ、酸素変調の過渡応答を特性評価します。ペリスタティックポンプをマイクロ流体デバイスに接続し、流体がマイクロ流体デバイスに入る前に加温されるよう、チューブを37 °Cのホットプレート上に配置します。また、グルコースマイクロ流体の出力ポートを分画回収機に接続します。C57BL/6マウスを解剖し、JoVEで公開されている以下のビデオに記載されているコラゲナーゼ消化およびFicoll密度勾配分離によって、膵島を単離します。10% FBS、1% ペニシリン・ストレプトマイシン、および 20 millimolar HEPES を含む RPMI 1640 培地を用いて、アイレットをペトリ皿で 24 から 48 時間インキュベートします。結果の一貫性を確保するため、アイレットは 2 日以内に使用してください。次に、付属のテキストプロトコルに従って、2 millimolar グルコースを含む溶液と 14 millimolar グルコースを含む溶液の 2 種類の新鮮な Krebs-Ringer 重炭酸バッファーを調製します。50 mLコニカルチューブに入れた溶液を37 °Cのウォーターバスに入れて温めます。次に、2 mMグルコースを含むKrebs緩衝液2 mLに、5 µMの4:02 AMおよびDMSOと、2.5 µMのRH 1 23および100%エタノールを加え、単離したアイレット（島）用の染色液を調製します。続いて、10 µLピペットでアイレットを回収し、染色液中で37 °C、30分間インキュベートします。染色後、グルコースマイクロチャネル入口から約20個のアイレットをデバイスにロードします。出口から入口に向かってバッファーをプライミングし、アイレットをチャンバー内に誘導します。その後、アイレットとバッファーを10分間灌流し、過剰な染料を洗浄します。まず、システムに2 mMのKrebs-Ringer重炭酸緩衝液を5分間流し、正常な拍動のベースラインを確立します。次に、14 mMのグルコース緩衝液で15分間チャンバーを刺激し、続いて2 mMのグルコース緩衝液で15分間洗浄します。この過程で、340 nmおよび380 nmで励起し、2つの放出光について510 nmで記録します。また、色素を480 nanometersで励起し、RH 1 23の530 emissionを記録します。酸素変調中の対流による乱れを最小限に抑えるため、刺激および洗浄ステップの間はバッファーを流し、試験中のその他のステップでは必ずフローを停止させてください。追加解析に使用するため、グルコース出口から1分間隔で流出液を回収します。本ビデオで示すマイクロ流体アプローチを用いれば、コンピューター制御のマイクロインジェクターを使用して、薄いPDMS膜を通過する酸素の割合を迅速に調節することが可能です。ここでは、1分から6分の範囲でこの変調を行った例を示します。また、5%から21%の酸素を供給することで、2ppmから8.5ppmの間で1分未満の定量的な酸素変調を行うことも可能です。青い線は供給された酸素の割合を示し、緑色の線は結果として得られたppm単位の溶存酸素量を示しています。このサイクリングをアイレットに適用して間欠的低酸素状態を作り出すと、不規則な常酸素パルスと比較して、低酸素に対するアイレットのプレコンディショニングの利点を、処理後の改善された比率を観察することによって確認できます。低酸素および間欠的低酸素の効果は、ここに青色で示されている常酸素応答と比較して、カルシウム・トランジェントのオーバーシュートおよび振動減衰において観察されます。赤色は低酸素応答を、緑色の線は条件付けられた低酸素応答を示しています。ここでは、カルシウム、ミトコンドリア電位、およびインスリンの測定値が表示されています。これらは、リアルタイム蛍光顕微鏡法と、システムからのマイクロ流体流出液を用いたチップ外EISAアッセイの結果です。これらを組み合わせることで、低酸素一過性状態におけるグルコース・インスリン応答のマルチモーダルな視点の構築が始まります。この手法を習得すれば、適切に実施することで2日間で完了させることができます。1日目はデバイスの作製と眼瞼細胞の単離に充て、2日目に眼瞼の実験自体を行います。この手順を行う際は、デバイスの開発後、ガス供給装置を用いて供給される酸素濃度を確認することが重要です。この手法は、胎児の出口やその他の組織微小生理学の研究者が、低酸素状態や一時的な酸素パターンが糖尿病、心血管疾患、神経疾患などの疾患にどのように影響するかを探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、マルチモーダル・マイクロ流体デバイスを用いて、酸素濃度の調整、微小組織の操作、および組織低酸素状態の再現性があり意味のある測定を行う方法について、十分に理解することができます。

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

単一のアイレットレベルでの酸素の微環境の定量的および時間的制御

マイクロ流体膵島perifusionデバイスは、複数の島とカルシウム流入とミトコンドリアの潜在的な変化の同時蛍光イメージングの動的なインスリン分泌の評価のために開発されました。...

マイクロ流体Perifusionデバイス内のマルチパラメトリック膵島Perifusionシステム

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。...

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13...

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

ここでは、膵島細胞などの異種細胞集団におけるカルシウム動態をイメージングおよび定量するためのプロトコルを提示する。蛍光レポーターは、イヌビレット内の細胞の末梢層に送達され、次いで固定化および画像化され、蛍光強度のダイナミクスの細胞単位分析が行われます。...

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

ここでは、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を用いて、単体ヒト膵島から単一細胞の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するプロトコルを提示する。...

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

このプロトコルは、非ヒト霊長類膵島における酸素消費量の正確かつ再現性の測定を示す。マイクロプレートの小口ローディング技術およびコーティングは、他のタイプの培養スフェロイドにおける呼吸の効率的な測定のためのフレームワークを提供する。...

非ヒト霊長類膵島酸素消費量の分析

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。...

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

このプロトコルは循環アデノシンの一リン酸塩(cAMP)の生物センサー、 その場 (cADDis)のcAMPの相違の探知器のアデノウイルス配達を使用して細胞内シグナリングでき事およびインシュリンおよびグルカゴンの分泌およびmicroperifusionシステムの同時獲得そしてco登録のための方法を記述する。...

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

ここでは、交絡因子の可能性を減らしながら内分泌膵臓機能を評価するための追加技術として、無傷の膵臓を持つマウス血管系を通る灌流を介してグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)...

無傷の膵臓を持つマウス血管系を介した灌流によるグルコース刺激インスリン分泌

このプロトコルは、二重層マイクロ流体チップを作製し、急速な酸素振動下での微生物増殖を分析する方法を提示します。このデバイスの性能は、流体チャネルでの酸素センシングと微生物培養を通じて検証されました。...

マイクロ流体二重層デバイスを用いた微生物1細胞増殖解析における急速酸素振動の創出

このプロトコルは、ルイスラット膵島の外科的収穫、酵素的消化、密度勾配精製のための標準化された方法を説明し、移植や in vitro...

酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

学ぶマイクロ流体デバイスを用いた単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御法。リアルタイムモニタリングで低酸素状態のグルコース応答とプレコンディショニング効果を可視化し、膵島移植の現場での低酸素障害の定義に貢献する。

単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御

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