単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御

この手順の全体的な目的は、分単位でスケールされた間欠的低酸素状態をマイクロスケールの膵島に適用し、プレコンディショニング効果を調査することである。これは、まず薄いガス透過性膜を備えたマルチモーダル・マイクロフルイディクスデバイスを作製し、次にコンピューター制御の酸素調節システムを構築することによって達成される。

次に、アイレットを慎重に装置に装填し、液体および酸素のマイクロフルイディクスを接続します。最終ステップとして、酸素調節中に変化するアイレットのパラメータを可視化するために、顕微鏡観察とマルチモーダル・マイクロフルイディクスを同期させます。最終的に、アイレット間欠性低酸素法を用いて、低酸素状態においてグルコース応答が明らかに損なわれていることを示します。

低酸素状態を時間的に調節することで、眼球組織の機能低下を抑えつつ応答させる訓練が可能です。溶解酸素や低酸素チャンバーを用いた既存の手法に対するこの技術の主な利点は、複雑な流れによる剪断応力を伴わずに、極めて短く微小な時間間隔で正確な酸素濃度を眼瞼に供給できる点にあります。

また、フローサイトメトリーおよび顕微鏡によるリアルタイムモニタリングも可能です。この手法は、移植部位における低酸素状態による障害の定義や、移植成績を向上させるためのプレコンディショニング regimens など、同種移植分野における重要な疑問への回答に寄与します。したがって、本手法は同種移植における低酸素状態についての知見を提供することができます。

本手法は、中枢神経系、心臓組織、腎臓、その他の移植臓器などの他の組織や系にも適用可能です。デバイスの作製やアイレットの取り扱いなど、多くの工程があるため、本手法のビデオによる実演は非常に重要です。この技術は学際的な性質を持つ斬新なものであるため、各手順を習得するのは困難ですが、挑戦的な部分や習熟が必要な部分が含まれています。まず、マイクロ流体デバイスのカバー層の作製から開始してください。

これを達成するために、あらかじめ混合したPDMSを空白のペトリ皿に1.5 millimetersの高さまで注ぎ、80 degrees Celsiusで2時間硬化させます。次に、4インチのシリコンウェハー上に350 micron厚のSU 8 21 50を2層スピンコートして、単一の700 micron層を形成し、プロフュージョンチャンバーマスターを用いてグルコースマイクロ流路層を作製します。その後、グルコースマイクロ流路層用フォトマスクを用いてUV光を照射し、マイクロチャネルパターンをSU 8層に転写します。

SU-8現像液で未露光領域を洗い流します。次に、あらかじめ混合したDGAのPDMSをMA上に3 mmの高さまで注ぎ、80 °Cで2時間硬化させます。硬化後、グルコースマイクロ流体層を形状に合わせて切り出し、2 mmのパンチで入口および出口ポートを、8 mm径のパンチでメインチャンバーを形成します。

次に、清潔な4インチシリコンウェハ上に100 µm厚のSU 8 2100をスピンコートし、UVリソグラフィを用いてマイクロウェルパターンをこの層に転写することで、まぶた固定用のマイクロウェルマスターを作製します。マイクロウェルマスターが完成したら、現像液で未露光領域を洗い流します。PDMSを900 RPMで30秒間スピンコートし、その後80 °Cで10分間キュアリングして1層を作成する工程を2回繰り返し、100 µmの層を2層追加します。

完了後、直径2 mmの入口ポートおよび出口ポートを開けます。最後に、前の層と同様にSU 8 2100をスピンコートして厚さ100 µmにし、UVリソグラフィーを用いてガスマイクロ流路パターンを再度転写することで、ガスマイクロ流路マスターを作製します。現像液で未露光領域を洗い流します。

次に、PDMSを1.5 millimeterの厚さでガスマイクロ流路マスターの上に流し込み、80 °Cで2時間硬化させます。その後、カミソリ刃を用いてPDMSを形状に合わせて切り出します。さらに、複数の層を接合させるため、他の層のポート位置に合わせて、カバー層に直径2 millimeterの入口ポートと出口ポートをパンチで開けます。

まず、表面をスコッチテープで清浄し、コロナ放電処理を行った後、以下の順序で手作業で各層をアライメントして準備します。まず、マイクロウェル面を上に向けた状態で、メンブレンを底面のガス層に接合します。次に、マイクロウェルメンブレンの上にグルコースマイクロ流体層を接合します。

最後に、最上層にインレットおよびアウトレット層を接合し、アセンブリ全体を封止します。アセンブリの上に1 kgの重りを載せ、100 °Cで3時間焼成することで、強固な接合を促します。その後、リークテストを行います。

水相層に水を充填し、デバイスを浸漬させ、シリンジで気相層に空気を流して、リークがないか確認することでデバイスをテストします。最後に、リークのないデバイスに70% ethanolを水相層に通して1〜2分間流し、滅菌します。まず、マイクロディスペンサーの制御リードを付属のドライバーユニットに接続して、マイクロディスペンサーをセットアップします。

次に、ドライバーをLabVIEWコントロールに対応するデジタルIOボードのポートに接続します。続いて、5Vおよび20VのDC電源をドライブユニットの対応する接点に接続し、デジタルIOをラップトップに接続して、付属のテキストプロトコルの付録に記載されているガス制御用のLabVIEWコードを実行します。その後、一方のマイクロディスペンサーを窒素に、もう一方を圧縮空気に接続します（いずれも5%の二酸化炭素を含むものとし、両方のガスを2 PSIに設定します）。マイクロ流体デバイスに入る前に、ディスペンサーの出力をT字型ジャンクションで結合させます。

次に、デバイスを倒立顕微鏡の加熱ステージ上に設置し、0%および21%の酸素をデバイスに接続します。続いて、デバイスの流出側に光ファイバー式酸素センサーを配置し、流出液中の溶存酸素量をリアルタイムで測定します。その後、デバイスをペリスタポンプに接続し、250 µL/minの速度でデバイス内に水を流し始めます。

マイクロディスペンサーを5%と21%の酸素の間でサイクルさせ、酸素変調の過渡応答を特性評価します。ペリスタティックポンプをマイクロ流体デバイスに接続し、流体がマイクロ流体デバイスに入る前に加温されるよう、チューブを37 °Cのホットプレート上に配置します。また、グルコースマイクロ流体の出力ポートを分画回収機に接続します。C57BL/6マウスを解剖し、JoVEで公開されている以下のビデオに記載されているコラゲナーゼ消化およびFicoll密度勾配分離によって、膵島を単離します。

10% FBS、1% ペニシリン・ストレプトマイシン、および 20 millimolar HEPES を含む RPMI 1640 培地を用いて、アイレットをペトリ皿で 24 から 48 時間インキュベートします。結果の一貫性を確保するため、アイレットは 2 日以内に使用してください。次に、付属のテキストプロトコルに従って、2 millimolar グルコースを含む溶液と 14 millimolar グルコースを含む溶液の 2 種類の新鮮な Krebs-Ringer 重炭酸バッファーを調製します。

50 mLコニカルチューブに入れた溶液を37 °Cのウォーターバスに入れて温めます。次に、2 mMグルコースを含むKrebs緩衝液2 mLに、5 µMの4:02 AMおよびDMSOと、2.5 µMのRH 1 23および100%エタノールを加え、単離したアイレット（島）用の染色液を調製します。続いて、10 µLピペットでアイレットを回収し、染色液中で37 °C、30分間インキュベートします。

染色後、グルコースマイクロチャネル入口から約20個のアイレットをデバイスにロードします。出口から入口に向かってバッファーをプライミングし、アイレットをチャンバー内に誘導します。その後、アイレットとバッファーを10分間灌流し、過剰な染料を洗浄します。

まず、システムに2 mMのKrebs-Ringer重炭酸緩衝液を5分間流し、正常な拍動のベースラインを確立します。次に、14 mMのグルコース緩衝液で15分間チャンバーを刺激し、続いて2 mMのグルコース緩衝液で15分間洗浄します。この過程で、340 nmおよび380 nmで励起し、2つの放出光について510 nmで記録します。

また、色素を480 nanometersで励起し、RH 1 23の530 emissionを記録します。酸素変調中の対流による乱れを最小限に抑えるため、刺激および洗浄ステップの間はバッファーを流し、試験中のその他のステップでは必ずフローを停止させてください。追加解析に使用するため、グルコース出口から1分間隔で流出液を回収します。本ビデオで示すマイクロ流体アプローチを用いれば、コンピューター制御のマイクロインジェクターを使用して、薄いPDMS膜を通過する酸素の割合を迅速に調節することが可能です。

ここでは、1分から6分の範囲でこの変調を行った例を示します。また、5%から21%の酸素を供給することで、2ppmから8.5ppmの間で1分未満の定量的な酸素変調を行うことも可能です。青い線は供給された酸素の割合を示し、緑色の線は結果として得られたppm単位の溶存酸素量を示しています。このサイクリングをアイレットに適用して間欠的低酸素状態を作り出すと、不規則な常酸素パルスと比較して、低酸素に対するアイレットのプレコンディショニングの利点を、処理後の改善された比率を観察することによって確認できます。低酸素および間欠的低酸素の効果は、ここに青色で示されている常酸素応答と比較して、カルシウム・トランジェントのオーバーシュートおよび振動減衰において観察されます。

赤色は低酸素応答を、緑色の線は条件付けられた低酸素応答を示しています。ここでは、カルシウム、ミトコンドリア電位、およびインスリンの測定値が表示されています。これらは、リアルタイム蛍光顕微鏡法と、システムからのマイクロ流体流出液を用いたチップ外EISAアッセイの結果です。これらを組み合わせることで、低酸素一過性状態におけるグルコース・インスリン応答のマルチモーダルな視点の構築が始まります。

この手法を習得すれば、適切に実施することで2日間で完了させることができます。1日目はデバイスの作製と眼瞼細胞の単離に充て、2日目に眼瞼の実験自体を行います。この手順を行う際は、デバイスの開発後、ガス供給装置を用いて供給される酸素濃度を確認することが重要です。この手法は、胎児の出口やその他の組織微小生理学の研究者が、低酸素状態や一時的な酸素パターンが糖尿病、心血管疾患、神経疾患などの疾患にどのように影響するかを探索するための道を切り開きました。

このビデオを視聴することで、マルチモーダル・マイクロ流体デバイスを用いて、酸素濃度の調整、微小組織の操作、および組織低酸素状態の再現性があり意味のある測定を行う方法について、十分に理解することができます。