単一島レベルでの酸素微小環境の定量的・時間的制御

この手順の全体的な目標は、分単位でスケーリングされた間欠性低酸素症をマイクロスケールの膵臓アイレットに適用して、プレコンディショニング効果を調査することです。これは、まず、薄いガス透過性メンブレンを備えたマルチモーダルマイクロ流体デバイスを作製することによって達成されます。2番目のステップは、コンピューター化された酸素変調システムを作成することです。

次に、アイレットを慎重にデバイスにロードし、次に液体と酸素のマイクロ流体を接続します。最後のステップは、酸素変調中に変化するアイレットパラメータを視覚化するために、顕微鏡法をマルチモーダルマイクロ流体工学と調整することです。最終的に、アイレットの断続的低酸素法を使用して、低酸素症ではグルコース反応が明らかに損なわれていることを示します。

一方、低酸素症の時間的変調は、アイレットを訓練して、より少ない障害で応答することができます。溶存酸素や低酸素チャンバーの使用などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、その精度です。酸素濃度は、複雑な流れによる大きなストレスなしに、迅速で極小の時間間隔でまぶたに供給することができました。

また、床や顕微鏡によるリアルタイムのモニタリングも可能です。このマスターは、移植部位の低酸素障害の定義や移植結果を改善するためのプレコンディショニングレジメンなど、Alli移植分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この方法はAlli低酸素症への洞察を提供することができます。

また、中枢神経系、心臓組織、腎臓、その他の移植臓器などの他の組織やシステムにも適用できます。この方法のビデオデモンストレーションは、デバイス製造とアイレットの多くが処理するため、非常に重要です。このステップは、技術の斬新な学際的な性質のために学ぶのが困難ですが、固有の挑戦的または慣れ親しんだマイクロ流体デバイスのカバー層を製造することから始めます。

これを行うには、DGAを1.5ミリメートルの高さまでプレミックスしたPDMSを空白のシャーレに注ぎ、摂氏80度で2時間硬化させます。次に、SU8 21 50の厚さの350ミクロンの層2層をスピンコーティングして、4インチのシリコーンウェーハ上に単一の700ミクロンの層を形成することにより、プロフュージョンチャンバーマスターでグルコースマイクロ流体層を作製します。次に、グルコースマイクロ流体層フォトマスクを使用してUV光にさらし、マイクロチャネルパターンをSU8層に転写します。

露出していない領域をSU8現像液で洗い流します。次に、予め混合したPDMSをDGAをMAに3mmの高さまで注ぎ、80°Cで2時間硬化させます。硬化したら、グルコースマイクロ流体層を切断して成形し、2mmのパンチを使用して入口と出口のポートを形成し、メインチャンバーに直径8mmのパンチを使用します。

次に、きれいな4インチのシリコンウェーハ上にSU8 2100の100ミクロンの厚さの層をスピンコーティングすることにより、まぶたを固定するためのマイクロウェルマスターを作製し、UVリソグラフィーを使用してマイクロウェルパターンをこの層に転写します。マイクロウェルマスターが完成したら、現像液で露出していない領域を洗い流します。PDMSを100ミクロンのPDMSを900回転で30秒間スピンコーティングし、80°Cで10分間硬化させて各層を作製します。

終了したら、直径2ミリメートルの入口を出口ポートに打ち抜きます。最後に、前の層と同様にSU8 2100〜100ミクロンの厚さに回転させてガスマイクロ流体マスターを作製し、UVリソグラフィーを使用してガスマイクロ流体パターンを再度転写します。現像液で露出していない領域を洗い流します。

次に、厚さ1.5mmのPDMS層をガスマイクロ流体マスターに流し込み、摂氏80度で2時間硬化させます。次に、PDMSをかみそりの刃で形を整えます。次に、直径 2 mm の入口ポートと出口ポートをカバー層に打ち抜き、他の層の位置に合わせて複数の層を接着します。

まず、スコッチテープで表面をクリーニングし、コロナアークにさらしてから、次の順序で手でレイヤーを揃えて準備します。まず、マイクロウェルを上にして、メンブレンを下部のガス層に接着します。次に、グルコースマイクロ流体層をマイクロウェルメンブレンの上に接着します。

最後に、入口層と出口層を最上部に接着し、アセンブリ全体をカプセル化します。アセンブリの上に1キログラムの重りを追加し、摂氏100度で3時間焼くことにより、緊密な結合を形成するのを支援します。その後、漏れます。

水層に水を入れ、デバイスを水没させ、シリンジでガス層に空気を流しながら漏れがないか確認して、デバイスをテストします。最後に、70%エタノールを水性層に1〜2分間通すことにより、漏れのないデバイスを滅菌します。最初にマイクロディスペンサーのコントロールリード線を付属のドライバーユニットに接続して、マイクロディスペンサーをセットアップします。

次に、ドライバーをデジタルIOボードのラボビューコントロールに対応するポートで接続します。次に、5ボルトと20ボルトのDC電源をドライブユニットの対応する接点に接続し、デジタルIOをラップトップに接続して、付属のテキストプロトコルの付録で説明されているように、ガス制御のラボビューコードを実行します。次に、1つのマイクロディスペンサーを窒素に接続し、もう1つのマイクロディスペンサーを5%の二酸化炭素を含む圧縮空気に接続し、両方のガスを2PSに設定します。マイクロ流体デバイスに入る前に、ディスペンサー出力をT字型ジャンクションにつない

次に、デバイスを0%と21%の酸素がデバイスに接続された倒立顕微鏡の加熱ステージに取り付けます。次に、デバイスの流体出力に光ファイバー酸素センサーを配置して、出力内の溶存酸素をリアルタイムで測定します。次に、デバイスを蠕動ポンプに接続し、毎分250マイクロリットルでデバイスを通って水を流し始めます。

マイクロディスペンサーを5〜21%の酸素間で循環させることにより、酸素変調の過渡応答を特徴付けます。ペリスタルティックポンプをマイクロ流体デバイスに接続し、チューブを摂氏37度のホットプレート上に配置して、流体がマイクロ流体デバイスに入る前に流体を温めます。また、グルコースマイクロフルイディクスの出力ポートをフラクションコレクターに接続して、C 57 black six マウスの解剖を開始し、コラゲナーゼ消化とF ccal 密度勾配分離によって膵臓アイレットを分離します。

アイレットを、10%FBS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および20ミリモルヒープをペトリ皿に含むRPMI 1640培地で24〜48時間インキュベートします。2日以内にアイレットを使用して、一貫した結果を確保してください。次に、添付のテキストプロトコールに記載されているように、2ミリモルグルコースを含む1つの溶液と14ミリモルグルコースを含む別の溶液を使用して、新鮮なクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液を調製します。

50ミリリットルの円錐管内の溶液を摂氏37度の水浴に入れて温めます。次に、4:02 AMおよびDMSOの5マイクロモルおよびRH1 23および100%エタノールの2.5マイクロモルを、2ミリモルのグルコースを含む2ミリリットルのクレブス緩衝液に加えることにより、単離されたアイレットの染色を調製する。次に、10マイクロリットルのピペットでアイレットを手に取り、37°Cで30分間染色中でインキュベートします。

染色後、約20個のアイレットをグルコースマイクロチャネルインレットを介してデバイスにロードします。出口からインレットにバッファーを呼び戻すことにより、アイレットをチャンバーに向けます。次に、アイレットを灌流し、10分間緩衝して余分な色素を洗い流します。

まず、2ミリモルのクレブスリンガー重炭酸バッファーをシステム内に5分間引き込み、正常なパルスベースラインを確立します。次に、14ミリモルグルコース緩衝液でチャンバーを15分間刺激し、続いて2ミリモルグルコース緩衝液で15分間洗浄します。このプロセスでは、ダイエット340ナノメートルと380ナノメートルを励起することにより、510ナノメートルを2つの発光を記録します。

また、480ナノメートルで色素を励起することによりRH1 23の530発光を記録する。酸素変調中の対流障害を最小限に抑えるために、刺激および洗浄ステップ中にバッファーフローを適用し、テスト中に他のステップでフローを停止してください。このビデオで示されているマイクロ流体アプローチを使用して追加の分析で使用するために、グルコース出口から排出物を1分間隔で収集し、コンピューター化されたマイクロインジェクターを使用して、薄いPDMSメンブレンを通過する酸素の割合を迅速に調整することができます。

この変調の例は、1 分から 6 分の範囲です。また、5〜21%の酸素を供給することにより、2〜8.5ppmの酸素の定量的なサブミニッツ変調を提供することも可能です青い線は送達された酸素の割合を示し、緑は得られた溶存酸素を100万分の1で示しています。このサイクルを適用してアイレットに断続的な低酸素状態を作り出すと、不規則な正常酸素パルスと比較して、低酸素に対するプレコンディショニングアイレットの利点を観察できます。これは、青で示されているように、カルシウム過渡現象のオーバーシュートと振動減衰で低酸素と断続的な低酸素症の治療後の改善された比率を観察することにより、正常酸素応答です。

赤は低酸素反応、緑の線は条件付けされた低酸素反応です。カルシウム、ミトコンドリア電位、インスリンの測定値がここに示されている。これらは、システムからのマイクロ流体排出を一緒に使用したリアルタイムの蛍光顕微鏡とオフチップEISAアッセイの結果であり、これらは低酸素過渡下でのグルコースインスリン応答のマルチモーダルビューを構築し始めます。

一度習得すると、この技術は適切に実行すれば2日で完了し、1日はデバイスの製造とまぶたの細胞の分離に、1日はまぶたの実験自体に1日かかります。この手順を試みるときは、デバイスのガス発生器を組み合わせて、供給された酸素濃度を確認することを忘れないでください。この技術は、胎児出口やその他の組織微生物学の研究者が、低酸素症や一時的な酸素パターンが糖尿病、心血管、神経障害などの疾患にどのように影響するかを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、酸素調節の制御方法、微小組織の操作方法、マルチモーダルマイクロ流体デバイスを使用した組織の低酸素状態の再現性のある意味のある測定の生成方法について十分に理解できるはずです。