のための最適化されたプロトコル

本研究の目的は、高い生存能を持つマイコバクテリウム脂質懸濁液の調製方法を示すことです。これはヌードマウスへの接種に使用します。感染したマウスから、好ましくは感染の初期段階で、細菌の生存能を維持したまま回収します。

高い生存率のary収量を保証するため、生物安全キャビネット内で動物を安楽死させます。止血鉗子で後方の脈動部位を固定します。痙攣とともに切除し、2%Iodineに20分間浸漬させます。除染のため、足底を上にした状態で位置を固定します。

軟組織を採取します。メスを用いて第1および第5指節骨を除去し、組織の均質化を容易にします。組織を滅菌済みのペトリ皿に置きます。表皮を掻き取ります。

肉芽組織をハサミで細かく切り刻み、後ほど組織の収量を算出するため、その重量を記録しておきます。切り刻んだ組織を1 mLのHank's平衡塩溶液を含むチューブに移します。さらに1 mLのHank's溶液を加え、速度4で1回15秒間、計3回組織をホモジナイズします。

50 mlの滅菌コニカルチューブにセルストレーナーをセットします。懸濁液をストレーナーにピペットで滴下し、重力で溶液を通過させます。デブリを除去するため、懸濁液にさらに2 mlのHanks液を加え、再度均質化します。

同じサイクルを用いて、懸濁液をこのストレーナーに通します。Hanks溶液を加えてストレーナーを洗浄します。懸濁液の総量を9 mLにするため、0.5%トリプシン溶液を1 mL加え、最終濃度を約0.05%に調整します。

チューブを静かに転倒混和し、37 °Cで60分間インキュベートします。インキュベート後、滅菌生理食塩水を加えて懸濁液の容量を4 mLにします。4 °Cで1700 G、30分間遠心分離し、上清を捨てて、チューブをタッピングしてペレットを再懸濁します。1 mLの滅菌生理食塩水を加え、混合します。

懸濁液を新しいチューブに移します。26ゲージの針を装着した1 mLインスリン用注射器を用い、懸濁液を新しいチューブに移しながら血管懸濁液を均質化します。18 mediumおよび7 H9 brain heart infusionに懸濁液を2滴ずつ滴下し、懸濁液の微生物学的管理を行います。

11 Stein Genesenを37 °Cで培養します。その後、通常の微生物学的管理手順に従います。コードZ染色用です。

生理食塩水を用いて、S懸濁液の10倍および100倍希釈液を調製します。計数用のスライドを準備する前に、各希釈液を均質化します。恒久的なインクマーカーを用いて、各スライドの表面に内径10 millimeterの円を3つ描き、計3枚のスライドを準備します。

次に、免疫組織化学用ペンで円を囲みます。2B鉛筆を使用して、3つの異なる濃度（未希釈、1:10、1:100）用のスライドにラベルを貼ります。

フェノール血清溶液5 µLとsary懸濁液10 µLを各円内にピペットで分注し、均質化した後、懸濁液を円の領域全体に均等に広げます。使い捨てループのハンドルを使用して、これらを水平なテーブルの上に置き、乾燥させます。乾燥後、bachelor懸濁液を上にした状態で、青色炎の上を3回通過させて固定します。

コードZuniサステイニングを実施します。これらのスライドを確認してください。3つの希釈系列です。

計数に最も適した希釈倍率を選択します。血管懸濁液を121 °Cで30分間オートクレーブし、200 µLの死滅させたsary懸濁液を調製します。微生物脂質の蛍光染色は、L 7 0 0 7 live dead back light bacterial viability kitを用いて行います。

溶液Aを10倍に希釈した液と、溶液Bを20倍に希釈した液を、使用直前に調製します。未希釈の血管懸濁液（生細胞および死細胞）200 µLそれぞれに、希釈した溶液Aを3.6 µL、希釈した溶液Bを6 µL加えます。暗所で15分間インキュベートした後、懸濁液を4 °Cで10,600 ×g、5分間遠心分離します。ピペットを用いて上清を除去します。

ペレットを50 µLの10% Glycerolに懸濁させ、ピペッティングにより均質化します。各懸濁液を8 µLずつガラススライド上に滴下し、小さなカバーガラスで覆います。遮光して保管してください。

蛍光顕微鏡下で懸濁液を観察します。1 mlあたり10⁷個のBA lipの濃度で懸濁液を調製し、各クライオバイアルに1 mlの凍結保存液を入れます。次に、1 mlの凍結保存液に150 µLのS懸濁液を加え、チューブを転倒混和して均質化します。

クライオバイアルを冷凍容器に入れる。容器を−80°Cで少なくとも24時間保持する。チューブを保存ボックスに移し、解凍まで−80°Cで保存する。

37 °Cに設定したウォーターバスで、凍結した懸濁液を融解させます。懸濁液を、20 mLの滅菌生理食塩水が入ったコニカルチューブに移し、遠心分離して濃縮します。

BAは、計数のためのZ維持プロトコルおよび生存率判定のための蛍光染色プロトコルに従った。1回あたり10〜8 BAを含む懸濁液を調製し、各動物に接種する前に懸濁液を均質化した。インスリン注射器で100 µLを吸引し、生存率判定において各動物の後足底に30 µLを接種した。

すべてのBAIで緑色蛍光が観察され、baiでは赤色蛍光のみが観察されました。BAIが無染色のコントロールである場合、緑色BAI光と赤色BAI光は同等の強度で観察されました。異なる期間凍結保存したM. lepraeを接種したところ、7か月後に回収されたBAIの数は10倍から1000倍に増加しました。

最後に、IL leidはin vitroで増殖しないため、本プロトコルによって、研究室での今後の使用に向けた生存可能なyl Leidを迅速かつ容易に維持できることを付け加えておきます。