Name: のための最適化されたプロトコルらい菌ひずみ管理：無胸腺ヌードマウスにおける凍結ストック保全とメンテナンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶMycobacterium lepraeの高生存率懸濁液調製法。無胸腺ヌードマウスからの組織採取、ホモジナイズ、濾過、凍結保存、および生存率評価の詳細なプロトコルを解説。ハンセン病研究に不可欠な細菌管理手法です。

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我々は技術支援のためのベアトリス·GCサルトーリ、LázaraM.トリノ、アナエリサフサロとクラウディア午後カルバリョに感謝します。私たちは、動物施設の設立を支援するためのプラナーブムK.ダスに感謝します。私たちは、原稿を改訂するためにLAIS RRコスタに感謝します。この研究は、デ·アンパロàPesquisaはトルカ·デ·サンパウロ（FAPESP 2009/06122-5）を行いFundaçãoパウリスタコントラHanseníaseとFundaçãoからの補助金によってサポートされていました。

1。 らい菌の懸濁液の調製<ol><li>無胸腺ヌードマウス（NU-FOXN1 NU）を安楽死させる前に、トリプシン溶液と培養液の準備（試薬のプロトコル-プロトコル1、2、および3）。 Mとヌードマウス4〜5ヶ月の接種後に安楽死させる動物の安楽死のためのAVMAガイドラインに従ってらい ：2013年版10（動物の像の実験および使用はFaculdadeデ·歯痛·デ·バウル（USP）の動物実験委員会のガイドラインに沿って承認され、実施された）。 70％エタノールアルコールで全体マウスをクリーニング、動物を処理するために使用される生物学的安全キャビネットの内側。 </li><li>足根関節遠位止血鉗子を使って後足を開催しています。鉗子下のハサミで足を切断し、20分間、2％のヨウ素に足を浸す。その後、他の後足の手順を繰り返します。 </li><li>に足を転送今後の作業の生物学的安全キャビネットの清掃。 2％のヨウ素から足を取り、滅菌ガーゼでそれらを乾燥した後、骨の近くにすべての軟部組織（真皮、表皮、腱、および神経）を除去、数22または23メスの刃を使用して2フットパッドを集める。中足骨の骨と第一と第五指骨を取り除く。無菌ペトリ皿に材料を置き、メスの刃でそれを掻き落として、表皮を取り除いてください。ハサミで組織を小片にカットし、丸底チューブに転送。重量組織およびハンクス平衡塩溶液（HBSS）の1ミリリットルを加える。サンプルの暖避けるためにチューブを氷上に保管してください。 </li><li> HBSSの別の1ミリリットルを追加し、組織ホモジナイザーを使用してサンプルを均質化する。 <ol><li>最初の均質化サイクル：スピード4（14450 rpm）で15秒の3パルス。 </li><li>残りの破片を除去するためにセルストレーナーを通過させること、無菌50mlコニカルチューブに上清を移します。ソリューションはGRAで通過できるようにVITY。 </li><li> HBSSの追加の2ミリリットルを追加し、均質化サイクル（1.4.1項）を繰り返し、再び細胞濾過器のサンプルを渡します。 </li><li> 9ミリリットルにボリュームを持ってHBSSを追加することにより、ストレーナを洗浄します。セルストレーナーを捨てる。 </li></ol></li><li> 0.5％トリプシン溶液のアリコートを解凍する。最終濃度0.05％トリプシンを得るために細胞懸濁液を9mlに1mlのトリプシンを加える。残りの解凍したトリプシンを捨てる。 37℃の水浴中で60分間インキュベートする。インキュベーション後、トリプシンを希釈するために滅菌生理食塩水を添加することにより、40ミリリットルにボリュームを起動します。 </li><li> 4℃で30分間1700×gで遠心分離</li><li>慎重にチューブを反転させて上澄みを捨てる。チューブをタップしてペレットを再懸濁した後、滅菌生理食塩水1ミリリットルを加える。 （組織の収量/グラムを計算する）懸濁液の最終体積を測定する新しいコニカルチューブにサスペンションを転送します。 </li><li> 1メートルを使用して細菌性サスペンションを均質化26 G針でLインスリン注射器を新しいチューブにサスペンションを転送中。 </li><li>各媒体に2滴（50 UL）を配置することにより、サスペンションの微生物制御を実行します。7H9とローウェンスタイン·ジェンセン媒体及びマイコバクテリアの汚染を検出するため、30日間、37℃でインキュベートする。同様に、ブレインハートインフュージョン（BHI）培地に接種し、好気性細菌を汚染の検出のために、37℃で24時間インキュベートする。 </li><li>染色のためにチューブにサスペンションを小分け：冷チールネルゼン染色に35μL（プロトコル2）、及び生存率の決定（プロトコル3）のための200μLを。 </li><li>チールネルゼン染色（Zn）をした後、抗酸菌個/ ml（AFB / ml）の数を計算します。ヌードマウスの接種のために、1×10 8 AFB / mlの懸濁液を調製、30μL/フット/動物（プロトコル5）を接種するために十分な容量を持っており、接種までサスペンションの寒さを保つようにしてください。凍結のため、1×10 7 AFB / mlのSUSを用意年金（プロトコル4）。 </li></ol> 2。冷たいチールネルゼン染色<ol><li>染色を開始する前に、血清/フェノール溶液及びZN染色溶液を調製する（試薬のプロトコル - プロトコル4および5）。免疫組織化学ペンを使用して3つのスライドガラス上に3つの円（内径10ミリメートル）を描く。 （1）正常または希釈されていない、（2）1時10分、および（3）1:100番号2鉛筆（注：一部の黒鉛がZN染色後にフェードイン）を使用して：スライドを識別します。 </li><li> すなわち 、その後1:10 5μLを取り、生理食塩水45μLを加え、希釈していないサスペンションの5μLと生理食塩水の45μLを加え、1:10〜1:100の段階希釈に細菌性懸濁液（ステップ1.10）を希釈します。 </li><li>血清/フェノール溶液5μLと円あたりの細菌性懸濁液10μlを追加します。均質化および使い捨てループのハンドルの円の領域の周りに均等に分散。サスペンションは水平にテーブルの上に乾燥するのを待ちます。 </li><li>日後にrying、ブンゼンバーナー（約20秒計）11の青い炎の上をスライドを3回通過することにより、スミアを修正。 </li><li>染色のために、20分間、チール·ネルゼン濾過のcarbofuchsine（約5ml）で、スライドの表面全体を覆​​う。 </li><li>水（遅い流れ）を実行中にスライドを洗浄します。 </li><li>約20秒間、10％の酸アルコール溶液でスライドをカバーしています。 </li><li>流水で再びスライドを洗浄します。 </li><li> 5分間メチレンブルー溶液でスライドをカバーしています。 </li><li>流水でスライドを洗浄し、室温で乾燥させます。 </li><li> 100X油浸対物レンズを使用して20フィールド/サークル（合計60フィールド/スライド）を数える。次のように抗酸菌個/ ml（AFB / ml）を計算は、ハンセン病のための12の実験技術の記載に従って、行われます。 AFB /フィールド= 60で割った3つの円（60フィールド）で見つかった菌数の合計。 AFB /ミリリットル= AFB /フィールドX定数円の（面積×100）は、対物レンズ開口の面積で割って、希釈された懸濁液をカウントする場合、希釈係数（10または100）によってAFB / mlの数を乗算する。 </li></ol> 3。生存率の決定<ol><li>開始する前に、オートクレーブ処理Mを準備するらい菌懸濁液（試薬のプロトコル-プロトコル7）。 Mの定性的測定のための適切なキットを（試薬や機器の表を参照）を使用懸濁液中のらい菌の生存率。以下のように希釈溶液（すべての手続きは薄暗い光の下で実行する必要があります）。（生理食塩水に倍溶液B 20を希釈、生理食塩水に10倍に1μlのストックを（1μLのストックを加えた9μlの生理食塩水）溶液Aを希釈プラス19μlの生理食塩水）。 </li><li>試験対象の細菌性懸濁液（ステップ1.10）の200μlに希釈した溶液Aの3.6μLおよび希釈溶液Bの6を添加する。以前にオートクレーブ処理M.らい菌懸濁液を、日常として使用される生存能力染色についてegativeコントロール。 </li><li>暗所で室温で15分間懸濁物をインキュベートする。 </li><li> 4℃で5分間10600×gでチューブを遠心分離</li><li>上清を捨て、10％グリセロールの15μlにペレットを再懸濁します。きれいなスライドガラスの表面に8μLを適用し、小型のカバーガラスでそれをカバーしています。 （分子プローブの勧告を参照）、適切なフィルターを含む、蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析します。ヨウ化物（PI）染色をプロピジウムする染色SYTO 9（サイ）を比較することによって、結果を評価する。 注意：SY染色は両方死んで、生きた細菌の100％を貫通し、PI染色は、損傷した膜を有する細菌のみを貫通している。オートクレーブ滅菌懸濁液（陰性対照）は、細胞破片の存在に起因する細菌の塊を形成することができる。生/死評価のために使用の半定量的スケールは、0〜2 +に変化し、0は、細胞の30％未満PI染色に対して陽性であることを示し、1 +は、30の間を意味する -細胞の50％がPI染色に陽性であり、2 +は、細胞の50％以上がPI染色に陽性であることを意味する。 0のスコアが使用するために最も適切であると考えている。 </li></ol> 4。凍結/融解M.らい菌サスペンション<ol><li>開始する前に、凍結培地（ - プロトコル6試薬のプロトコル）を準備します。凍結のため、以下の手順を実行します。 <ol><li>凍結培地の1ミリリットルと一緒に、滅菌クライオバイアルに加え、1×10 7 AFB /を含む懸濁液150μlのを追加します。 </li><li>冷凍コンテナにクライオバイアルを置き、24時間、-80℃で容器を保管してください。 </li><li>収納ボックスに凍結バイアルを転送し、-80℃で保管し</li></ol></li><li>解凍のために、以下の手順を実行します。 <ol><li> -80℃から凍結した懸濁液でクライオバイアルを取り外し、サスペンションを解凍開始する37℃の水浴に入れてください。 </li><li>無菌の20ミリリットルを含むチューブにサスペンションを注ぐ生理食塩水。解凍が完了するまで、静かにサスペンションを混ぜる。 </li><li> 4℃で、1,700×gで、30分間、懸濁液を遠心分離する</li><li>上澄み液を捨て、所望の容量に到達するために十分な滅菌生理食塩水を追加します。シリンジ（ステップ1.8）を通過させることにより、サスペンションを均質化する。 </li><li> ZN染色、生存能力の決定および接種のために、プロトコル2、3と5に従ってください。 </li></ol></li></ol> 5。マウス接種<ol><li>二人は1が接種物を管理するため、マウスと別のを抑制するために、この手順のために必要とされる。接種される動物は、倫理指針および規制に従って処理してくださいとすべての手順は、制度的動物管理使用委員会によって承認されなければならない。足を上に向けて首筋によってヌードマウスを拘束。 </li><li> 26 Gの針に通してサスペンションを均質化する。接種物を1ミリリットルの注射器、吸引十分な細菌性懸濁液でTE 2フットパッド（30μL/フットパッド）。 </li><li> 、後足を保持注射前に70％エタノールアルコールでフットパッドをきれいにし、針のベベルと針を皮内に導入し、近位からの肉趾の先端側に、最大指摘した。懸濁液30μLを注入。足蹠注射は、麻酔したマウスで行ってもよい。 </li><li>接種物の逆流を防ぐために皮膚から針を引き抜く前に5秒待ってください。マウスは、ソフトな寝具接種後に収容されるべきであり、歩行や自傷の兆候を監視する必要があります。 </li></ol>

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利害の対立が宣言されていません。

Mの増殖のためのよく示され、成功したプロトコルの詳細な説明らい菌は大いに必要とされている。我々の研究は、ろ過およびトリプシン消化による接種の準備のプロトコルは接種材料は、（+スコア0）非常に少ない細胞片とし、菌の高い生存率を得ることができることを実証している。水酸化ナトリウムは、桿菌6の精製の ​​ための組織を分解するために使用されている。 M.の精製の ​​ために水酸化ナトリウムを用いて我々の研究室で行われた研究らい菌は生存判定および動物接種（データは示していない）のための懸濁液の均質化を妨げ、菌の塊の形成をもたらした。 ろ過およびトリプシン消化により接種の準備が直面する潜在的な問題は、細菌や真菌剤との接種物の細胞片と汚染を大量に含まれています。携帯DEBRの場合大量に精製後に観察されない、いずれかのトリプシンはもはやアクティブであるか、生物学的物質の過剰な量があるとされている。トリプシン原液の酵素活性を評価する必要があります。初期の生物学的材料の過剰が疑われる場合、材料は、アリコートに分割されるべきであり、プロトコルは、別々のバッチで実施されるべきである。細菌や真菌剤との接種物の汚染を避けるために、注意が無菌条件下で材料を処理するのに注意する必要があります。真菌および/または細菌汚染が検出された場合、懸濁液は廃棄されるべきである。 我々のプロトコルの制限が記載された半定量的な方法を使用して生存能力評価の主観性である。生存率は公表定量法6より精度が、より実用的で半定量的に評価した。 0 +と1 +の実行可能性のスコアが伝播し、凍結の維持のために満足のいくものであるらい菌。ラヒリら 。すでに百分の80から90までの実行可能な接種材料を接種したヌードマウスは、接種の4〜5ヶ月で（高い生存菌）を採取するのに適したフットパッドにつながることが示されている。したがって、（4ヶ月前後）感染初期には最高の収穫期である。凍結接種の収穫のために、本プロトコルにおけるマウスは成長曲線を保証するために、より長い期間（6ヶ月）、接種維持した。適切な実行可能性を確保するための重要なステップは、ホストからの生物学的物質の収集および処理した後、好ましくは、24時間以内に、新鮮な菌懸濁液を使用することである。また、試薬の品質、新たに調製した希釈トリプシンおよび生存能力染色ソリューションは、再現性のある結果を保証するために必要です。 このプロトコルの他の制限は、最終M.らい菌懸濁液は、宿主DNA、RNA、タンパク質等の自由ではない。したがって、他の精製工程はtは添加されなければならないO Mを得るらい菌サスペンション宿主細胞成分を含まない。 M.の全組織標本を凍結することによって、生存菌を維持するための方法らい菌病変は9報告されている。しかし、Portaels らの研究。凍結Mの解凍後65から97までパーセントの間の範囲の生存率を実証し大幅な損失、 らい菌はアルマジロ9から得られた組織標本を感染させた。我々のプロトコルは、生存能力指数はMに見られていることを実証（ 表1）に凍結されていなかった分量と比較した場合、凍結融解後のらい菌懸濁液は、ドロップされた。実際、Mを凍結生存能力スコア0 +は凍結していないサスペンションにしている間生存率は、1 +のスコアを持つメディアを凍結におけるらい菌の懸濁液を50〜70％の範囲の生存率をもたらした。それにもかかわらず、Mの乗算らい菌は （ヌードマウスの7ヶ月後の接種後良好であった<strong&gt;表1）。再構成サンプルでヌードマウスの接種は平均100回初期接種に比べて菌数が増加した60日間の凍結を維持。それが表示されるMを凍結代わりに、感染した組織標本の凍結培地中らい菌懸濁液を、より効率的である。我々のプロトコルの重要なステップは、コルストンとヒルソン8によって示されるように、実行可能な菌を維持するために必要な冷凍コンテナ、中AFBの緩慢凍結である。将来の実験は、より長い期間の後に凍結菌の生存率を評価するために実施されるであろう。 要約すると、M.理由らい菌はin vitroで成長しない、我々のプロトコルは、実行可能な接種物の維持管理のための迅速かつ容易な代替を可能にし、成功した冷凍工程は、このように定義された株の銀行の設立を可能にする、動物での連続継代することなく、株の維持を可能にする。 このセクションでは、このプロトコルを実行するための試薬を調製するための手順を説明します。 1。トリプシン<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>トリプシン</td><td> 0.5グラム</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td> 100ミリリットルまで</td></tr></tbody></table>殺菌フィルター。 -20℃で保存 2。 7H9 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 7H9ブロスベース</td><td> 4.7グラム</td></tr><tr><td> 40％のグリセロールストック</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td> 900ミリリットルまで</td></tr></tbody></table>撹拌しながら、グリセリンを追加した後、水でベースを混ぜる。滅菌する20分間121℃でオートクレーブ。 4℃で保存する 3。ブレインハートインフュージョン（BHI） <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> BHI </td><td> 37グラム</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>最大千ミリリットル</td></tr></tbody></table>滅菌する15分間121℃でオートクレーブ。 4℃で保存する 4。フェノール血清 4.1）、5％フェノール<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>フェノール</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td> 100ミリリットルまで</td></tr></tbody></table> 4.2）は、血清フェノール<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td> 5％フェノール</td><td> 98ミリリットル</td></tr></tbody></table> 4℃で保存する 5。冷たいチールネルゼンステインのためのソリューション 5.1）CarboFuchsin <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tboDY&gt; <tr><td>フクシン</td><td> 1グラム</td></tr><tr><td>フェノール結晶を60℃に融合</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>純粋なエチルアルコール</td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td> 100ミリリットルまで</td></tr></tbody></table>各使用前にフィルタ。 5.2）メチレンブルーベース<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>メチレンブルー</td><td> 3グラム</td></tr><tr><td> 95％エチルアルコール</td><td> 200ミリリットルまで</td></tr></tbody></table> 5.3）アルコール酸<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 70％アルコール</td><td> 990ミリリットル</td></tr><tr><td> chloridric酸</td><td> 10ミリリットル</td></tr></tbody></table> 6。凍結用培地： <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OADC </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td> 7H9培地</td><td> 100ミリリットルまで</td></tr></tbody></table>使用前にオートクレーブグリセロール、濾過によりOADCを殺菌。 7。オートクレーブ処理M.らい菌サスペンション 20分間121℃でオートクレーブ。 -20℃で保存

ハンセン病は、 らい菌によって引き起こされる疾患は、世界の1,2の多くの国で重要な公衆衛生問題である。皮膚や末梢神経の両方に影響を与え、感染症として知られているにもかかわらず、疾患の複雑な免疫病原性に関与する機構についての知識のいくつかのギャップが残っています。 Mの挑戦的な特性のうちその調査を妨げるらい菌は、人工培養培地で増殖することができないことと、比較的長い倍加時間（約14日） の3,4である。 M.を使用するほとんどの実験手順らい菌は、ハンセン病患者の皮膚病変から、あるいはそのようなアルマジロやマウス5,6のいくつかの株のような実験動物モデルから精製菌を使用して設定されています。 何年もの間、研究者はMの精製に依存していますらい菌多細菌性LEPRの皮膚病変から実験手順で使用するためのOSY患者。ライブMのインビトロ培養やメンテナンスのためのいくつかの実験室の条件らい菌が試みられているが、今日まで、動物モデルは、研究目的のために最も適していることが判明した。 1960年代と1970年代に、研究者はMの検出と評価のために、マウスやアルマジロを使い始め抗Mに対応して、細菌の増殖をモニタリングらい菌の生存率、 らい菌薬、およびマイコバクテリア株の2,4の成長と維持に。 動物モデルは、倫理的な問題、メンテナンスのコスト、動物の維持のために必要な特別なインフラ、結果の再現性が悪いと最終利回りを含め、特にアルマジロとヒト以外の霊長類では、いくつかの制限があります。現在、マウスはハンセン病研究のための好ましいモデル動物である。マウスを用いた実験室条件は、実施が容易で、容易に入手可能であり、標準化されたプロトコルを可能<sup&gt; 7,8,9。ヌードマウスは、M.の維持に使用されている低くても実行可能な細菌性負荷で、T細胞欠損免疫応答があふれんばかりの肉芽腫形成と良好な細菌性の乗算につながるためらい菌菌株 。このように、この動物モデルは、ハンセン病研究コミュニティ内で広く受け入れを得ています。 今回の報告では、我々はヌードマウスのフットパッドからの菌の酵素を精製するための単純なプロトコルを記述し、Mの準備のために意図最小限の細胞破片と、高細菌の生存率とのらい菌サスペンション。生存率は急速に実験室で行うことができ、蛍光顕微鏡法によって決定される。また、コールドチールネルゼン染色および光学顕微鏡により桿菌カウントするための標準的な方法への変更を示しています。さらに、我々はMのメンテナンスや保管のための代替プロトコルを提示細菌性STの凍結融解を可能らい菌の菌株、ocks。

<table><tbody><tr><td>BacLight細菌生存率キット</td><td>Invitrogen;分子プローブ</td><td>L7007</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Cryo 1 &deg;C 冷凍容器</td><td>Nalgene</td><td>5100001</td><td></td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen medium</td><td>LB Laborclin</td><td>901122</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>TEK Nova Inc</td><td>S5812</td><td></td></tr><tr><td>Pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管 50 ml/円錐ベース</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー&nbsp; - 40 &micro;m ナイロン</td><td>BD ファルコン</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td></td><td>Σ T-7409</td><td></td></tr><tr><td>ミドルブルック 7H9 ブロス ベース</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>M0178 フルカ</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ギブコ</td><td>BRL 15514011</td><td></td></tr><tr><td>脳心輸液 (BHI)</td><td>オキソイド LTDA</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>フクシン</td><td>メルク ミリポア</td><td>1159370025</td><td></td></tr><tr><td>フェノール&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15509037</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>メルク ミリポア</td><td>EX02764</td><td></td></tr><tr><td>クロリドリック酸</td><td>メルク</td><td>1131349010</td><td></td></tr><tr><td>BBL ミドルブルック OADC (オレイン酸-アルブミン-デキストロース-カタラーゼ)</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ;ライフテクノロジー</td><td>ズ 26140079</td><td></td></tr></tbody></table>

のための最適化されたプロトコル<em&gt;らい菌</em&gt;ひずみ管理：無胸腺ヌードマウスにおける凍結ストック保全とメンテナンス

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

らい菌によって引き起こされるハンセン病は、ブラジルなど、世界中の多くの国でまだ流行している重要な感染症である。 M.を成長させるための既知の方法は現在ありませんらい菌のin vitro実験室でこの病原体の研究で大きな障害と提示する。そのため、Mの維持および増殖らい菌の菌株は、好ましくは、無胸腺ヌードマウス（NU-FOXN1ν）で行われる。マウスを用いた実験室条件は、実施が容易で容易に入手可能であり、再現性のある結果を達成するためのプロトコルの標準化および開発を可能にする。蛍光顕微鏡によって決定された本報告書では、最小限の細胞破片と、高細菌の生存率を有する懸濁液が得トリプシンを使用して、ヌードマウスのフットパッドから菌を精製するための単純なプロトコルを記述します。チールネルゼンによる桿菌カウントするための標準的な方法への修正染色し、光学顕微鏡にも実証されている。さらに、我々はMのメンテナンスや保管のための代替プロトコルとして凍結融解桿菌株のためのプロトコルを記述らい菌の菌株。

プロトコルの成功の3つの方法で評価することができる。まず、接種物の品質の評価は、細胞破片の量と最終懸濁液中の生菌の結果の割合（プロトコル3を参照）によって決定されます。 図1及び図2に示すように、最終的な細菌性懸濁液は、非常に少ない細胞破片と高い生存率を（0 +スコア）を含有し、最も桿菌はSYTO 9緑色蛍光染色で染色していることに注意し（染色は、両方とも死んだ、生きた細菌の100％を貫通図1）と赤色PI蛍光染色（染色は、損傷を受けた膜を有する細菌のみを貫通し、 図2）を用いて染色し、わずか数桿菌。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1.jpg" /> 図1。のSYTO 9染色<html> らい菌サスペンション 。緑色蛍光は生きていると死んMの存在を示していますらい 。 400X。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2.jpg" /> 図2。 M.のPI染色らいサスペンション。死者Mの少数を示す赤色の蛍光らい 。 400X。 第二に、高い生存率接種材料は4〜5ヶ月後の動物の足蹠での菌の増殖に対する影響を与える映像（プロトコル1）に示すように、明らかな肉眼的病変の開発を、接種後。プロトコルの成功を評価するための第三の方法は、（プロトコル4を参照）。異なる期間のために凍結されていた菌を接種したマウスの足蹠にAFBの生存および増殖を評価することである。 「CellSpacingの= &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td>実験（動物） </td><td> 0日目AFB / mlの凍結された数</td><td>生存能力スコア/日0 </td><td>凍結期間（日数） </td><td>凍結後に接種された空軍基地の数</td><td>凍結後の生存能力スコア</td><td> 7カ月後に回収されたAFB / mlの数</td></tr><tr><td> 1（1） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2.3×10 8 </td></tr><tr><td> 1（2） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3.8×10 7 </td></tr><tr><td> 1（3） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8.5×10 7 </td></tr><tr><td> 1（4） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7×10 5 </td> &lt;TD&gt; 1 + </td><td> 4.6×10 7 </td></tr><tr><td> 2（1） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4.2×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.7×10 7 </td></tr><tr><td> 2（2） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4.2×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 4.8×10 6 </td></tr><tr><td> 2（3） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4.2×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8.6×10 6 </td></tr><tr><td> 3（1） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.2×10 7 </td></tr><tr><td> 3（2） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.8×10 7 </td></tr><tr><td> 3（3） </td><td> 1.0×10 7 </td><tD&gt; 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.8×10 7 </td></tr><tr><td> 3（4） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2.6×10 7 </td></tr><tr><td> 3（5） </td><td> 1.0×10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7×10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3.7×10 6 </td></tr></tbody></table> 表1。 Mの結果ポスト凍結懸濁液を使用したらい乗算 。 表1は、M.の結果を示す凍結後の懸濁液を使用したらい菌の増殖。解凍後の懸濁液の生存スコアは1 +であった。凍結プロトコールは、異なる凍結期間を試験するために、3つの独立した実験で行った。 15または60日間、凍結接種物との両方の実験では、結果は、P類似していた凍結後ropagationは10〜1,000回接種（ 表1）の7ヶ月後に、各フットパッドから回収AFB数の増加が得られた。そのため、Mの凍結OADC（オレイン酸-アルブミン-デキストロース-カタラーゼ）を補足した7H9培地中のらい菌懸濁液は、生存能力の維持をもたらした。 三つの接種材料は、Mを評価するために使用された二つの異なる凍結期間（15〜60日）後にらい菌の乗算。 7ヶ月後に、菌を接種したマウスの足から回収し、チール·ネルゼン染色後に計数。半定量的生存率スケール：0、PI染色された細胞の30％に存在しない、最大の手段と、1 +は、PI染色された細胞の30〜50％の間を意味し、2 +は、PI染色された細胞の50％を超えることを意味します。 AFB：抗酸菌。

マイコバクテリウム·レプラ、ハンセン病の原因因子は、 インビトロで成長しない。我々は、M.大量の維持を確実にするために結核菌懸濁液を調製するためのプロトコルを以下に簡単に説明し様々なアプリケーションのためらい 。桿菌株を凍結融解マウス足蹠接種による伝播のためのプロトコル、生存性の評価は、詳細に記載されている。

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

本研究の目的は、高い生存能を持つマイコバクテリウム脂質懸濁液の調製方法を示すことです。これはヌードマウスへの接種に使用します。感染したマウスから、好ましくは感染の初期段階で、細菌の生存能を維持したまま回収します。高い生存率のary収量を保証するため、生物安全キャビネット内で動物を安楽死させます。止血鉗子で後方の脈動部位を固定します。痙攣とともに切除し、2%Iodineに20分間浸漬させます。除染のため、足底を上にした状態で位置を固定します。軟組織を採取します。メスを用いて第1および第5指節骨を除去し、組織の均質化を容易にします。組織を滅菌済みのペトリ皿に置きます。表皮を掻き取ります。肉芽組織をハサミで細かく切り刻み、後ほど組織の収量を算出するため、その重量を記録しておきます。切り刻んだ組織を1 mLのHank's平衡塩溶液を含むチューブに移します。さらに1 mLのHank's溶液を加え、速度4で1回15秒間、計3回組織をホモジナイズします。50 mlの滅菌コニカルチューブにセルストレーナーをセットします。懸濁液をストレーナーにピペットで滴下し、重力で溶液を通過させます。デブリを除去するため、懸濁液にさらに2 mlのHanks液を加え、再度均質化します。同じサイクルを用いて、懸濁液をこのストレーナーに通します。Hanks溶液を加えてストレーナーを洗浄します。懸濁液の総量を9 mLにするため、0.5%トリプシン溶液を1 mL加え、最終濃度を約0.05%に調整します。チューブを静かに転倒混和し、37 °Cで60分間インキュベートします。インキュベート後、滅菌生理食塩水を加えて懸濁液の容量を4 mLにします。4 °Cで1700 G、30分間遠心分離し、上清を捨てて、チューブをタッピングしてペレットを再懸濁します。1 mLの滅菌生理食塩水を加え、混合します。懸濁液を新しいチューブに移します。26ゲージの針を装着した1 mLインスリン用注射器を用い、懸濁液を新しいチューブに移しながら血管懸濁液を均質化します。18 mediumおよび7 H9 brain heart infusionに懸濁液を2滴ずつ滴下し、懸濁液の微生物学的管理を行います。11 Stein Genesenを37 °Cで培養します。その後、通常の微生物学的管理手順に従います。コードZ染色用です。生理食塩水を用いて、S懸濁液の10倍および100倍希釈液を調製します。計数用のスライドを準備する前に、各希釈液を均質化します。恒久的なインクマーカーを用いて、各スライドの表面に内径10 millimeterの円を3つ描き、計3枚のスライドを準備します。次に、免疫組織化学用ペンで円を囲みます。2B鉛筆を使用して、3つの異なる濃度（未希釈、1:10、1:100）用のスライドにラベルを貼ります。フェノール血清溶液5 µLとsary懸濁液10 µLを各円内にピペットで分注し、均質化した後、懸濁液を円の領域全体に均等に広げます。使い捨てループのハンドルを使用して、これらを水平なテーブルの上に置き、乾燥させます。乾燥後、bachelor懸濁液を上にした状態で、青色炎の上を3回通過させて固定します。コードZuniサステイニングを実施します。これらのスライドを確認してください。3つの希釈系列です。計数に最も適した希釈倍率を選択します。血管懸濁液を121 °Cで30分間オートクレーブし、200 µLの死滅させたsary懸濁液を調製します。微生物脂質の蛍光染色は、L 7 0 0 7 live dead back light bacterial viability kitを用いて行います。溶液Aを10倍に希釈した液と、溶液Bを20倍に希釈した液を、使用直前に調製します。未希釈の血管懸濁液（生細胞および死細胞）200 µLそれぞれに、希釈した溶液Aを3.6 µL、希釈した溶液Bを6 µL加えます。暗所で15分間インキュベートした後、懸濁液を4 °Cで10,600 ×g、5分間遠心分離します。ピペットを用いて上清を除去します。ペレットを50 µLの10% Glycerolに懸濁させ、ピペッティングにより均質化します。各懸濁液を8 µLずつガラススライド上に滴下し、小さなカバーガラスで覆います。遮光して保管してください。蛍光顕微鏡下で懸濁液を観察します。1 mlあたり10⁷個のBA lipの濃度で懸濁液を調製し、各クライオバイアルに1 mlの凍結保存液を入れます。次に、1 mlの凍結保存液に150 µLのS懸濁液を加え、チューブを転倒混和して均質化します。クライオバイアルを冷凍容器に入れる。容器を−80°Cで少なくとも24時間保持する。チューブを保存ボックスに移し、解凍まで−80°Cで保存する。37 °Cに設定したウォーターバスで、凍結した懸濁液を融解させます。懸濁液を、20 mLの滅菌生理食塩水が入ったコニカルチューブに移し、遠心分離して濃縮します。BAは、計数のためのZ維持プロトコルおよび生存率判定のための蛍光染色プロトコルに従った。1回あたり10〜8 BAを含む懸濁液を調製し、各動物に接種する前に懸濁液を均質化した。インスリン注射器で100 µLを吸引し、生存率判定において各動物の後足底に30 µLを接種した。すべてのBAIで緑色蛍光が観察され、baiでは赤色蛍光のみが観察されました。BAIが無染色のコントロールである場合、緑色BAI光と赤色BAI光は同等の強度で観察されました。異なる期間凍結保存したM. lepraeを接種したところ、7か月後に回収されたBAIの数は10倍から1000倍に増加しました。最後に、IL leidはin vitroで増殖しないため、本プロトコルによって、研究室での今後の使用に向けた生存可能なyl Leidを迅速かつ容易に維持できることを付け加えておきます。

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Research

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