モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

この手順の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの幼生の末梢神経損傷後のグリア細胞の挙動をタイムラプス画像化することです。これは、まず麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼生を低融点のアロスに取り付け、ガラス底のシャーレに取り付け、解剖針で位置決めすることで達成されます。次に、取り付けられた幼虫を共焦点顕微鏡に置きます。

アブレーションのために神経が選択され、損傷していない神経の軸索とグリア細胞の画像が取得されます。次に、ROIが神経に沿って選択され、レーザーが発射されて選択した領域がアブレーションされ、神経切断が作成されます。最後に、軸索とグリア細胞は、神経切断後にタイムラプスで画像化されます。

最終的には、タイムラプス共焦点顕微鏡法により、神経変性および再生中の動的なグリア細胞の挙動を示す結果を得ることができます。この方法は、再生やグリア細胞生物学の分野における重要な疑問、例えばグリア細胞が神経損傷にどのように反応するかなど、答えるのに役立ちます。また、異なるグリアのサブタイプは、変性と再生の間にどのように行動を調整するのでしょうか?

運動ニューロンと目的のグリア細胞の種類を蛍光で標識する導入遺伝子を含むゼブラフィッシュの成体を交配し、受精またはHPFの24時間後まで胚をインキュベートした後、卵水を取り出し、卵水中の1つのpH歯のスレアまたはPTUと交換してから、胚をインキュベーターに戻します。この時点から約96 HPFまで、蛍光解剖スコープを使用して、目的の蛍光遺伝子の存在について胚をスクリーニングします。陽性胚を新鮮なPTU卵水に移し、インキュベーターに戻します。

幼虫が受精後6日またはDPFに達したら、マウントするいくつかの胚を選択し、それらを小さな皿に移します。皿から水を取り除き、すぐに0.02%トリカと交換しますPTU卵水では、幼虫を麻酔薬で約5分間インキュベートします。テキストプロトコルに従って以前に調製した0.8%低メルトアグロスのEloquaを、水道水と電子レンジを入れたビーカーに入れます。

30秒間、またはアグロスが溶けるまで、アグロスのチューブが手触りがぬるく感じるまでビーカーを冷まします。次に、麻酔をかけた幼虫を35ミリメートルのガラス底皿に移します。皿の中の水をすべて取り除きます。

次に、すぐに幼虫を十分な温かいアロで覆い、皿のガラス底部分を満たします。アグロスが固まったら、解剖針を使用して幼虫を横に置きます。次に、背中を少し傾けて、取り付けられた幼虫が皿の底のガラスに触れていることを確認します。これは、怪我やイメージングに必要です。

針を使用して、アグロが固化して幼虫が固定されるまで、幼虫を所定の位置に維持します。次に、アグロと幼虫を完全に覆うのに十分なトリカ水を皿にゆっくりとピペットで入れます。すべての共焦点顕微鏡装置、ゼブラフィッシュ導入遺伝子の励起に適したダイオードレーザー、窒素励起色素レーザーの電源を入れます。

ブランクビームスプリッターが所定の位置にあり、435ナノメートルのコアと色素セルが所定の位置にあることを確認してください。レーザーアッテネーターを完全に開いてから、63 x 1.2 naの水浸レンズと片面がミラーリングされたスライドガラスを使用してイメージングソフトウェアを開きます。明視野照明を使用して、鏡の傷やエッチングを見つけて焦点を合わせます。

イメージングソフトウェアを使用して、レーザーキャリブレーションとパワー設定を制御するウィンドウからコンピューター画面上のエッチングを表示し、焦点を合わせます。メインツールバーからパルス数を1に、減衰を3%透過に設定します。楕円ツールを選択し、コンピューター画面上の画像をクリックします。

1 つの円形 ROI を作成するには、画像上に 4 つの円形 RI がランダムに配置されるまで、このプロセスをさらに 3 回繰り返します。次にレーザーを発射します。レーザーが機能し、適切に校正されている場合、これにより4つの小さなスポットエッチングが作成され、各円形ROI内に1つずつ作成されます次に、顕微鏡ステージからスライドガラスを取り外し、対物レンズを清掃します。

ブランクビームスプリッターを100%ILLビームスプリッターに交換し、レーザーアブレーションを使用して運動神経を横断します。対物レンズに少量の水浸用メディウムを塗布し、クリップを使用して幼虫をマウントした皿を適切なステージに置き、接眼レンズと広視野照明を使用して安定させます。幼虫に焦点を当て、運動ニューロンを見つけます。

半部セグメント10〜20の神経をスキャンし、切断する運動神経を選択します。次に、コンピューター画面に神経のライブビューを表示します。Z平面を選択し、損傷していない神経の軸索とグリア細胞の画像を取得します。

次に、5〜30分間隔ですべての細胞タイプのZ投影をキャプチャするためのタイムラプスイメージング設定を準備します。実験に応じて、100%ILLビームスプリッターを取り外し、ブランクと交換します。神経のライブビューに戻り、適切な蛍光チャネルを使用して、切除される軸索を表示します。

楕円ツールを使用して、アブレーションする領域に薄い楕円形のROIを作成します。次に、レーザー設定を制御するウィンドウで選択した領域内に小さなROIを作成します。パルス数を 2 に、減衰プレートを 18% 透過率に設定します。

次に、選択したROI内でレーザーを発射します。10秒以上待ってから、アブレーションされた領域に蛍光がないか再度確認します。ROIは、実際には光漂白されている場合、最初はアブレーションされているように見える場合があり、完全な切断を達成するためにアブレーションの過程でROIをわずかに変更する必要がある場合があることに注意してください。

蛍光が戻ってきたら、レーザー出力を上げてレーザーを発射してください。再度、蛍光がROIS内で消え、10秒以内に戻らなくなるまで、これを繰り返します。アブレーションが完了したら、タイムラプスが完了したらタイムラプスイメージングを開始します。

イメージングソフトウェアを使用してデータをコンパイルし、各時点のカラー合成Z投影を作成します。軸索グリア細胞の挙動を同時に解析するためのクイックタイムムービーを作成します。ここで説明するアッセイは、in vivoでの軸索損傷に対するグリア細胞およびその他の神経関連細胞集団の応答を評価するために使用できます。

この方法を用いて生じた神経損傷と周囲のグリア細胞の応答の一例です。実験は、神経周囲gglでEGFPを標的とする膜を発現し、運動ニューロンで細胞質DS redを発現した6匹のDPFトランスジェニックゼブラフィッシュで行われました。損傷は、体幹運動神経の吻側突起に沿って行われ、その後、EGFPとDSの両方の赤チャネルでタイムラプス画像化されました。

これにより、損傷直後の軸索細胞とグリア細胞の挙動を同時に視覚化することができました。これらの画像は、タイムラプス動画から取得した静止した時点です。点線の楕円は、1分間にレーザーを使用してアブレーションされたROIを示しています。

離断後またはMPTでは、切除された領域は蛍光を欠いており、損傷領域は近位から遠位の切り株まで約3.5マイクロメートルを測定しました。切断の成功は、遠位神経断端を画像化し、遠位軸索の断片化や急速なクリアランスなどのウォーラー変性の兆候を探すことで確認できます。120 MPTで遠位断端に沿って軸索蛍光が見られないことは、これらの軸索が実際にウォーラー変性を起こし、取引が成功したことを示しています。

レーザーアブレーション実験を行う際には、レーザー出力を理想的な設定に調整することが重要です。理想的なレーザー出力設定は、選択したROI内でのみ神経をきれいに切除し、低すぎるまたは高すぎるレーザー出力設定は、ここで見られる最適でない結果をもたらします。レーザーを発射した後も蛍光はROI内に留まり、不完全な切断が生じました。

一方、この図に示すように、レーザー出力が高すぎると、非常に大きなアブレーションが発生しました。このビデオを見れば、レーザー切断実験のためにゼブラフィッシュをマウントする方法を十分に理解できるはずです。窒素ポンプ色素レーザーを使用して切断を作成し、タイムラプス共焦点イメージングを使用して周囲の細胞の応答を評価します。