モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

本手順の全体的な目的は、末梢神経損傷後の生存ゼブラフィッシュ幼魚におけるグリア細胞の挙動をタイムラプスイメージングすることである。まず、麻酔をかけたゼブラフィッシュ幼魚を低融点アガロースを用いてガラス底ペトリ皿に固定し、解剖針で位置を調整する。次に、固定した幼魚を共焦点顕微鏡に設置する。

切断するための神経を選択し、損傷を受けていない神経の軸索およびグリア細胞の画像を撮影します。次に、神経に沿ってROIを選択し、レーザーを照射して選択した領域を切断し、神経切断を作成します。最後に、神経切断後の軸索およびグリア細胞をタイムラプス撮影します。

最終的に、タイムラプス共焦点顕微鏡観察を通じて、神経の変性と再生におけるグリア細胞の動的な挙動を示す結果を得ることができます。この手法は、グリア細胞は神経損傷にどのように反応するのか、また、異なるグリアサブタイプが変性と再生の過程でどのように行動を協調させるのかといった、再生およびグリア細胞生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

目的の運動ニューロンおよびグリア細胞種を蛍光標識するトランスジェニック成体ゼブラフィッシュを交配させ、受精後24時間（24 HPF）まで胚をインキュベートした後、卵水を抜き、1 pH 1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）を含む卵水に交換して、胚を再びインキュベーターに戻します。この時点から約96 HPFまで、蛍光解剖顕微鏡を用いて、目的の蛍光遺伝子の有無を胚でスクリーニングします。陽性胚を新鮮なPTU含有卵水に移し、インキュベーターに戻します。

受精後6日目（DPF）に幼魚が達したら、マウント用の胚を数個選び、より小さなディッシュに移します。ディッシュから水を抜き、直ちに0.02% tricaine含有PTU卵水に置き換え、幼魚を麻酔薬中で約5分間静置します。プロトコルに従ってあらかじめ調製した0.8%低融点アガロースを、水道水を入れたビーカーに入れ、電子レンジで加熱します。

30秒間、またはアガロースが溶けるまで、ビーカーを冷やし、アガロースのチューブを触ったときにぬるく感じるまで待ちます。次に、麻酔をかけた幼虫を35 mmのガラスボトムディッシュに移します。ディッシュ内の水分を取り除いてください。

その後、直ちに、ディッシュのガラス底部分を満たす十分な量の温めたアガロースを幼虫に被せます。アガロースが固まるに従い、解剖針を用いて幼虫を側臥位に配置します。次に、幼虫をわずかに背側に傾け、固定した幼虫がディッシュ底面のガラスに接していることを確認してください。これは、損傷の付与およびイメージングに不可欠です。

針を使用して、アガロースが凝固し、幼魚が固定されるまで幼魚の位置を保持します。その後、アガロースと幼魚が完全に浸るまで、トリカ水をディッシュにゆっくりとピペットで加えます。すべての共焦点顕微鏡装置、ゼブラフィッシュのトランスジーンを励起させるための適切なダイオードレーザー、および窒素ポンプ駆動のダイレーザーの電源を入れます。

ブランクビームスプリッターと435 nanometerのコーヤーおよび色素セルが正しく設置されていることを確認してください。レーザーアッテネーターを全開にし、63 x 1.2 na水浸レンズと片面ミラー付きガラススライドを使用してイメージングソフトウェアを開きます。明視野照明を用いて、ミラー上の傷やエッチング箇所を探してフォーカスを合わせてください。

イメージングソフトウェアを使用して、レーザーのキャリブレーションおよび出力設定を制御するウィンドウから、コンピュータ画面上のエッチング部分を確認し、ピントを合わせます。メインツールバーで、パルス数を1回に、減衰率を透過率3%に設定します。楕円ツールを選択し、コンピュータ画面上の画像をクリックします。

単一の円形ROIを作成するため、画像上のランダムな位置に4つの円形ROIが配置されるまで、このプロセスをさらに3回繰り返します。次に、レーザーを照射します。レーザーが適切に動作し、校正されていれば、各円形ROIの中に1つずつ、計4つの小さなスポットエッチングが形成されます。その後、顕微鏡ステージからガラススライドを取り出し、対物レンズを清掃します。

レーザーアブレーションを用いて運動神経を切断するため、空白のビームスプリッターを100%ILLビームスプリッターに交換します。対物レンズに水浸浸液を少量滴下し、接眼レンズとワイドフィールド照明を使用して、固定した幼虫が入ったディッシュを適切なステージに配置し、クリップで固定します。幼虫に焦点を合わせ、運動ニューロンを特定します。

ヘミセグメント10から20の神経をスキャンし、切断する運動神経を選択します。次に、コンピューター画面にその神経のライブビューを表示させます。Z平面を選択し、損傷を受けていない神経の軸索とグリア細胞の画像を撮影します。

次に、5～30分間隔で全細胞種のZ投影画像を撮影するためのタイムラプスイメージング設定を行います。実験内容に応じて、100%ILLビームスプリッターを取り外し、ブランクに交換します。神経のライブビューに戻り、適切な蛍光チャンネルを使用して、切断する軸索を確認します。

楕円ツールを使用して、アブレーションを行う領域に細い楕円形のROIを作成します。次に、レーザー設定を制御するウィンドウで、選択した領域内にさらに小さなROIを作成します。パルス数を2回に、アッテネーションプレートを18%transmissionに設定します。

次に、選択したROI内でレーザーを照射します。10秒以上待機し、アブレーション領域に再び蛍光があるか確認してください。ROIが実際には光退色しているだけであるにもかかわらず、最初はアブレーションされたように見えることがある点に注意してください。また、完全に切断するためには、アブレーションの過程でROIをわずかに修正する必要がある場合があります。

蛍光が戻った場合は、レーザー出力を上げてレーザーを照射してください。R OIS内で蛍光が消失し、10秒以内に戻らなくなるまで、この操作を繰り返します。アブレーションが完了したら、タイムラプス撮像を開始してください。

イメージングソフトウェアを使用してデータをまとめ、各タイムポイントのカラー複合Z投影画像を作成します。クイックタイムムービーを作成し、軸索とグリア細胞の挙動を同時に解析します。ここで述べるアッセイは、in vivoにおける軸索損傷に対するグリア細胞およびその他の神経関連細胞集団の応答を評価するために使用できます。

ここでは、本手法を用いて作成した神経損傷の例と、周囲のグリア細胞の反応を示します。実験は、神経周辺のグリア細胞に膜標的型EGFPを、運動ニューロンに細胞質内DS redを発現する、受精後6 DPFのトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて行われました。体幹運動神経の吻側投射に沿って損傷を加え、その後、EGFPおよびDS redの両チャンネルでタイムラプスイメージングを行いました。

これにより、損傷直後の軸索およびグリア細胞の挙動を同時に可視化することが可能となりました。これらの画像は、タイムラプス動画から抽出した静止画です。点線の楕円は、1分後にレーザーを用いて切除したROI（関心領域）を示しています。

切断後またはMPT後、焼灼領域では蛍光が消失し、損傷部位は近位端から遠位端まで約3.5 µmでした。切断の成否は、遠位神経断端をイメージングし、遠位軸索の断片化や急速な消失を含むウォラー変性の兆候を確認することで判断できます。120 MPTにおいて遠位断端に沿った軸索の蛍光が見られないことは、これらの軸索が実際にウォラー変性を起こしたことを示しており、切断が成功したことを意味します。

レーザーアブレーション実験を行う際、レーザー出力を最適な設定に調整することは極めて重要です。最適なレーザー出力設定では、選択したROI内のみで神経をきれいにアブレーションできます。一方、レーザー出力が低すぎても高すぎても、不十分な結果となります。ここに示しているのは、レーザー出力が低すぎた状態で処置を行った例です。レーザー照射後もROI内に蛍光が残っており、不完全な切断となっています。

一方で、この図で示されているように、レーザー出力が高すぎると、極めて大きなアブレーションが生じました。このビデオを視聴することで、レーザー切断実験のためにゼブラフィッシュを固定する方法を十分に理解できたはずです。窒素ポンプ色素レーザーを用いて切断を行い、タイムラプス共焦点イメージングを用いて周囲の細胞の反応を評価してください。