ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

この手順の全体的な目標は、毒物または医薬品による治療後のゼブラフィッシュの幼生の行動上の欠陥を特定することです。これは、最初に胚または幼虫を収集し、発生の最初の7日間まで化学物質で処理することによって達成されます。2番目のステップは、特別に設計された金型を使用してアグロスイミングレーンを作成することです。

次に、処理した幼虫をアグロスレーンに配置し、タイムラプス撮影による行動分析を行います。最後のステップは、画像を画像Jにインポートし、社内で記述された特定のマクロを使用して、レーン内の幼虫のXY座標データを収集することです。最終的に、ハイスループット行動アッセイを使用して、回避とfigma軸の行動、および治療グループ間の水泳速度と休息の違いを見つけます。

この手法が市販されているような既存の方法と比較した場合の主な利点は、この方法を使用してより複雑な動作を観察できることです。また、安価に構築でき、セットアップも簡単です。この方法は、毒物が初期胚曝露中の脳の発達と行動にどのように影響するかなど、行動神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

また、現在の毒性スクリーニングでは見つけることができない、ヒトの微妙な脳の欠陥に関する洞察も提供できます。一般的に、この方法に不慣れな個体は、幼虫を捕まえるのが難しい場合があるため、苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、プロトコルがカスタムビルドシステムを含むため、ステップには学習曲線があるため、非常に重要です。

この手順を開始するには、緑色の糸から作られたフェイクグラスが入ったガラスのパイレックス皿をタンクに挿入します。夜明けに、ゼブラフィッシュの胚を収集するために、皿をタンクに2時間置いておきます。胚が入ったガラス皿を脱イオン水を入れたハンドヘルドストレーナーリンに注ぎます。

次に、脱イオン水にインスタントオーシャン1リットルあたり60ミリグラム、カビ防止剤として使用されるメチレンブルー1リットルあたり0.25ミリグラムを含む卵水で胚を成長させます。胚は、50ミリリットルあたり50〜60匹の幼虫で収容することも、胚を毒物で治療する準備ができるまで、より大きな繁殖タンクに収容することもできます。個々の実験の仮説に応じて、胚は直ちに治療することも、発生の特定の段階で毒物や医薬品を使用して治療することもでき、通常はDMSOに溶解した後、卵水培地で直接さらに希釈されます。

青色は、胚および幼虫の治療中にビデオデモンストレーションの目的で使用されます。幼虫と胚は、受精後7日目の行動分析が死んだ胚からの真菌または細菌の増殖を避けるために少なくとも一日おきに卵水溶液を交換するまで、50ミリリットルあたり約50〜60幼虫の密度で深いペトリ皿に収容することができます。プラスチック型を製作してレーンを作るのは、Thermos Scientific社のシングルウェルプラスチックプレートに注がれるarosです。

金型には、側面が60度の角度になっている5つのレーンが含まれています。このビデオに付属するテキストプロトコルで、金型とプレートの寸法を確認してください。まず、0.8%アロスを脱イオン水で60ミリグラム/リットルのインスタントオーシャンで溶かしてアロスを準備します。

次に、溶かしたarosを50ミリリットルを1つのウェルプレートに注いでレーンを生成します。次に、泡の形成を排除する液体のアロの上に型を非常にゆっくりと置きます。arosが冷めたら型を取り外してください。

アロスレーンは、皿に蓋をした状態で室温で最大36時間保存できます。ハイスループットの行動分析のために、イメージングキャビネットは、キャビネットの上部に取り付けられ、キャビネットの下部で下向きに15メガピクセルのデジタルカメラが取り付けられています。15.6インチの画面を持つノートパソコンを、画面を上にして配置します。

幼虫の過熱を避けるために、画面温度が摂氏28度を超えないラップトップを使用するのが最善です。アグロスプレートを配置するラップトップ画面の上にプラスチック製のディフューザーを置きます。ディフューザーは、収集された画像のパターンをさらに防ぎます。

画像キャプチャを開始するには、幼虫をペトリ皿からアグロスレーンに慎重に移動して、幼虫のストレスを軽減します。各レーンには最大20匹の幼虫を配置できますが、通常、レーンごとに5匹の幼虫を使用して、遊泳速度の最も正確な追跡を容易にし、実験ごとに必要な幼虫の数を減らし、実験に応じて医薬品や毒物の有無にかかわらず、レーンを卵水で満たします。オーバーフローを防ぐために、イメージングキャビネットに配置されるまで、レーンを完全に埋めないでください。

順応期間後、幼虫が順応するまで10分待ちます。4枚のプレートを手で直接ラップトップ画面の上に置きます。このとき、レーンの端の影をなくすために、レーンの上部と同じ高さになるように、レーンを卵、水、または化学処理で覆うことができます。

画像プログラムでは、タイムラプス撮影用にコンピューターをプログラムし、実験ごとに合計300枚の画像を6秒ごとに撮影します。ビデオ速度でイメージングするには、カメラを低解像度に設定します。一方、分解能が低いと、記録が単一のマルチウェルプレートに制限されます。

ビデオ録画は、急速水泳イベントのイメージングに適しています。このデモンストレーションでは、PowerPointプレゼンテーションを幼虫の嫌悪刺激として使用します。PowerPointは、空白の白い背景で15分間始まり、プレートの上半分に動く赤いバーが15分間続きます。

アロスレーン内の液体の蒸発を防ぐため、イメージングの最大時間を1時間未満に保ちます。このデモでは、画像 J の画像を開きます。5レーンの幼虫分析用の社内マクロが使用されており、どのユーザーでも利用できるようにすることができます。

マクロのプロンプトを使用して、減算する画像の数や色などのパラメーターを設定します。その後、マクロはカラー チャネルを自動的に分割して、赤い色を削除できるようにします。背景を減算し、しきい値を適用し、粒子分析によって幼虫を識別します。

すべての画像を画像Jマクロで処理すると、結果ファイルが表示され、各画像の個々の幼虫のXY座標、画像番号、レーン番号が含まれます。結果ファイルをExcel形式で保存し、空白の背景と移動バーの背景、次にウェル番号に基づいて並べ替えます。方程式が組み込まれたExcelテンプレートを使用して、井戸内の幼虫の配置、幼虫間の距離、移動速度、および休息量を自動的に決定します。

Cretin ラボで作成された最新の Excel テンプレートは、リクエストに応じて、さまざまな治療グループを Excel シートに表示するグラフを作成し、治療グループとコントロールを比較するための T 検定を利用できます。SPSS統計プログラムを使用して、さらに統計分析を行うことができます。結果は、対照として卵水とDMSOで処理された幼虫と、非有機食品に一般的に見られる有機リン系農薬のさまざまな濃度を示しています。

ここでは、白いバーは空白の背景にさらされた幼虫からのデータを示し、赤いバーは赤い移動バーにさらされた幼虫からのデータを示しています。コントロール。卵の水で育った幼虫は、動く赤いバーが提示された後、皿に下がることを好む傾向が強くなります。同様の結果は、さまざまな医薬品や毒物を1000 x ストック溶液として溶解するために一般的に使用される溶媒であるDMSOの1ミリリットルあたり1マイクログラムを含む卵水で幼虫を育てた場合にも得られます。

グラフは、レーン内の幼虫の割合、レーンの端にいる幼虫の割合、レーンの端にいる幼虫の割合、魚の泳ぎ速度、幼虫が休んでいる時間の割合など、行動分析から取得できる測定値を示しています。表示されている結果は、1 つの実験からのサンプリングです。しかし、繰り返すと、人間の食品中のレベルを模倣する低濃度の有機リン系農薬によって、泳ぐ速度やfigmaの行動が変化するという結果が出ています。一度マスターすれば、適切に行えば1時間半でイメージングやイメージング解析を行うことができます。

この手順の最も重要な側面は、毎日新しい媒体と交換することにより、文化的媒体を清潔に保つことを忘れないことです。