Name: グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学ぶグラム陰性菌からLPSを単離し、タンデム質量分析でリピドAの構造を評価する手法。UV光解離法が衝突誘起解離より詳細な断片パターンを提供し、抗生物質耐性メカニズムの理解に貢献する。

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<ol><li>Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+endotoxin+and+its+impact+on+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+endotoxin+research%22%5BJournal%5D)">Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis.</a> Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).</li>
<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+Modification+Systems+in+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).</li>
<li>Kim, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+TLR4-MD-2+complex+with+bound+endotoxin+antagonist+Eritoran%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran.</a> Cell. 130, 906-917 (2007).</li>
<li>Rietschel, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin%3A+molecular+relationships+of+structure+to+activity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Innate immunity.</a> The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).</li>
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<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+acylation+and+bacterial+resistance+against+vertebrate+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides.</a> Cell. 95, 189-198 (1998).</li>
<li>Yi, E. C., Hackett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+method+for+lipopolysaccharide+and+lipid+A+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria.</a> The Analyst. 125, 651-656 (2000).</li>
<li>Westphal, O. aJ., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Lipopolysaccharide.+Extraction+with+phenol-water+and+further+application+of+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohydr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure.</a> Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).</li>
<li>Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+extraction+of+R+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry+%2F+FEBS%22%5BJournal%5D)">A new method for the extraction of R lipopolysaccharides.</a> European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).</li>
<li>Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+eight+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octylosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).</li>
<li>Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+unmodified+endotoxin+preparations+by+252Cf+plasma+desorption+mass+spectrometry.+Determination+of+molecular+masses+of+the+constituent+native+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides.</a> The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+biochemistry+and+physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+NMR+spectroscopy+of+lipid+A+molecules+containing+4-amino-4-deoxy-L-arabinose+and+phosphoethanolamine+substituents.+Different+attachment+sites+on+lipid+A+molecules+from+NH4VO3-treated+Escherichia+coli+versus+kdsA+mutants+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biosynthesis+of+free+lipid+A+molecules+that+replace+lipopolysaccharide+in+Francisella+tularensis+subsp.+novicida%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida.</a> Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).</li>
<li>Strain, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+polar+substituents+and+fatty+acyl+chains+on+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octulosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium.+Studies+by+1H%2C+13C%2C+and+31P+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).</li>
<li>Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IR+and+UV+Photodissociation+as+Analytical+Tools+for+Characterizing+Lipid+A+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry+%28Washington%2C+DC%2C+United+States%22%5BJournal%5D)">IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures.</a> Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).</li>
<li>Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigation+of+bacterial+lipopolysaccharides+by+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+acylation+of+Vibrio+cholerae+lipopolysaccharide+requires+phosphorylation+of+Kdo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).</li>
<li>Hankins, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+novel+Vibrio+cholerae+lipid+A+secondary+hydroxy-acyltransferase+and+its+role+in+innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition.</a> Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).</li>
<li>Chan, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+characterization+of+lipid+A%3A+electrospray+ionization+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).</li>
<li>Boue, S. M., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+the+structure+of+lipid+A+from+Enterobacter+agglomerans+by+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).</li>
<li>Kussak, A., Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole+ion-trap+mass+spectrometry+to+locate+fatty+acids+on+lipid+A+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria.</a> Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).</li>
<li>El-Aneed, A., Banoub, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+molecular+structure+of+lipid+A+isolated+from+both+a+rough+mutant+and+a+wild+strain+of+Aeromonas+salmonicida+lipopolysaccharides+using+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).</li>
<li>Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+advances+in+lipidomica%3A+collision-induced+decomposition+of+Kdo2-lipid+A%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediators%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).</li>
<li>Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lipid+A+from+Escherichia+coli+O157%3AH7%3AK-+using+thin-layer+chromatography+and+ion-trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Li, J., Altman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+lipid+A+region+of+Aeromonas+salmonicida+subsp.+salmonicida+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide.</a> Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).</li>
<li>Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+lipid+A+from+nontypeable+and+type+f+Haemophilus+influenzae%3A+variability+of+fatty+acid+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution.</a> Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).</li>
<li>Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacterial+lipid+A+analysis+by+negative+electrospray+ion+trap+mass+spectrometry%3A+Stepwise+dissociations+of+deprotonated+species+under+low+energy+CID+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions.</a> Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).</li>
<li>Silipo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterizations+of+lipids+A+by+MS%2FMS+of+doubly+charged+ions+on+a+hybrid+linear+ion+trap%2Forbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer.</a> J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+pyrophosphorylated+forms+of+lipid+A+in+gram-negative+bacteria+using+a+multivaried+mass+spectrometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+structure+characterization+of+lipid+A+extracted+from+Yersinia+pestis+for+determination+of+its+phosphorylation+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+addition+to+Vibrio+cholerae+LPS+establishes+a+link+between+surface+remodeling+in+gram-positive+and+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).</li>
<li>Han, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+in+a+Gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium.</a> Nature. 3, 1153-1110 (2012).</li>
<li>Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+phosphorylation+of+lipid+A+is+linked+to+the+synthesis+of+undecaprenyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate.</a> Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).</li>
<li>Galloway, S. M., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Escherichia+coli+defective+in+the+first+step+of+endotoxin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis.</a> The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).</li>
<li>Trent, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+a+polyisoprene-linked+amino+sugar+in+polymyxin-resistant+Salmonella+typhimurium+and+Escherichia+coli%3A+structural+characterization+and+transfer+to+lipid+A+in+the+periplasm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).</li>
<li>Chung, H. S., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxygenases+in+Burkholderia+ambifaria+and+Yersinia+pestis+that+hydroxylate+the+outer+Kdo+unit+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).</li>
<li>Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+modifications+characteristic+of+Salmonella+typhimurium+are+induced+by+NH4VO3+in+Escherichia+coli+K12.+Detection+of+4-amino-4-deoxy-L-arabinose%2C+phosphoethanolamine+and+palmitate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).</li>
<li>Raetz, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kdo2-Lipid+A+of+Escherichia+coli%2C+a+defined+endotoxin+that+activates+macrophages+via+TLR-4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4.</a> Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

このプロトコルでは、細菌の全細胞由来の脂質A種の単離を詳述し、かつ化学的に、この単離された物質を特徴付けるためにTLCまたはMSベースの分析方法を記載している。タンデム質量分析法は、生物学的化合物の新たな構造解析のための強力な戦略であり、自然の中で観察されたリピドA分子の盛装の化学的特性のために非常に貴重です。 CIDとUVPD脂質A分子のキーフィンガープリントを提供するプロダクトイオンの異なるタイプを作成するには、2つの相補的な活性化方法である。 CIDとUVPDの両方を使用して、MS / MSフラグメンテーションは、化学構造の割り当てのための細かいディテールを提供する、脂質A構造の微妙な違いを解明することができます。このタイプのデータは、脂質分子種の生物学の正確な相関構造/機能の関係を確立することが必要である。また、年代に32 P-放射性標識リピドA種の手順を記載している32 P-リピドA種の化学的パターンはTLCおよびオートラジオグラフィーを用いて可視化することができるモール規模細菌培養。 任意のユーザーが知ってお...

リポ多糖（LPS）は、ほぼすべてのグラム陰性菌の主要外表面分子であり、3つの分子のドメインで構成されています。遠位O抗原多糖、コアオリゴ糖、および膜結合脂質ドメインの外葉の上に堆積外膜二重層1,2。脂質ドメインは、リピドAは、温和な酸加水分解の際に1 LPSのクロロホルム可溶性部分として定義することができる3 -デオキシ-D-マンノ-オクト-2 - ulosonic（のKdo）残基および脂質分子種から構成され2。モデル生物大腸菌（E.coli）1,2で観察され、主要なリピドA種と一致して、標準的な脂質分子は、化学的にアシル化ヘキサ-およびビス -リン酸化されdiglucosamineバックボーンとして定義することができる。グラム陰性菌を通じて保存ナイン構成的に発現される遺伝子は、ドメイン（ 図1）1,2脂質の産生に関与している。ほとんどの細菌は、脂質3のさらなる化学修飾に参加系統発生の保存度が異なる遺伝子の追加セットを持っています。脱リン酸化、アシル鎖の除去、およびそのようなアミノ糖（ 例えば、アミノアラビノース）及び/又はホスホエタノールアミンなどの化学部分の付加は、最も一般的に観察された活性（ 図1）である。脂質修飾に関与する酵素の多くは、直接そのような二価の陽イオンのような環境シグナルによって活性化される、またはそれらの発現は二成分応答調節因子系3により調節される。 宿主自然免疫系による脂質A種の認識は、Toll様受容体4/myeloid分化因子2（TLR4/MD2）共受容体4により媒介される。 MD2および脂質のアシル鎖間、ならびにTLR4および脂質Aの1および4 &#39;リン酸基間の疎水性力は、リップの強い会合を促進TLR4/MD2 4,5にID Aに。自然免疫応答の認識と下流刺激アシル化状態や脂質の負電荷の影響TLR4/MD2ベースの脂質を変化させる改変は、NF-κBおよびそのようなTNFαおよびIL1-β6,7などの炎症のメディエーターを活性化剤。リピドAの負の電荷をマスキング修飾はまた、細胞表面3,8のグラム陰性への結合から殺菌カチオン性抗菌性ペプチドを防止する。多くのリピドA修飾は、ヒト宿主の内部または生態的地位のように、特定の環境条件下で細菌の適応度を高めることが仮定される。この理由のために多くの修飾酵素は、抗菌性化合物の合理的開発における魅力的な標的である。リピドA構造の化学的多様性は、生物および/または環境、およびこれらの多様な構造の生物学的意味に対してリピドAの構造的特徴のtにおいて重要な努力をする彼は、グラム陰性菌の研究。 全細菌からのリピドA分子の単離は、最終的な精製手順9-11、続いて細菌細胞表面からのLPSの抽出、リピドAを遊離させる加水分解工程を伴う。最も頻繁に引用されたLPS抽出手順は、第ウェストファールとジャン10によって導入され、熱フェノール水抽出法である。抽出後、全体LPSは、化学的にリピドA（ 図1）の遠位グルコサミン糖の6&#39;-ヒドロキシルからのKdoを分離軽度酸加水分解に供される。多数の落とし穴は、高い危険性試薬の使用を含む熱水フェノール手順のために共抽出された核酸およびタンパク質を分解する必要性が存在し、数日間は、プロトコル10を完了するために必要とされる。 最初CaroffとRaetz 12,13によって開発されたように私たちの研究室では、脂質Aの抽出および単離を開発しました。熱フェノール水手順と比較して、ここに提示した方法は、より迅速かつ効率的で、そして5mlから複数リットルの培養容量の広い範囲を収容する。また、ホットフェノール水抽出とは異なり、我々の方法は、リピドA種の最適な回復を提供する、LPSのラフや滑らかなタイプで選択されません。我々のプロトコルでは、全細菌細胞の化学的溶解は、LPSを遠心分離によりペレット化することができる、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物を用いて行われる。マイルド酸加水分解、溶媒抽出（ブライ - ダイアー）の組み合わせは、共有結合した多糖からリピドAを遊離するために使用される。ブライとダイアーのメソッドが最初に14組織が ​​、動物や植物の様々な脂質種の抽出に適用されるこの最終分離工程中の脂質Aから加水分解された多糖類を分離するために、ここで変更された、クロロホルム可溶性の脂質は、選択的に下層の有機に分配相。さらに、リピドAを精製するには、逆相又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーは、12を用いることができる。 全細胞由来の脂質A種の単離後、分析方法の数は、NMR、TLC及びMSベースの分析のような単離された物質の化学構造を特徴付けるために使用することができる。 NMRは非破壊構造解明を可能にし、グリコシド結合、アシル鎖位置の明確な割り当て、およびアミノアラビノースまたはホスホエタノールアミン15〜17のような脂質Aの変更のための結合部位の割り当てに関連した構造的な詳細を提供します。リピドAのNMR分析は、我々のプロトコル内で議論されていないが、別の場所15,16十分に記載されている。迅速な分析のためにTLCの方法が頻繁に使用され基づいているが、微細な化学構造に関する直接的な情報を提供することができない。 MSベースのプロトコルは、脂質A構造18,19を特徴付けるために最も頻繁に使用される方法である。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）-MSは、しばしば、最初に無傷のリピドA種を調査するために使用される。単一荷電イオンは、我々の分析物の抽出手順に従って調製から生成される。より細かい構造解析が必要とされるように、MS / MSベースの方法は、MALDI-MSのより多くの情報を証明する。単独で（ESI）をエレクトロスプレーイオン又は前駆イオンは、さらに構造的に有益な生成物イオンの18,20,21を生成するために、衝突誘起解離（CID）又は紫外光解離（UVPD）によって断片化された荷電脂質を乗算する結合されている。前駆体イオンを、脂質からニュートラルロス製品も頻繁に構造情報の追加レイヤを提供し、ESI-MSの間に生成される。 タンデム質量分析（MS / MS）は、リピドA構造の解明に不可欠で汎用性の高い方法であることが証明されている。 MS / MSの間に、イオンは、前駆イオンの構造を解明するために使用することができる診断フラグメンテーションパターンを生成するために活性化される。最も広くAVAilable MS / MS法は、CIDである。この方法は、解離を導くエネルギーの堆積をもたらす、不活性ガスをターゲットと選択された前駆イオンの衝突を介してフラグメントイオンを生成する。 CIDは細菌種22-33広範囲のリピドA構造の割り当てにおいて重要なツールであることが分かっている。 CIDは最も普遍的に実装され、MS / MS法であるが、生成物イオンの限定された配列を生成します。 193nmのUVPD代替相補MS / MS法である。この方法は、イオンを照射するレーザーを使用し、光子の吸収は、イオン解離及びその後の通電をもたらす。この高いエネルギーMS / MS技術は、CIDよりも生成物イオンのより多様なアレイを生成するため、より有益な断片化パターンを提供する。特に、UVPDはグリコシド、アミン、アシルおよびCC連動債で切断18,21,34に基づいてリピドA種の微妙な変化についての情報を与える。

<table><tbody><tr><td>クロロホルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C607</td><td>HPLC グレード</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452</td><td>HPLC グレード</td></tr><tr><td>テフロン FEP 遠心分離機ボトル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-562-21</td><td></td></tr><tr><td>シリカゲル 60 TLC プレート</td><td>EMD バイオサイエンス</td><td>5626-6</td><td></td></tr><tr><td>グレード番号 3MM クロマトグラフィー ペーパー</td><td>Whatman</td><td>3030700</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>質量分析計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoTip Nanospray ESIエミッター</td><td>New Obectives</td><td></td><td>&#8805; 30 &mu;目詰まりを減らすための</td></tr><tr><td>m モデル505パルス/遅延発生器</td><td>バークレー・ニュークレオニクス・コーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート サーモイル2200</td><td>バーンステッド/サーモリン</td><td>HPA2235MQ</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm GPI 15-415 ねじ式使い捨てホウケイ酸培養チューブ</td><td>コーニング パイレックス</td><td>99449-16X</td><td></td></tr><tr><td>再利用可能なねじ式PTFEスクリューキャップ GPI 45-415</td><td>コーニング</td><td>9999-152</td><td></td></tr><tr><td>パーソナル分子イメージャーシステム(フォスフォイルマイザー)</td><td>BioRad</td><td>170-9400</td><td></td></tr>オート<tr><td>ラジオグラフィーカセット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FBCS810</td><td></td></tr><tr><td>リンスクリーンSO230</td>コ<td>ダック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペプチド質量標準キット</td><td>シークアザイム</td><td>P2-3143-00</td><td></td></tr><tr><td>ソニファイアS250-A</td><td>ブランソン</td><td>101063196</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 12x32mmテーパーベースネジバイアル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C4000-V1</td><td></td></tr></tbody></table>

グラム陰性菌からの単離とリピドaの化学特性評価

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

リポ多糖（LPS）は、外膜二重層の外側リーフレット上に堆積されたグラム陰性菌の主要な細胞表面分子である。 LPSは、三つのドメインに細分することができる。遠位O-多糖、コアオリゴ糖、脂質および脂質からなるドメイン分子種および3 - デオキシ-D-マンノ - オクト-2 - ulosonic酸残基（のKdo）。リピドAドメインは、細菌細胞の生存に必須で唯一の成分である。その合成後、リピドAに化学的抗生物質化合物に対する耐性を促進するために、例えばpHまたは温度のような環境ストレスに応答して変更され、宿主自然免疫応答のメディエーターによる認識を回避する。以下のプロトコールは、グラム陰性細菌からのリピドAの小規模および大規模な単離を詳述する。単離された物質は、その後、化学的薄層クロマトグラフィー（TLC）または質量分析（MS）によって特徴付けられる。 fはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間に加えて、光（MALDI-TOF）MSは、我々はまた、衝突誘起解離（CID）に結合されたエレクトロスプレーイオン化（ESI）および新たに採用紫外光解離（UVPD）の方法を用いて脂質の分子種を分析するため、タンデムMSプロトコルを記載している。我々のMSプロトコルは、一意又は新規な化学修飾を含むリピドA分子の特徴付けに最も重要な、化学構造の明確な決定を可能にする。また、TLCによる分析のために細菌細胞からの脂質Aの放射性同位体標識、およびその後の単離を記載する。 MSベースのプロトコルに対して、TLCは、より経済的で迅速な特徴付け方法を提供するが、明確に知られている化学構造の基準を使用することなく、化学構造脂質を割り当てるために使用することができない。過去20年間の脂質Aの単離および特徴は、抗生物質抵抗のメカニズムをグラム陰性細菌の生理学の理解を改善している多数の刺激的な発見につながっているインダクタンス、人間の自然免疫応答、および抗菌性化合物の開発には多くの新しいターゲットを提供してきました。

Eの標準的な脂質Aおよび4 &#39;位- 大腸菌やサルモネラ菌血清型菌は、ヘキサ-アシル化1でのリン酸基とグルコサミンの二糖である。リッチメディア（ 例えばルリアブロス）での成長中にリピドAの部分は、 トリス -リン酸化された種は36（ 図1）を得た1位のピロリン酸基を含む。 KDO（3 -デオキシ-D- マンノ -オクツロソン酸）、6&#39;-ヒドロキシル基に結合しかつLPSの残りの糖質ドメイン（ すなわち 、コアのオリゴ糖とO-抗原ドメイン）にリピドAにリンクするためのブリッジとして機能する。グラム陰性細菌は、脂質のために保存された経路を共有するがE.と同様の合成大腸菌 K-12は、リピドA構造の多様性が多量存在する。この多様性は、環境刺激に応答して活性化される脂質構造を改変する潜在性酵素の作用から生じる。 exampのためS.のル、又はホスホエタノールアミン残基（ 図1;</s...

グラム陰性菌からのリポ多糖（LPS）のリピドAドメインの単離および特徴は、細胞表面の抗生物質耐性のベースのメ​​カニズム、細菌の生存やフィットネス、そしてどのように化学的に多様な脂質分子種が差ホスト自然免疫応答を調節への洞察を提供します。

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

本実験の全体的な目的は、グラム陰性細菌の外表面からリポ多糖を単離し、タンデムMSプロトコルを用いてそのリピドA部分の構造解析を行うことです。これは、細菌の細胞表面からリポ多糖を化学的に抽出した後、穏やかな酸加水分解を行うことで、リポ多糖の多糖部分からリピドAを遊離させることにより達成されます。第二のステップとして、リピドA溶液をエレクトロスプレーイオン化MSMSで分析します。本手順では、構造特性評価のために、衝突誘起解離または紫外線光解離に基づくMS/MSを用いてリピッドAを分析します。結果から、衝突誘起解離または紫外線光解離に基づくMS/MSプロトコルのいずれかで生成された質量スペクトルのフラグメンテーションパターンに違いがあり、UVPDの方がより詳細な情報を含むフラグメンテーションパターンが得られることが示されました。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、タンデム質量分析によって、診断的なフラグメンテーションパターンの解釈に基づいた標的分析物の解明が可能になることです。紫外線光解離（特にUVPD）は、衝突誘起解離などの既存の手法よりも多様なフラグメントイオンを生成する高エネルギーMS/MS法です。使用されるUVPD質量分析法はまだ商用化されていないため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。さらに、この手法では、カスタム改造によって質量分析計に統合されたレーザーを使用します。本手順を開始する前に、これらの準備を行ってください。250 mLの細菌培養液から細胞を回収し、4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離します。その後、培地の上清を捨て、細胞ペレットを50 mLの1×PBSで洗浄します。再び遠心分離して細胞をペレット化した後、上清を捨てます。次に、細胞を40 mLの1×PBSで再懸濁し、2本の250 mLテフロン製遠心チューブに分注します。単相の混合液とするため、各チューブに25 mLのクロロホルムと50 mLのメタノールを加えます。転倒混和し、室温で少なくとも20分間インキュベートします。細胞を完全に溶解させるため、混合液を室温で2000 ×g、20分間遠心分離し、上清を捨てます。LPSペレットを約100 mLの単相Blydire混合液で洗浄します。2000 ×gで20分間遠心分離し、上清を捨てます。LPSペレットに弱酸加水分解バッファーを27 µL加え、小さな粒子のみが残るまでピペッティングで混合し、プローブチップソニケーターを用いて均質に再懸濁させる。一定のデューティサイクルで、出力50%で20秒間ソニケーションを行う。サンプルのソニケーションを、1回20秒間、バースト間隔を約5秒として、計2回繰り返す。次に、サンプルをウォーターバスで30分間煮沸します。チューブをウォーターバスから取り出し、サンプルを室温まで冷却させます。加水分

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私たちは、グラム陰性菌からリポ多糖（LPS）を浄化するための変更されたホット水 -...

ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

このビデオでは、ミコール酸の薄層クロマトグラフィーベースの分離を実演しています。この手法は、マイコバクテリアの細胞壁に存在するさまざまなミコール酸(長鎖脂質)を、その極性に基づいて分離します。...

薄層クロマトグラフィーによるミコール酸バリアントの分離:極性に基づいてマイコバクテリア細胞壁脂質を分離する方法

細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。...

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

非イオン性界面活性剤相分割手法を用いた細菌のリポタンパク質の濃縮は、TLR の試金で直接使用したり、他のアプリケーションの説明します。詳細さらなるステップは、質量分析法による構造解析の N 末端トリプシン lipopeptides...

細菌のリポタンパク質と質量分析法による構造決定のための N 末端 Lipopeptides 準備の充実

この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。...

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

グラム陰性細菌は、2つの空間的に分離された膜を生成する。外膜は、内膜から、ペリプラズムとペプチドグリカン層によって分割される。これらの微生物の二重二重層を単離する能力は、その生理学と病因を理解するために重要であった。...

アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

広範囲のマイコバクテリアの細胞壁の総脂質含有量を抽出するプロトコルが提示される。さらに、異なる種類のマイコール酸の抽出および分析プロトコルが示されている。これらのマイコバクテリア化合物をモニタリングする薄層クロマトグラフィープロトコルも提供される。...

薄層クロマトグラフィーによるマイコバクテリアの脂質組成の解析

ラディカルベースの​​生体模倣化学、バイオマーカー開発のために必要な建物のアップライブラリに適用されています。...

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

DNAオリガミは、DNA分子の自己組織化をプログラムすることにより、精密なナノスケールの物体を製造するための強力な方法です。ここでは、DNAオリガミからの生体応答型ロボットのフォールディング、その精製、および透過型電子顕微鏡イメージング(TEM)のためのネガティブ染色のプロトコルについて説明します。...

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

ここに記載されているプロトコルは、修飾されたヌクレオシド三リン酸に至る複雑なルートのように数々の障害を説明し、要約するすることを目指しています。結果的に、このプロトコルは、これらの活性化ビルディングブロックの合成と実用化のための彼らの可用性の両方を容易にします。...

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

学ぶグラム陰性菌からLPSを単離し、タンデム質量分析でリピドAの構造を評価する手法。UV光解離法が衝突誘起解離より詳細な断片パターンを提供し、抗生物質耐性メカニズムの理解に貢献する。

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

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