グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

本実験の全体的な目的は、グラム陰性細菌の外表面からリポ多糖を単離し、タンデムMSプロトコルを用いてそのリピドA部分の構造解析を行うことです。これは、細菌の細胞表面からリポ多糖を化学的に抽出した後、穏やかな酸加水分解を行うことで、リポ多糖の多糖部分からリピドAを遊離させることにより達成されます。第二のステップとして、リピドA溶液をエレクトロスプレーイオン化MSMSで分析します。

本手順では、構造特性評価のために、衝突誘起解離または紫外線光解離に基づくMS/MSを用いてリピッドAを分析します。結果から、衝突誘起解離または紫外線光解離に基づくMS/MSプロトコルのいずれかで生成された質量スペクトルのフラグメンテーションパターンに違いがあり、UVPDの方がより詳細な情報を含むフラグメンテーションパターンが得られることが示されました。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、タンデム質量分析によって、診断的なフラグメンテーションパターンの解釈に基づいた標的分析物の解明が可能になることです。

紫外線光解離（特にUVPD）は、衝突誘起解離などの既存の手法よりも多様なフラグメントイオンを生成する高エネルギーMS/MS法です。使用されるUVPD質量分析法はまだ商用化されていないため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。さらに、この手法では、カスタム改造によって質量分析計に統合されたレーザーを使用します。本手順を開始する前に、これらの準備を行ってください。

250 mLの細菌培養液から細胞を回収し、4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離します。その後、培地の上清を捨て、細胞ペレットを50 mLの1×PBSで洗浄します。再び遠心分離して細胞をペレット化した後、上清を捨てます。

次に、細胞を40 mLの1×PBSで再懸濁し、2本の250 mLテフロン製遠心チューブに分注します。単相の混合液とするため、各チューブに25 mLのクロロホルムと50 mLのメタノールを加えます。転倒混和し、室温で少なくとも20分間インキュベートします。

細胞を完全に溶解させるため、混合液を室温で2000 ×g、20分間遠心分離し、上清を捨てます。LPSペレットを約100 mLの単相Blydire混合液で洗浄します。2000 ×gで20分間遠心分離し、上清を捨てます。

LPSペレットに弱酸加水分解バッファーを27 µL加え、小さな粒子のみが残るまでピペッティングで混合し、プローブチップソニケーターを用いて均質に再懸濁させる。一定のデューティサイクルで、出力50%で20秒間ソニケーションを行う。サンプルのソニケーションを、1回20秒間、バースト間隔を約5秒として、計2回繰り返す。

次に、サンプルをウォーターバスで30分間煮沸します。チューブをウォーターバスから取り出し、サンプルを室温まで冷却させます。加水分解後のlipid A抽出に進む前に、クロロホルム30 mLとメタノール30 mLを加え、転倒混和および遠心分離を行うことで、SDS溶液をクロロホルム・メタノール・弱酸加水分解緩衝液混合物の二相BLY直接混合液に変換します。

Sサンプルを2000 ×gで10分間遠心分離します。ガラスピペットを用いて、下層をきれいなテフロン製遠心チューブに抽出します。続いて、あらかじめ平衡化した二相系Bly Dire混合液の下層30 µLをサンプルチューブの上層に加え、転倒混和させた後、2000 ×gで10分間遠心分離して2回目の抽出を行います。ガラスピペットで下層を抽出し、先に抽出した下層と合わせて回収します。

あらかじめ平衡化したBlyDire上相を114 mL加え、回収した下相を洗浄して2相のBlyDire混合物を作成し、転倒混和して遠心分離します。ガラス製トランスファーピペットを用い、2000 ×gで10分間遠心分離してください。下相を清潔なガラス製エバポレーターフラスコに移し、回転蒸発法を用いてサンプルを乾燥させます。

次に、クロロホルム・メタノール混合液5 mLを回転フラスコに加え、少なくとも30秒間超音波バスで処理します。これにより、フラスコの壁面に付着したlipid Aの懸濁を促進します。ガラス製トランスファーピペットを用いて、脂質をPTFEライニング付きフェノール樹脂製スクリューキャップで密閉した清潔なガラスチューブに移します。

窒素乾燥機を用い、窒素気流下でサンプルを乾燥させます。乾燥した脂質を1 mLのクロロホルム・メタノール混合液で再懸濁します。溶媒を添加した後、混合液をボルテックスして完全に再懸濁させます。

小さなガラス製サンプルバイアルに移し、窒素乾燥機を用いて乾燥させます。乾燥させたサンプルは、後のTLCまたはMS分析まで-20 °Cで保存します。サンプルは次回の分析まで-20 °Cで保存することが可能です。

サンプルの調製が完了したら、空の小型ガラスサンプルバイアルにHPLCグレードのメタノール 200 µLとHPLCグレードのクロロフォーム 200 µLを混ぜ合わせます。このクロロフォーム・メタノール混合溶媒 200 µLをlipid Aの入ったバイアルに移し、バイアルの内容物を5分間、またはすべての物質が溶解するまで超音波処理します。次に、質量分析計をネガティブモードのエレクトロスプレーイオン化用に設定します。250 µLシリンジにlipid A溶液を満たします。

シリンジをシリンジポンプに装着し、希釈した脂質を直接注入します。サンプルの流量は 2.0 から 3.5 µL/min に設定してください。イオン光学系を調整することで、脂質イオン信号を最適化し、増強させます。

脂質のマススペクトルを収集します。種を単離し、MSMメソッドとしてCIDを選択して、標的となるlipid Aを活性化させます。次に、前駆体脂質が断片化されるまで、CID電圧または正規化衝突エネルギーを上昇させます。

最高強度のプロダクトイオンと比較して相対存在量が約10%の種について、十分なS/N比が得られるまでスペクトルを収集し平均化します。プロダクトイオンについては、前節の通りにサンプルと質量分析計を準備してください。質量分析計に接続されたレーザーをオンにします。

MSの詳細についてはテキストプロトコルを参照し、イオンがHCDセルに進入した際にエキシマレーザーがトリガーされるように装置ソフトウェアを設定してください。次に、2ミリ秒ごとにレーザーがパルス照射されるようにパルスジェネレーターをオンにします。MS/MSメソッドとしてHCDを選択し、衝突エネルギーを1%normalized collision energyに調整して、脂質前駆体イオンを単離します。レーザーエネルギーを上げ、レーザーパルス数（通常は6mJのパルスを10回）を調整することで、単離した脂質イオンを活性化させます。最後に、十分なS/N比が得られるまでスペクトルを取得し、平均化します。

UVPD生成イオンについて。E. coli K12株W3110由来のリピドAの陰イオンMALDI TOF質量スペクトルでは、質量電荷比1796.2の単一脱プロトン化種が主要な観察種として得られます。MALDI分析の詳細については、テキストプロトコル内で説明しています。

あるいは、同じ脂質サンプルをネガティブモードESIに供すると、主電荷比 898.1 で主に二価脱プロトン化脂質イオンが得られます。主電荷比 1796.20 の脱プロトン化脂質イオンも観察されますが、二価脱プロトン化種に比べて相対強度は低くなります。CIDまたは193ナノメートルのUVPDによるフラグメンテーションを、単価脱プロトン化脂質イオンに対して行いました。これらの手法を用いることで、特に脂質の化学構造をより正確に決定することが可能です。

複雑な修飾の組み合わせを持つ種、またはこれまで特性が明らかにされていなかった化学修飾を含む種。フラグメンテーションプロファイルは、切断部位を破線で示しており、提供された各構造の下にあるマスター電荷比の値と一致しています。赤字で強調表示されたマスター電荷比の値と切断部位は、UVPD 32 P標識脂質に関連する固有のプロダクトイオンを表しています。

2種類の異なるE. coli K12株から単離したLipid AをTLCで分析しました。この手順のプロトコルは、テキストプロトコル内に詳しく記載されています。K12株 W3110は主にビスおよびトリリン酸化Lipid Aを含んでいますが、³²P-Lipid Aを用いた場合はより複雑なTLCパターンが観察されます。

E. coli株WD 1 0 1から単離されたA。WD 1 0 1は脂質を産生する。これはラビノおよびホスホエタノールアミンによって高度に修飾されている。

1位および4'位のリン酸の両方が修飾可能であるため、WD 1 0 1由来のリピドAは、いずれか一方のリン酸に1つのelアミノアラビノースまたはホスホエタノールアミンのみを持つ「単一修飾」、あるいは両方のリン酸が組み合わせ的に修飾された「二重修飾」として記述できます。1位および4'位のリン酸への修飾に加えて、パルミチン酸の付加も観察されており、これにより本溶媒系におけるリピドA種のRf値が上昇します。本プロトコルは、リピドAの修飾がグラム陰性細菌の生物学にどのような影響を与えるかという構造活性相関をさらに探究するための道を、微生物学分野の研究者に独自に切り拓きました。

我々はまた、UVPDベースのMSを用いて、糖鎖、タンパク質、核酸、およびその他の複雑な脂質など、生物学的に重要な分子の構造を特性評価する能力に関心を持っており、それを実証してきました。有機溶媒、生物学的有害物質、およびレーザーの取り扱いは極めて危険であることに留意してください。溶媒は必ず換気設備のある化学薬品用ドラフトチャンバー内で扱うことが重要です。

手袋やゴーグルなどの適切な保護具を常に着用し、UVPDに使用するレーザーは適切に遮蔽してください。