遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコルキイロショウジョウバエ

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエに良性腫瘍と浸潤性腫瘍を誘発し、幼虫の頭蓋複合体を解剖してそれらを視覚化することです。これは、目的の系統間を設定し、浸潤性腫瘍または良性腫瘍のいずれかを持つ幼虫の子孫を分離することから始まります。次のステップは、選択した幼虫を解剖することです。

まず、頭蓋複合体を3分の2以上切り取り、固定し、次に裏返しにして露出させること。次に、脂肪体と腸の組織がきれいにされ、その後、腹側神経索と幼虫の表皮にまだ付着している神経も壊れます。最後のステップは、頭蓋複合体を画像化するか、ダウンストリームアプリケーション用に修正することです。

最終的には、蛍光顕微鏡法を使用して、GFPタグ付き浸潤性腫瘍または良性腫瘍を結果に示すことができます。この方法は、がん生物学における重要な疑問のいくつかに答えるのに役立ちます。たとえば、無傷の生物の腫瘍の進行を阻害する可能性のある遺伝子を理解することができます。

必要な遺伝ストックが得られたら、テスター株のスターター培養物を調製します。また、テストしたストックのスターター培養物を準備します。テスターストックから10人の女性バージンとテストされたストックから10人の男性を交配します。

ハエが摂氏25度で24〜48時間交尾して卵を産むのを待ってから、ハエを新鮮なバイアルに移して、より多くの子孫を生み出します。クロスバイアルで卵と最初の幼虫を監視します。新しい十字を設定します。

収集されたバイアルが卵の沈着不良を示している場合。採取したバイアルが乾燥し始めたら、オートクレーブ蒸留水を3〜4滴だけ加えて、培養物を湿らせます。さまようまでバイアルを監視し続けます。

3番目の幼虫がいます。次に、蛍光実体顕微鏡でそれらを監視します。同じ手順を使用して、培養5日目または6日目までにリストされたストックを使用して浸潤性腫瘍を有するハエを収集し、良性腫瘍培養物からさまよう第3の幼虫が利用可能になります。

ただし、浸潤性腫瘍培養から 10 日目まで利用できません。3番目の幼虫を収集するには、細かい絵筆を蒸留水で濡らし、バイアルの壁からこすり落とします。幼虫を冷たいXPBSのくぼみスライドに入れ、次に濡れたペイントブラシを使用します。

表皮から食品材料をこすり落とします。数分間固定するには、幼虫を摂氏マイナス20度で30分間プレートに置きます。固定化時間を長くするには、幼虫を培養バイアルに入れ、ワンドにフライナップだけ

培養バイアルを差し込み、40分間放置します。次に、固定化された幼虫をスライドガラスに移します。軽いハロー炭水化物オイルを一滴加え、幼虫をカバーガラスで覆います。

次に、蛍光実体顕微鏡で幼虫を観察します。GFP発現の場合は、緑色蛍光幼虫を選択し、解剖を進めます。良性の腫瘍を持つ幼虫は、頭側複合体が存在する前部で緑色に蛍光を発します。

浸潤性腫瘍は、頭蓋複合体の幼虫の前部でも緑色に蛍光を発します。可能であれば、蛍光を発する腫瘍を写真に記録してください。したがって、幼虫の半透明の表皮は、腫瘍の移動の程度を観察することを困難にしており、それが腫瘍を解剖しなければならない理由です。

鉗子を使用して、いずれかの腫瘍を持つ新鮮な幼虫を移植することから始めます。1ミリリットルの冷たいXPBSが入った解剖皿の井戸にタイプします。前端から約3分の2の距離で一対の鉗子を使用して幼虫を押さえます。

別の鉗子のペアを使用して、幼虫の後部3分の1をスマートに分離し、それを廃棄します。その後、前方の3分の2を離しました。幼虫の内部の圧力が解放されると、その内容物は体腔からにじみ出します。

鉗子を使用して、体腔からにじみ出た組織を取り除きます。次に、幼虫のマウスフックを握り、幼虫の表皮に押し込みます。他の一対の鉗子を使用して、幼虫を完全に反転させます。

次に、鉗子を使用して、脂肪体の唾液腺、腸、翼椎間板複合体、および気管チューブを優しく慎重に取り除きます。頭蓋複合体がマウスフックに取り付けられて見えるようになりました。脳半球とVNCは、VNCから発せられる神経を介して幼虫の表皮にまだ接続されています。

鉗子を使用して、これらの接続をそっと切断します。次に、余分な脂肪体やその他の組織を取り除き、頭側複合体がはっきりと見えるようにします。口のフックで幼虫の表皮に付着します。

頭蓋複合体は、視覚化する前にさらに処理するためにそのままにしておきます。それ以外の場合、頭側複合体を直接視覚化するには、頭側複合体を表皮から切り離し、ベクターシールドなどのグリセロールベースの封入剤の滴下に入れます。記載されたプロトコルを用いて、腫瘍を眼に誘導した。

アニン椎間板、良性腫瘍は、それらが誘発される眼のアニンディスクに局在したままでした。GFP標識組織は、腫瘍組織の10日目の幼虫の異常増殖から浸潤性腫瘍を有する橈側複合体の腹側神経索のような隣接する臓器に移動していないことに注意してください。また、赤い矢印で指摘されているように、腫瘍はVNCやマウスフックなどの隣接する臓器に浸潤していました。

このビデオを見た後、良性腫瘍と浸潤性腫瘍を遺伝的に誘導する方法を十分に理解し、頭蓋骨複合体の肛門内胃を解剖してそれらを視覚化する方法を理解できるはずです。