Name: 遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコルキイロショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ Drosophilaを用いた良性・浸潤性腫瘍の遺伝的誘導と頭部複合体の解剖可視化法。GFP標識による蛍光顕微鏡観察で腫瘍動態を解析し、がん生物学の理解に貢献する。

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私の研究室での研究はWKU研究財団RCAPは-Iは、生物学のスタートアップ資金のWKU省によってサポートされている＃11から8032を付与し、国民の協会の総合医科学研究所から親の許可によって資金を供給KBRINエリア助成金健康の賞番号5P20GM103436-13アンダー。私はまた、その実験室の私が最初に徐実験室で、この手法を確立し、この技術博士レイモンドPagliariniに導入された博士ティアン徐を承認したいと思います。

1。良性非浸潤性腫瘍の誘導<ol><li>良性腫瘍の誘導のために、表2にリストされている銘柄を使用してください。 </li><li>以下の遺伝子型の「テスター」の株式のためのスターター培養を準備します。浴槽-GAL80、FRT40A、Y、EY-FLP1、W Act5C&gt; Y +&gt;のGal4、UAS-GFP </li><li>以下の遺伝子型の「テスト」の株式のためのスターター培養を準備します。W; FRT40A、UAS-RasのV12 / CYO </li><li> 「テスト」在庫から「テスター」株式と10人の男性から10女性の処女を収集します。 </li><li>フライ食品とバイアルの両方を配置することで、「テスター」と「​​テスト」の在庫からオスとメスを渡ります。 </li><li> 25℃のインキュベーターにクロスを置き、男性と女性が交尾し、24〜48時間のために卵を産むことができます。 </li><li>十分な卵の堆積のためと第齢幼虫は文化が乾燥していないことを確認しての存在のためにバイアルをご確認ください。 <ol><li>オートクレーブ処理を数滴を追加します。（文化は乾燥されている場合）には湿った保つために培養液に蒸留水を。 </li><li>文化を監視し、必要に応じてステップ1.7.1を繰り返し続けています。 </li></ol></li><li>セクション3で概説したように、蛍光実体顕微鏡下に3齢幼虫をさまよう観察します。 </li></ol> 2。浸潤性腫瘍の誘発<ol><li> 浸潤性腫瘍の誘導のために、表2にリストされている銘柄を使用してください。 </li><li>以下の遺伝子型の上記のステップ1.2からスターターカルチャーを使用し、Y EY-FLP1、W、浴槽-GAL80、FRT40A; Act5C&gt; Y +&gt;のGal4、UAS-GFP </li><li> LGL 4、FRT40A、UAS-RasのV12 / CYO、W：以下の遺伝子型の「テスト」の株式のためのスターター培養液を準備します</li><li> 「テスト」在庫から「テスター」株式と10人の男性から10女性の処女を収集します。 </li><li>フライFとバイアル中で、それらの両方を配置することによって、「テスター」と「​​テスト」の在庫から男性と女性を渡るOOD。 </li><li> 25℃のインキュベーターにクロスを置き、男性と女性が交尾し、24〜48時間のために卵を産むことができます。 </li><li>十分な卵の堆積のためと第齢幼虫は文化が乾燥していないことを確認しての存在のためにバイアルをご確認ください。 <ol><li> （文化は乾燥されている場合）には湿った保つために培養するためにオートクレーブし、蒸留水を数滴を追加します。 </li><li>乾きのために文化の監視を続け、必要に応じてステップ2.7.1を繰り返します。 </li></ol></li><li>セクション3で概説したように、蛍光実体顕微鏡下に3齢幼虫を観察します。 </li></ol> 3。良性および浸潤性腫瘍の観察<ol><li>良性腫瘍の分離と可視化のための3齢幼虫を使用してください。 <ol><li>蒸留水にペイントブラシを濡らし、そしてこのペイントブラシを使用して培養バイアルの壁から数3齢幼虫をこすり。 </li><li> 1X PBSでうつ病スライドに幼虫を置き、ウェットペイントブラシスクラップを使用する幼虫表皮から任意の食品材料を切っメール。 </li><li>ペトリ皿に幼虫を置き、幼虫を固定化するために30分間-20℃の冷凍庫に出発。 <ol><li> FLYNAPを使用して幼虫を固定する別の方法。 </li><li> 3.1.3.2からバイアルにFLYNAPに浸しFLYNAPの杖を置き、幼虫を、バイアルのlet差し込まバイアルを接続した後に30から40分間放置。 </li></ol></li><li>カバーガラスで覆い、緑色蛍光タンパク質（GFP）を可視化する機能を備えた蛍光実体顕微鏡下で観察し、光ハロカーボン油の滴を追加し、スライドガラス上に固定化された幼虫を置きます。 </li><li>良性腫瘍を有する幼虫は頭部複合体が存在する前方領域に緑色の蛍光を発する。 </li></ol></li><li>浸潤性腫瘍の観察のため、上記のステップ＃2の培養セットから（誘導後）10日目の幼虫を選択します。浸潤性腫瘍を有する幼虫拡張リットルを持っているので、10日目に幼虫が選択される一般アルバルステージとpupariateに失敗します。 </li><li>代わりに3齢幼虫利用日10幼虫のを除いて3.1.4にステップ3.1.1に従ってください。 <ol><li> 10日目浸潤性腫瘍を有する幼虫は頭部複合体が存在する前方領域に緑色の蛍光を発する。 </li></ol></li><li>蛍光顕微鏡デジタルカメラが装備されている場合は、蛍光良性および浸潤性腫瘍を有する幼虫の写真を撮る。 </li></ol> 4。良性および浸潤性腫瘍の頭部のコンプレックスとさらなる観察の解剖幼虫の半透明の表皮が困難腫瘍の浸潤の程度を観察することができる。このように侵入の程度は良く幼虫から頭部の複雑な解剖により可視化されている。次の手順では、頭部の複合体を解剖するのに利用されるべきである。 <ol><li>湿ったペイントブラシを使用して（良性腫瘍のための）3齢幼虫を選択し、（浸潤性腫瘍の場合）10日目の幼虫Fそれぞれの培養バイアルをROMを</li><li>冷たい1X PBSを含む解剖皿の井戸に幼虫を置く。幼虫表皮から任意の食品の粒子を掻き取るペイントブラシを使用してください。 <ol><li>冷たい1X PBSを含む解剖皿の新鮮なウェルにきれいな幼虫を転送します。 </li><li>蛍光を検出することが可能な実体顕微鏡を用いて、GFP蛍光の有無を確認してください。幼虫を有する非GFPを捨てる。 </li></ol></li><li> （解剖プロトコルは腫瘍はこれらの2つのタイプのために同じまま）のどちらか良性または浸潤性腫瘍を有する幼虫を転送解剖皿に新鮮なウェルに冷たい1×PBSの1.0ミリリットルを追加し、ピンセットを使って。 </li><li>前端から3分の2程度ピンセットを使って幼虫を押したままにします。 <ol><li>鉗子の他のペアを使用し、スマートに幼虫の後部3分の1を分離し、それを廃棄します。 </li><li>幼虫の前方3分の2を手放す。幼虫内の圧力の内容が解放される幼虫は、体腔からにじみ出るう。 </li><li>腸、脂肪体、体腔外に染み出してきた幼虫の他の内側の内容を削除するためにピンセットを使用してください。 </li><li>幼虫の口フックを保持し、幼虫表皮にそれをプッシュするピンセットを使用し、完全に幼虫を反転鉗子の他のペアを使用。 </li><li>優しく、慎重に脂肪体、唾液腺、腸、翼ディスク複合体および任意の気管チューブを取り除くために鉗子を使用してください。頭部複合体は、現在、反転幼虫の口フックに取り付ける表示されるはずです。脳半球と腹側神経索（VNC）はまだ、VNCから発せられる神経を通して幼虫表皮に接続される。 </li><li>優しく頭部神経と幼虫の表皮との間の接続を破るためにピンセットを使用してください。 </li><li> VNCと幼虫表皮の間の神経接続が切断さと余分な脂肪本体やその他の組織が除去されると、頭部COmplexがはっきり見えるようになりだろうと口だけのフックで幼虫表皮に添付されます。 </li><li>複合体は、抗体染色のようなダウンストリームアプリケーションのため以降の視覚化のために固定される必要がある場合、頭部複合体は、幼虫の表皮に装着しておくことができます。 </li><li>それ以上のダウンストリームのアプリケーションが実行されないであろう場合には、頭部の複合体は、幼虫の表皮から分離し、さらに、観察および分析のためのメディアのマウントベースグリセロールの低下に配置することができます。封入剤としてVECTASHIELDを使用してください。 </li></ol></li></ol>

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私は、開示することは何もありません。

癌は過去に比べてはるかに優れた理解、今日と複雑な疾患である。しかし、まだ多くを学んだし、我々は根本的なメカニズムの全体像を持って前に説明される必要がある。ここで紹介する単純なプロトコルは、遺伝的、生物全体に良性および浸潤性腫瘍を誘発し、このモデルでは腫瘍の進行に関連した生物学を研究することが可能となる。 ショウジョウバエにおける既存の技術および他の生物のほとんどは、腫瘍形成および転移または成体宿主23-27に原発腫瘍組織の移植を使用するシステムを理解するために、細胞培養ベースのシステムを利用してのいずれか。セルベースおよび移植技術の両方が彼らの限界がある。例えば、移植技術は面倒で時間がかかり、宿主に非腫瘍組織の移植をもたらす可能性がある。これは実験的な成果物の生成をもたらす可能性があります。さらに、細胞カルトUREベースのシステムは、生物全体に存在し、実環境の単なる近似値である。この制限は、それが難しい腫瘍の進行および転移34において重要な役割を果たしている非常に重要な腫瘍微小環境との相互作用を模倣することができる。ここに記載した技術は、正常ショウジョウバエ...

転移性の状態に良性の腫瘍の進行は、本体8に存在する防御機構の回避することを特徴とする段階的なプロセスです。例えば、体内の腫瘍細胞は、アポトーシスや免疫システムを回避する基底膜と呼ばれる特殊な細胞外マトリックス（ECM）を突破し、周囲の細胞8が課す社会的コントロールを克服できなければなりません。これは、がん細胞が転移と呼ばれるプロセスでの遠隔部位に移行し、コロニーを形成する能力を獲得という段階的進行を介して行われます。腫瘍細胞は、体によって課さ障壁を克服する方法についての我々の理解は、しかし、研究から出てくる写真は、癌細胞による正常な発生過程およびシグナル伝達経路の繰り返し使用11月13日にこれまでのポイントを行って、まだ始まったばかりである。 フルーツ飛ぶキイロショウジョウバエは、私たちのウントに途方もなく貢献してきました過去数十年の14〜17にわたって開発、洗練された遺伝学的技術を用いて正常な発達と病気のerstanding。我々は、様々な癌遺伝子および癌抑制遺伝子18〜22歳のより良い理解に到達した突然変異誘発および過剰発現のツールを使用して。しかしながら、腫瘍転移は、細胞培養モデル23,24ならびに種々の異種移植モデル25-27主に研究されているいくつかの遺伝子病変間の協力の結果である。それらは完全に生体に見られる条件を模倣しないように、これらのモデルは、強力なしかし、それらの限界がある。さらに、マウスでの利用可能なトランスジェニックモデルが面倒で、侵襲性行動28,29の遺伝子解析に資するものではない。いくつかの研究は、ショウジョウバエ 30,31における腫瘍細胞の浸潤を理解しようと試みてきた。これらの技術は、主にホストに原発性腫瘍の移植を利用して、TRAの追跡に依存している隣接組織32,33の侵入のために腫瘍をnsplanted。 MARCM 10と呼ばれる強力な技術は、ショウジョウバエ 9に腫瘍の浸潤をモデル化するためにPagliariniと徐により適応されました。腫瘍の浸潤のエレガントな遺伝的モデル化は、活性化癌遺伝子や細胞極性の喪失との連携を悪用。このモデル化のパワーは浸潤性腫瘍は、したがって組織の移植のための必要性を回避無傷の生物に作成されるという事実にある。発癌の協力をもたらすために、RasのV12のような活性化癌遺伝子は、幼虫の目を触角にある細胞のクローンで表されます。 MARCM技術の結果、これらのクローンはまた、簡単に視覚化のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）が付いていますし、細胞極性の走り書き致死巨大な幼虫のような変異体、および大規模なディスクのためにホモ接合作られています。結果がで浸潤性の腫瘍を、GFPをタグ付けされている頭部複雑。本報告では、私誘導し、無傷の幼虫のコンテキストでかつ摘出頭部複合体の両方で、これらの浸潤性腫瘍を可視化する方法を示します。ここで紹介する腫瘍誘導はショウジョウバエの第二の染色体上の試薬 ​​を利用しています。 表2には、私は同じ目的のために利用することができ、Xおよび第 3染色体上の株式のリストを提供する。私はこの単純化されたプロトコルは、腫瘍の進行の分子基盤を理解することに興味を持って研究者にこの技術は容易にアクセスできるようにと考えています。

<table><tbody><tr><td>10X PBS(リン酸緩衝生理食塩水) pH 7.2 ストック溶液</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chilled 1X PBS pH7.2 ワーキングソリューション</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td>新鮮で冷蔵し、1週間まで使用できます</td></tr><tr><td>Flynap</td><td>Carolina Biologicals</td><td></td><td>幼虫の麻酔に必要なハエ</td></tr>麻酔 <tr><td>固定剤</td><td>0.1M PIPES、pH 7.2、4% パラホルムアルデヒド</td><td></td><td>解剖された頭蓋複合体を固定するために必要でした</td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>いくつかの</td><td></td><td>氷の上の解決策を維持します。また、冷却した1X PBSで頭蓋複合体を解剖し、次にエッペンドルフチューブ</td></tr><tr><td>1.7mlエッペンドルフチューブ</td><td>のさまざまな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス、カバーガラス</td>、<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド封入剤、またはその他の封入剤</td>、<td>ベクターラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、ハロカーボン200または700オイル</td><td>ポリサイエンス社または Halocarbon.com</td><td></td><td>Halocarbon 200は蛍光立体鏡の視覚化のための幼虫を取付けるのに使用されています</td></tr><tr><td>サリー・ハンセン「ハード・アズ・ネイルズ」 マニキュア</td> 任意の<td>雑貨店</td><td></td>で見つけることができます <td>カバースリップの端をシールするために必要</td></tr><tr><td>ライカMZ16.5蛍光ステレオ顕微鏡または任意の他の蛍光性実体顕微鏡</td><td>ライカと他の</td><td></td> 幼虫デュモン#5鉗子<td>のGFP蛍光を観察するために必要</td></tr><tr><td></td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パイレックス9ウェルスポットプレートまたはその他の解剖皿</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td>一般商品店</td><td></td><td></td></tr><tr>で見つけることができます<td colspan="4">表 1. この記事で紹介した実験プロトコルを実行するために必要な材料。</td></tr></tbody></table>

遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

ショウジョウバエは、過去数十年の間、通常の開発や病気の遺伝的基礎の理解を照らしており、今日では、複雑な疾患1-7の我々の理解に非常に貢献し続けています。転移性の状態に良性の腫瘍の進行は、複雑なイベント8で、私たちはより良いこの病気9の遺伝的基礎を理解するために、ショウジョウバエでモデル化されています。ここで私は、遺伝的に誘導し、観察した後、 ショウジョウバエの幼虫の腫瘍の進行を分析するための単純なプロトコルを提示する。腫瘍誘発技術はMARCMシステム10に基づいており、活性化癌遺伝子、RasのV12及び細胞極性遺伝子の損失（ 落書き 、 ディスク大きく 、 致死巨大幼虫 ）浸潤性腫瘍9を生成する間の連携を利用している。私は、これらの腫瘍は完全な幼虫で可視化することができる方法を紹介し、次に、どのようにこれらは、さらなる分析のために切開することができます。ここで紹介する単純化したプロトコルにより、この技術は腫瘍の浸潤における遺伝子の役割を理解することに興味の研究者によって利用されるのを確認する必要があります。

プロトコルの結果がここに提示され、ユーザは、幼虫の目触角成虫盤で活性化癌遺伝子を過剰発現させることにより、良性腫瘍を誘発することができます。ユーザはまた、細胞極性遺伝子にも変異細胞のクローンで活性化癌遺伝子を過剰発現させることによって眼触角で浸潤性腫瘍を誘発することができるであろう。腫瘍は簡単に全体の幼虫や幼虫の体腔（ 図1）の摘出された頭部の複合体では「緑色蛍光」は、組織としての蛍光実体顕微鏡の助けを借りて可視化することができた。浸潤性腫瘍は、腫瘍や、VNCや他の隣接する臓器へのGFP陽性浸潤性腫瘍のその後の移行の大規模な異常増殖をもたらすのに対し、良性腫瘍は、GFP陽性細胞のクローンとして眼の触角複合体にローカライズされます。 （浸潤性腫瘍の遺伝子型から派生した）&gt; 10日齢の幼虫GFP陽性着脱二次腫瘍ではfloa幼虫の体腔内ティンも観察することができる。良性腫瘍を有する幼虫が時間通りにpupariateながらさらに、浸潤性腫瘍を有するものは、拡張された幼虫の期間があり、pupariateに失敗します。これらの侵襲性の腫瘍を有する幼虫を容易流体封入体腔有する「巨大幼虫」として観察することができ...

RAS V12と走り書き 、腫瘍細胞はまた、侵襲性の挙動を表示するショウジョウバエにおける腫瘍増殖をもたらす様細胞極性遺伝子の突然変異のような活性化癌遺伝子間の協力。ここに良性および浸潤性腫瘍の誘導および観察のための単純なプロトコルが提示される。

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

本手順の目的は、ショウジョウバエにおいて良性および浸潤性の腫瘍を誘導し、幼虫の頭部複合体を解剖することでそれらを可視化することです。まず、目的の系統間で交配を行い、浸潤性または良性の腫瘍を持つ幼虫の子孫を分離します。次のステップとして、選択した幼虫の解剖を行います。まず、頭部複合体（cephalic complex）を3分の2まで切断して固定し、裏返すことで露出させます。次に、脂肪体および腸組織を除去し、腹側神経索に依然として付着している神経および幼虫の表皮を破断させます。最後のステップとして、頭部複合体をイメージングするか、後続のアプリケーションのために固定します。最終的に、蛍光顕微鏡を用いることで、GFPでタグ付けされた浸潤性腫瘍または良性腫瘍を観察することができます。この手法は、がん生物学におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、個体内で腫瘍の進行を抑制し得る遺伝子がどれであるかを解明したい場合に有効です。必要な遺伝子ストックを入手したら、テスター系統のスターター培養液を調製します。同様に、テスト対象ストックのスターター培養液も調製します。テスターストックから10匹の処女雌と、テスト対象ストックから10匹の雄を交配させます。25 °Cで24〜48時間、ハエに交配および産卵させ、その後、さらなる子孫を得るために新しいバイアルに移します。交配バイアル内の卵および1齢幼虫を確認してください。その後、新しい交配をセットアップします。回収したバイアルの産卵状況が悪い場合、またはバイアルが乾燥し始めた場合は、オートクレーブ滅菌蒸留水を3〜4滴のみ加え、培養状態を湿潤に保ってください。徘徊が始まるまでバイアルの観察を続けてください。3齢幼虫が現れます。その後、蛍光実体顕微鏡下でモニタリングを行います。同様の手順を用い、記載したストックを使用して培養5日目または6日目までに浸潤性腫瘍を持つ成虫を回収します。また、良性腫瘍の培養からは、徘徊期の3齢幼虫が得られます。しかしながら、浸潤腫瘍培養物からそれらが利用可能になるのは10日目までです。3齢幼虫を回収するには、細い絵筆を蒸留水で濡らし、バイアルの壁面からかき出します。幼虫を冷やした1×PBSが入ったディプレッションスライドに移動させ、次に濡れた絵筆を使用してください。表皮から餌の残渣を掻き出します。数分間の不動化を行う場合は、幼虫を-20 °Cのプレートに30分間置きます。より長い時間不動化させる場合は、ワンドに付けたフライナップのみが入った培養バイアルに幼虫を入れます。培養バイアルに栓をし、40分間静置します。次に、固定化した幼虫をガラススライドに移動させます。ライトハロカーボンオイルを1滴加え、カバーガラスで幼虫を覆います。次に、蛍光ステレオ顕微鏡下で幼虫を観察します。GFP発現を確認し、緑色蛍光を発する幼虫を選択して解剖に進みます。良性腫瘍を有する幼虫は、頭部複合体が存在する前方領域で緑色に蛍光します。浸潤性腫瘍は、幼魚の頭部複合体を含む前方も緑色に蛍光を発します。可能であれば、蛍光を発している腫瘍を必ず写真で記録してください。幼魚の表皮は透明であるため、腫瘍の移行範囲を観察することが困難であり、そのため腫瘍を解剖する必要があります。ピンセットを使用して、いずれかの腫瘍を持つ新鮮な幼虫を、1 mLの冷えた1x PBSが入った解剖皿のウェルに移動させます。前端から約3分の2の距離でピンセットを用いて幼虫を固定します。別のピンセットを用いて、幼虫の後方3分の1を慎重に切り離して廃棄します。次に、前方3分の2を離します。幼虫内部の圧力が解放されると、内容物が体腔から流出してきます。ピンセットを使用して、体腔から漏れ出した組織を取り除きます。次に、幼虫の口鉤を保持し、幼虫の表皮へと押し込みます。もう一方のピンセットを使用して、幼虫を完全に反転させます。次にピンセットを用いて、脂肪体、唾液腺、腸、翅原基複合体、および気管を慎重に、ゆっくりと除去します。この時点で、口鉤に付着した頭部複合体が見えるはずです。脳半球とVNCは、VNCから伸びる神経を介して、依然として幼虫の外皮に接続しています。ピンセットを用いて、これらの接続部を慎重に切り離します。次に、頭部複合体が明確に見えるように、余分な脂肪体やその他の組織を除去します。これは口鉤部位で幼虫の外皮に付着しています。可視化前のさらなる処理を行う場合は、頭部複合体はそのままにしておきます。頭部複合体を直接可視化する場合は、表皮から分離し、Vector Shieldなどのグリセロールベースのマウント剤の一滴の中に配置します。上述のプロトコルを用いて、眼に腫瘍を誘発させました。視神経乳頭において、良性腫瘍は誘導された視神経乳頭内に局在したままであった。GFPで標識された組織が、腹側神経索などの隣接する器官に移行していないことに注目された。一方、腫瘍に浸潤能を持たせた10日齢の幼虫では、腫瘍組織の過剰増殖が認められた。また、赤色の矢印で示されているように、腫瘍がVNCや口鉤などの隣接器官に浸潤していた。このビデオを視聴することで、良性と浸潤性の腫瘍を遺伝的に誘導する方法と、その後、intra ano gastroにおいて頭部複合体を解剖してそれらを可視化する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコル

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