Name: 設立インビトロシステムの細胞内挙動を研究するために、カンジダ·グラブラタ人間のTHP-1マクロファージにおける (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶCandida glabrataとTHP-1マクロファージの相互作用を解析するin vitroモデル構築法。PMA処理による細胞分化と細胞内挙動評価により、真菌病原性メカニズムの理解に貢献します。

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この作品は、DNAフィンガープリントおよび診断のためのバイオテクノロジー本部、インド政府とセンターのコア·ファンドからの革新的な若手生物工学研究者賞BT/BI/12/040/2005とBT/PR13289/BRB/10/745/2009助成金によって支えられて、ハイデラバード。 MNR GBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けた科学産業研究評議会のジュニアとシニアリサーチフェローの受信者です。 SBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けたバイオテクノロジー本部のジュニアとシニアリサーチフェローシップ受賞。

これは、Cを実行することをお勧めしますバイオセーフティ封じ込めレベル2（BSL-2）との実験室でグラブラタ感染実験。 <ol><li> THP-1マクロファージ単層の調製。 </li><li> Cの準備グラブラタ細胞懸濁液。 </li><li> CとTHP-1マクロファージの感染グラブラタ細胞。 </li><li>コロニー形成単位アッセイによって貪食率および細胞内複製を測定する。 </li><li>共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて細胞内複製のモニタリング。 </li></ol> 1。 THP-1マクロファージ単層の調製<ol><li> THP-1は急性単球性白血病を患っている14 1歳の男児の末梢血由来のヒト単球細胞株である。 THP-1懸濁細胞株は、日常的に、10％FBS（ウシ胎児血清）を補充したRPMI-1640培養培地中、加湿5％CO 2中37℃で維持する。ホルボール12 - myristaによる治療テ13 - アセテート（PMA、ホルボールエステル）がマクロファージにTHP-1単球細胞の最終分化をもたらす。重要なことに、PMA処理は細胞生存率に影響を与えず、分化した細胞は分裂しない。 </li><li>シードRPMI-1640完全培地中で100mmの培養皿中約1.5×10 6個のTHP-1単球（10％血清、2mMグルタミンおよび1×抗生物質を補充したRPMI-1640培地、10ミリリットル/ディッシュ）細胞を、37℃で増殖およびlet 2日間、5％CO 2でCが°。 </li><li> THP-1細胞を8×10 5細胞/ mlの密度に達した後、細胞培養層流フードに培養皿に移し、穏やかに沈降した細胞を再懸濁するためにそれを旋回させる。 </li><li>細胞懸濁液をピペットで、4分間1,000 rpmで（130×g）で15ミリリットル滅菌チューブと遠心分離機に入れる。上澄み液を捨て、5ミリリットルの新鮮な、予め温め、RPMI-1640完全培地中のTHP-1細胞ペレットを一時停止。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を列挙し、セル画を希釈予め加温したRPMI-1640完全培地で10 6細胞/ mlの最終濃度までリットルの懸濁液</li><li> （ホル12 - ミリステート13 - アセテート溶液は、ジメチルスルホキシドで製造）10ミリリットルのTHP-1細胞懸濁液（最終濃度16 nM）を160 mMのPMAストックを1μLを加え、よく混ぜる。 24ウェル組織培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを分配し、12時間、5％CO 2、37℃で維持したインキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>古いメディアを削除するには、1ミリリットルのRPMI-1640完全培地を予め暖め追加し、細胞を5％CO 2中37℃で12時間かけて回復することができます。 </li><li>懸濁液中のその楕円形のTHP-1単球細胞は平らに、紡錘型、付着マクロファージに分化したことを確認するために倒立顕微鏡下で細胞を観察します。これらの分化した細胞は、現在で調査を行って準備ができているグラブラタ感染実験。 </li></ol> 2。 Cの準備グラブラタ ＆＃160;細胞懸濁液 C.グラブラタ野生型株のBG2は、THP-1マクロファージを感染させるために使用される。C.グラブラタ細胞は、液体YPD（酵母エキス（1％）、ペプトン（2％）、デキストロース（2％））培地中で日常的に培養される。固形YPD培地は、オートクレーブ処理前に培地、2％寒天を添加することにより調製される。 <ol><li> Cの文化を準備するにはグラブラタ 、滅菌された使い捨ての耳で寒天プレートからシングルコロニーを上にピックアップし、10ミリリットルにYPD液体培地に接種し、30℃で（200回転）しながら14〜16時間インキュベート</li><li>テーブルトップマイクロ遠心で5分間4,000 rpmで（1,800×g）で遠心この培養物（1ml）を、滅菌PBS（リン酸緩衝食塩水、pH 7.4）で3回細胞を洗浄し、1mlのPBS中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> C.のOD 600を測定しますグラブラタ細胞懸濁液を2×10 6細胞/ mlの密度を得るために、滅菌PBSの適切な容量で希釈した（OD 600= 0.1）。あるいは、所望の細胞密度を、血球計数器を用いて酵母細胞を計数することによって達成することができる。 </li></ol> 3。 CとTHP-1マクロファージの感染グラブラタ細胞<ol><li> 50μLCを追加0.1のMOI（感染多重度）を取得し、5％CO 2、37℃でプレートをインキュベートするTHP-1マクロファージ（24ウェル培養プレートのウェルに播種10 6細胞）にグラブラタ細胞懸濁液。 </li><li>実行可能な酵母数を決定するために、50μlの温度を希釈グラブラタ細胞懸濁液を滅菌PBS中で100倍にYPD固体培地上に100μlをプレート。 30℃で培養すると、手動で1〜2日後に現れる酵母コロニーの数を数える。これらの数は、今後、0時間のC.として呼ばれるグラブラタのCFU（コロニー形成単位）。 </li><li> CとTHP-1細胞の2時間の共培養の後24ウェル組織培養プレートを反転させることにより細胞グラブラタ 、廃棄培地iを貯水池Naおよびnonphagocytosed細胞外Cを削除するに予熱無菌PBSで3回優しく洗うグラブラタ細胞。 PBSで穏やかな洗浄は、THP-1マクロファージ単層に損傷を引き起こすことなく、全ての細胞外酵母の完全な除去を達成するために必要不可欠である。 </li></ol> 4。コロニー形成単位アッセイを経由して貪食率と細胞内複製の測定<ol><li>溶解温度 1ml中グラブラタ感染THP-1マクロファージ2分間の滅菌H 2 O、ならびにマクロファージから破片を除去し、微量遠心管中で細胞溶解物を収集するために穏やかにこすり。完全なマクロファージ溶解の微視的な検証は、すべての内部化酵母の回復のために極めて重要である。 </li><li>滅菌PBS中の溶解液の100倍希釈液を調製、YPD固体培地上に100μlをプレートに30℃で培養する</li><li> 1-2日後、手動C.数を数えるそのAP グラブラタコロニーYPD培地にしまっ、希釈倍率（2時間のCFU）で乗算し、Cのパーセントを指す貪食率を計算する以下の式を用いて2時間の同時インキュベーションの後にTHP-1マクロファージによって摂取されるグラブラタ細胞。 ％の貪食= [（2時間でのCFU）/（0時間でのCFU）]×100 </li><li> C.の細胞内複製の速度を測定するためにTHP-1マクロファージにおけるグラブラタ細胞が、ポイントは、感染、すなわちポスト異なる時間に、細胞内の酵母を収集します。 4、6、8、10、12、および24時間、3.3から4.3の手順を繰り返すこと。 </li><li> Cの倍生存/複製を計算する2時間（貪食酵母）におけるそれらと任意の所与の時点での合計のCFUを分割することによりTHP-1マクロファージにおける細胞グラブラタ 。 </li></ol> 5。共焦点ラスを使用して、細胞内複製を監視するER走査顕微鏡<ol><li>第1節に記載の手順に従って、2つの4ウェルチャンバースライドの各ウェル内のPMA処理した5×10 5 THP-1細胞を播種し、12時間、5％CO 2、37℃でインキュベートする。 </li><li>あらかじめ温めておいたRPMI-1640完全培地で古い培地を交換し、細胞は12時間、PMA処理から回復することができます。 </li><li>調製GFP（緑色蛍光タンパク質）タグ付きC.グラブラタ細胞懸濁液2章で説明され、1のMOIのTHP-1マクロファージに感染するように。 C.もしGFPを発現するグラブラタ株が利用できない、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）で標識された酵母細胞は、感染を転記すなわち初期の事象を監視するために使用することができる。 2時間で貪食率およびファゴリソソーム成熟。 </li><li> 5％CO 2、37℃で2時間スライドをインキュベート培地を廃棄し、滅菌で3回洗浄するために注意深く反転し、PBSで予め温め。 </li><li> RPMI-1640完全MEDIを予め温め500μLを追加UM 1スライドの各チャンバーにし、22時間、5％CO 2、37℃で静置する。 </li><li> 2時間Cを修正するにはグラブラタ感染THP-1マクロファージは、他のスライドの各チャンバーに（PBS中で調製）3.7％ホルムアルデヒドを500μlを加え、暗所で20分間室温で静置する。 </li><li>洗浄は、PBSで3回スライドさせ、500μlのトリトン-X（0.7％）を添加し、暗所で5分間室温でインキュベートする。 </li><li> PBSで洗浄スライド3X、暗闇の中で3〜5分間乾かし培養スライドや空気から容器を外します。 </li><li>注意深くスライド回避気泡形成にDAPI（4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール）を含むベクタシールド封入剤を用いてカバースリップをマウント。優しくキムワイプで過剰な液体を除去し、マニキュアでカバースリップの端をシールします。使用するまで4℃の暗所に保管してスライド。 </li><li>繰り返しますTHP-1細胞24時間後に感染を処理するために5.4および5.6から5.9を繰り返します。 </li><li>レーザ走査confoを用いて画像セルCAL顕微鏡（60X油浸対物レンズ、DAPI及びGFP染色のための405 nmおよび488 nmで励起、それぞれ）。 </li></ol>

<ol><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis%3A+a+Persistent+Public+Health+Problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+the+ARTEMIS+DISK+global+antifungal+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).</li>
<li>Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+opportunistic+fungal+infections+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Overview of opportunistic fungal infections in India.</a> Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).</li>
<li>Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+by+any+other+name%3A+Candida+glabrata+and+its+interaction+with+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).</li>
<li>Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata%2C+Candida+parapsilosis+and+Candida+tropicalis%3A+biology%2C+epidemiology%2C+pathogenicity+and+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).</li>
<li>Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+glycosylphosphatidylinositol-linked+aspartyl+proteases+is+required+for+virulence+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).</li>
<li>Seider, K., Brunke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).</li>
<li>Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+Candida+glabrata-macrophage+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction.</a> PLoS Pathog. 8 (8), e1002863(2012).</li>
<li>Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+Candida+glabrata+survival+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis.</a> Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).</li>
<li>Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+THP-1+Cells%3A+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li>
<li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line%2C+THP-1%2C+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li>
<li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li>
<li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+leukemia+cell+line%2C+THP-1%3A+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

自然免疫系は、日和見真菌感染症の制御に重要な役割を果たしている。マクロファージは、摂取および真菌病原体の破壊によって防衛を抗真菌に貢献。このように、生存および/またはマクロファージの抗菌機能に対抗するために必要な要因の解明は、真菌の病原性戦略の我々の理解を進める。この文脈において、我々は、ヒトの日和見真菌病原C.の相互作用を特徴づけるために、ヒト単球細胞株THP-1由来マクロファージを用いたin vitro細胞培養モデル系を確立したホスト貪食細胞とグラブラタ 。このTHP-1マクロファージモデル系が正常C.を同定するために使用されてきたが全身性カンジダ症8のマウスモデルにおいて弱毒化した病原性を表示された縮小生存とグラブラタ変異体は、このシステムの妥当な制限は、その孤立したコンテキストで、このようにして、得られた結果ではないかもしれない常に複雑な哺乳動物宿主の免疫系にも適用できる。また、このシステムは、生細胞イメージング方法とは異なり、どちらTHP1マクロファージによって取り込ままたは食作用の間に殺されていな...

カンジダ種は、免疫不全患者の生命を脅かす侵襲性真菌感染症の1の主要な原因である。 カンジダ·グラブラタ 、新興院内病原体は、地理的な位置1-3に応じて、集中治療室の患者からの第二または第三の最も頻繁に孤立したカンジダ種である。系統発生的に、C.グラブラタ 、半数体出芽酵母、より密接に病原性カンジダ属に比べcerevisiaeの非病原性のモデル酵母サッカロミセスに関連しています。Cを含むカンス 4。これと一致して、C.グラブラタ交配 、分泌されたタンパク質分解活性及び形態学的可塑性4-5を含むいくつかの重要な真菌の病原性の特徴を欠いている。 C.もののグラブラタが菌糸を形成しない、それが生き残るためには、6〜8は、それが独特の病因メカニズムを開発したことを示唆しているマウスおよびヒトのマクロファージ内で複製することができます。限られた情報は、C.戦略について提供されていますグラブラタは、栄養の乏しい細胞内マクロファージ環境を生き残るためには、酸化および5宿主免疫細胞によって取り付けられた非酸化宿主応答に対抗するために採用しています。関連マクロファージモデル系は、Cの相互作用を描写する前提条件である機能的ゲノムおよびプロテオミクスのアプローチを介してホスト貪食細胞とグラブラタ 。末梢血単核細胞（PBMC）及びヒトおよびマウス由来の骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は、それぞれ、以前のC.の相互作用を研究するために使用されている宿主免疫細胞7,9とグラブラタ 。しかし、PBMCおよびBMDMsを得ることが困難、その限られた寿命と異なる哺乳動物ドナー間本質的な変化は、これらの細胞の活用など多彩なモデルシステムを制限します。 ここでは、intracellulを研究するためのin vitro系の確立のための方法を説明しますCの ARの挙動ヒト単球細胞株THP-1由来マクロファージにおける細胞グラブラタ 。このプロトコルの全体的な目標は、簡単にホスト真菌病原体の相互作用の様々な側面を研究するために操作することができる、簡単で、安価、迅速、かつ再現性の細胞培養モデル系を制定することでした。 THP-1細胞は、以前は、細菌、ウイルス、および真菌10-12を含む広範囲の病原体に対する宿主免疫応答を解読するために使用されている。単球THP-1細胞を維持するのに容易であり、ヒトの単球由来のマクロファージを模倣し、適切なマクロファージマーカー13を発現するマクロファージ、ホルボールエステル治療の際に、区別することができる。 THP-1マクロファージモデル系の主な利点は、使いやすさと洗練された機器の必要がないことである。 ここで紹介するプロトコルは、HOSで、他の人間の真菌病原体の相互作用を研究する容易に適応される免疫細胞をトン。現在の手順はまた、ハイスループット変異スクリーニングを使用して、関心対象の病原体の病原性因子を同定するために用いることができる。この概念実証は、ヒトマクロファージ8にC.グラブラタの生存のために必要とされる56遺伝子のセットを同定するために、THP-1培養モデルシステムの使用の成功により例示した。

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB 202</td><td>ヒト急性単球性白血病細胞株</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>THP-1細胞の維持用</td></tr><tr><td>Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>注意:危険な</td></tr><tr><td>YPD&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>増殖用 Candida glabrata</td></tr><tr><td>細胞 ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>C. glabrata-感染 THP-1 マクロファージの固定用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td></td><td></td><td>緩衝液 (137 mM NaCl、10 mM リン酸、2.7 mM KCl、&nbsp; pH 7.4) 洗浄用生理</td></tr><tr><td>食塩水-クエン酸ナトリウム (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>洗浄用バッファー(3 M NaCl、0.3 Mクエン酸ナトリウム、20倍濃度)</td></tr><tr><td>プレハイブリダイゼーションバッファー</td><td></td><td></td><td>(50%ホルムアミド、5x Denhardt'ハイブリダイゼーション用5x SSC、1% SDS)</td></tr><tr><td>VECTASHIELD封入剤</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>共焦点顕微鏡用スライドの埋込み用</td></tr><tr><td><-sup>32P-labeled &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>シグネチャタグの放射性標識用</td></tr><tr><td>100 mm組織培養皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>To culture THP-1 cells</td></tr><tr><td>24-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>THP-1マクロファージにおけるC. glabrata感染研究の実施</td></tr><tr><td>4チャンバー組織培養処理ガラススライド</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Rohem India</td><td></td> 細胞<td>の列挙用</td></tr><tr><td>テーブルトップ微量遠心機</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>マイクロチューブ内の細胞のスピンダウン用</td></tr><tr><td>テーブルトップ遠心分離機</td><td>レミ</td><td>R-8C</td><td>15mlチューブ内の細胞のスピンダウン用</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>アマシャム・バイオサイエンス</td><td>ウルトラスペック10</td><td>酵母細胞の吸光度を監視するため</td></tr><tr><td>プレートインキュベーター</td><td>ラボテック</td><td>冷蔵</td><td>C. glabrata細胞を育てる</td></tr><tr><td>シェイカーインキュベーター</td><td>ニューブランズウィック</td><td>州Innova 43</td><td>C. glabrata細胞を増殖させるには</td></tr><tr><td>ウォータージャケット CO2&nbsp; インキュベータ</td>ー <td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma series 2</td><td>THP-1細胞を培養するには</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td></tr><tr><td>Compound顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>観察するには C. glabrata および THP-1 マクロファージ</td></tr><tr><td>PCR マシン</td><td>BioRad</td><td>DNA エンジン</td><td>入力および出力ゲノム DNA</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション オーブン</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>ハイブリダイゼーション用&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>富士フイルム</td><td>FLA-9000</td><td>ハイブリダイズドメンブレンのスキャン用</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>放射性標識シグネチャタグの変性用</td></tr><tr><td>ゲルドキュメンテーションユニット</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>アガロースゲル中の臭化エチジウム染色DNAを可視化</td></tr></tbody></table>

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のthp-1マクロファージにおける

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

細胞培養モデル系では、ホスト環境条件の近隣模倣場合、微生物病原体感染の特定の段階の研究のための動物モデル系を、安価で再現性があり、容易に操作可能な代替物として機能することができる。 、ホルボールエステル治療の際に、マクロファージに分化されたTHP-1ヒト単球細胞株は、以前に結核菌を含む多くの細胞内病原体の病原性戦略を研究するために使用されている。ここでは、in vitro細胞培養モデルを制定するためのプロトコルを議論ホスト貪食細胞と日和見人間酵母病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を記述するために、THP-1マクロファージを用いたシステム。このモデル系は、簡単、迅速、ハイスループット変異スクリーニングに適しており、まだ高度な機器を必要としない。典型的なTHP-1マクロファージ感染実験を回収し、細胞内を可能にするために、追加の24〜48時間で約24時間を要するコロニー形成単位ベースの実行可能性の分析のための富栄養培地上で増殖する酵母。他のin vitroモデル系と同様に、このアプローチの可能な限界は、ヒト宿主に存在する非常に複雑な免疫細胞回路に得られた結果を外挿することが困難なことである。しかし、これにもかかわらず、現在のプロトコルは、真菌病原体が、抗菌応答に対抗して生き残る/回避適応し、宿主免疫細胞の貧栄養環境下で増殖するように使用することができる戦略を解明することは非常に便利です。

CとPMA処理したTHP-1マクロファージの感染分析グラブラタ野生型（wt）細胞は、wt細胞を、2時間の同時インキュベーション後に55〜65％の割合でマクロファージによって貪食されたことを明らかにした。さらに、C.グラブラタ細胞は、THP-1マクロファージによる殺傷に抵抗することができましたし、中程度の5を受けた- THP-1マクロファージ8と共培養の24時間後のCFUでの7倍に増加した。 THP-1マクロファージあたりの細胞内酵母細胞の数をかけ七から一二に1つまたは2つの増加を特徴とTHP-1マクロファージにおけるGFP発現プラスミドで形質転換された野生型細胞の細胞内複製もまた、共焦点蛍光顕微鏡で確認した24時間の（ 図1）。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/5062...

現在の記事は、真菌の病原性のメカニズムの知識を進めるために有用なツールとなり、人間のマクロファージとの通性細胞内のヒトの真菌病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を研究するためのin vitroでの細胞培養モデル系を確立するためのプロトコルの概要を説明します。

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

この手順の目的は、ヒトの日和見真菌病原体の細胞内挙動を研究するためのin vitro培養モデルシステムを構築することです。ヒト単球細胞株THP-1由来のマクロファージにおけるCandida labrattaの挙動を解析します。これを達成するために、まずTHP-1単球をPMAで処理し、マクロファージへと分化させます。次に、THP-1マクロファージをCandida GTA細胞で感染させ、感染後2時間をおきます。貪食されなかったCandida GTA細胞はPBS洗浄によって除去し、感染したマクロファージを浸透圧的に溶解させることで、細胞内のCandida GTA細胞を回収し、さらなる解析に用います。このプロトコルは、マクロファージにおけるCandida GTA細胞のウイルス量だけでなく、Candida GTA感染に伴うTHP-1マクロファージにおけるファゴソームの成熟過程およびサイトカイン応答の評価に使用できます。さらに、本プロトコルをスケールアップすることで、Candida collaborator 変異株ライブラリーにおける THP-1 マクロファージでの生存プロファイルの変化を、セミハイスループットな手法でスクリーニングすることが可能です。本プロトコルの主な利点は、比較的低コストであり、再現性が高く、さまざまな免疫細胞や真菌病原体に容易に適応できる点にあります。手順を開始するにあたり、感染の2日前に THP-1 単球細胞を 80% までのコンフルエント状態にします。1日目に、培養フラスコを取り出し、ゆっくりと穏やかに操作して、すべての細胞を懸濁させます。THP-1単球細胞懸濁液を15 ml遠心チューブに移します。細胞懸濁液を室温で1000 RPMで4分間遠心分離します。培地を廃棄容器にデカンテーションし、5 mlのAPI培地をチューブに加えて再懸濁します。培地を3〜4回緩やかにピペッティングし、THP-1細胞ペレットを懸濁させます。細胞懸濁液を10 µL取り、ヘモサイトメーターを用いて細胞密度を測定し、細胞密度を1 million cells/mlに調整します。最終濃度が16 nMとなるように、60 µMのPMAストック溶液を1 µL細胞懸濁液に加え、十分に混合します。1 million cellsに相当する細胞懸濁液1 mlを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注し、37 °C、5% CO2に設定したインキュベーターに移します。12時間のインキュベーション後、古い培地を除去します。各ウェルにpre RPI mediumを1 ml加え、プレートをさらに12時間インキュベートします。これらの細胞は、後述する細菌感染に使用します。適切な微生物学的手法を用いて、単一のEAコロニーをMLのYPD培地を含むフラスコに接種します。30 Degrees Celsiusに設定したインキュベーター内でフラスコを14〜16時間培養し、その後、MLの培養液を4,000 RPMで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、シェルを滅菌PBSで3回洗浄します。洗浄バッファーを廃棄した後、穏やかにピペッティングして、細胞ペレットを1 mlの滅菌PBSに懸濁します。次に、分光光度計を用いて600 nanometerでの細胞懸濁液の吸光度を測定し、PBSを用いて細胞密度を2 million cells per mlに調整します。細胞懸濁液を50 µL取り、PBSで100倍に希釈します。YPD AGA培地に100 µLの培養液を塗抹します。プレートを30 °Cでインキュベートし、1〜2日後にYPDプレート上に現れたコロニー数をカウントします。この数に適切な希釈倍率を掛け合わせ、0時間のコロニー形成単位（CFU）を算出します。算出された数に相当するCanada RetaのCFUを用いて、マクロファージのDHE感染を行います。次のステップでは、24ウェル培養プレート内のマクロファージ単層に、50 µLの樹状細胞懸濁液を加えます。プレートを揺らして各細胞を均等に分散させ、37 °Cで2時間インキュベートします。培養プレートを容器に反転させて培地を除去し、各ウェルの壁面に沿って1 mLのsterile PBSを慎重に加えてウェル内を十分に洗浄し、バッファーを除去します。このステップをさらに2回繰り返します。次に、最初のウェルを除き、他のすべてのウェルにRPI培地を1 mL添加します。これは、感染後4、6、12、24時間におけるcandida atory細胞の細胞内複製をモニタリングするために使用されます。マクロファージへの感染から2時間後に細胞内e細胞を回収するために、phos.ウェルに滅菌水を1 mL添加します。2分後、1 mLピペットチップでウェルを優しくスクレイピングし、ウェル内のマクロファージの残渣を除去します。ウェルを洗浄し、溶解物をマクロЦентリ（macrocentrifuge）チューブに回収します。PBSを用いてmicroFIT細胞溶解物の100倍希釈液を調製し、100 µLをYPD AGA培地に塗布します。プレートを30 °Cで1〜2日間インキュベートし、コロニー形成単位（CFU）数を計測します。この数値に適当な希釈倍率を乗じて、感染2時間後にT2細胞およびマクロファージによって貪食されたCandida albicans細胞数を算出します。同様に、細胞内Candida albicans細胞数は異なる時点においても決定可能です。感染後の細胞内増殖は、ここに示した2時間時点で内部に取り込まれたCFUと比較して、24時間時点でCFUが増加したこととして表されます。 typical な実験のその他の結果として、TV one マクロファージに感染させた canida gator 細胞の総数が 6 × 10⁴ 個の場合、24 時間後に回収された細胞数は 3.76 × 10⁴ 個であった。これにより、24 時間の共培養期間中に 62.66% の割合で細胞が食作用を受けたことが示されている。細胞内e細胞の数が3.76 times 10.4から1.96 times 10.5に増加したとき、can al細胞は5.2倍の複製を示した。本実験では、GFP発現E細胞を用い、共焦点顕微鏡を使用してcanida TER細胞の細胞内複製を評価することも可能である。24ウェル培養プレートについて先に述べたプロトコルに従い、4チャンバースライドを用いてTHVおよびマクロファージを準備し、感染させる。感染から2時間後。スライドを廃棄容器に逆さまにして培地を除去し、スライドの各チャンバーに500 µLのPBSを加えます。十分に洗浄し、PBSを除去します。細胞を固定するため、3.7% formaldehyde 500 µLを用いてこの手順をさらに2回繰り返します。スライドを室温で20分間インキュベートし、formaldehydeを除去します。各ウェルを500 µLのPBSで洗浄し、マクロファージを透過処理させるため、triton X 500 µLを添加します。5分間インキュベートした後、Triton Xを除去し、ウェルをPBSで洗浄します。チャンバー除去ツールとエアライダー・スライドを用いて、チャンバースライドを慎重に分解します。スライドの各セクターにDPIを含むVector Shield封入剤を1滴ずつ滴下し、カバーガラスを載せて、エッジをネイルポリッシュで密封して共焦点顕微鏡下で細胞を観察します。ここに示されているのは、GFEを発現する野生型Canida laboratory細胞に感染したTP1マクロファージの代表的な共焦点画像です。2時間から24時間にかけて細胞内e細胞の数が約6倍に増加していることは、TP1マクロファージ内でのCanida laboratoryの複製を示しています。シグネチャータグ変異導入法は、微生物病原体の病原性因子を同定するために広く用いられており、独自のオリゴヌクレオチド配列タグを用いて、多数の変異体の増殖欠損を同時にスクリーニングします。ここでは、Canadaライブラリおよび変異ライブラリのSTMスクリーニングに関するプロトコルを説明します。この手法は、以下の3つのステップで構成されています。まず、それぞれに固有のオリゴヌクレオチド配列スタックを保持する96種類のプラスミドを、ナイロンメンブレン上に固定します。第2ステップでは、96種類のCANIDA ator変異株のプールを用いて、THV oneマクロファージにおける生存プロファイルの変化をスクリーニングします。続いて、YPDで培養しマクロファージに内部移行させた変異細胞を回収し、これらをそれぞれインプットサンプルおよびアウトプットサンプルとして定義します。最後に、インプットおよびアウトプットのゲノムDNAサンプルからDNAシグネチャータグをPCR増幅し、放射性標識を行います。PCR産物を固有のタグにハイブリダイズさせ、メンブレン上の放射性信号を定量し解析します。96 12ドットボード装置を組み立てるには、湿らせたSwap Wind Treeペーパーの上に濡れたナイロンメンブレンを配置し、ユニットのネジを締めます。メンブレンを滅菌水で洗浄し、続いて0.4 M 水酸化ナトリウムで洗浄します。0.4 M 水酸化ナトリウムでの洗浄後、96 12ブロックからPLA BDNA溶液 200 ngをドットボード装置の対応するウェルに転送します。UVクロスリンカーを用いて転移させたプラスミドBDNAをメンブレンに固定した後、ドットブロット装置からメンブレンを取り出します。メンブレンを、インプットおよびUNEボトル内のハイブリダイゼーション前バッファー中で、42 °Cで2時間インキュベートします。インプットおよびアウトプット細胞ペレットから抽出したゲノムDNAと、ユニークタグのインバート隣接領域に対するプライマーを用い、PCRによって放射標識プローブを調製します。放射性標識プローブを99 °Cで5分間加熱して変性させ、氷上で急速冷却します。変性プローブを入力ボトルおよび出力ボトルに移し、42 °Cで14〜16時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション後。プロトコルに従って、入力膜および出力膜を洗浄します。ボトルから膜を取り出して風乾させ、フォスフォーイメージングスクリーンに密着させます。2〜3時間後、フォスフォースクリーンをスキャンして画像を取得します。この例では、生存率の変化を調べるために96株のcanida Gatory変異株のプールをスクリーニングした、2枚のハイブリダイズ済みメンブレンフィルターを示しています。マクロファージの定量および、インプットメンブレンに対するアウトプットメンブレンの各スポットの信号強度の比率を決定したところ、タグ番号13、26、75、85のアウトプットにおける割合が低いことが明らかになりました。これらのスポットは赤い円で囲まれており、4つの異なる変異株の増殖を反映しています。対照的に、緑色で強調表示された独自の配列11および81を持つ変異株スタックは、出力サンプルにおいて過剰に表現されています。言い換えれば、このスクリーンから得られた96個の変異株プールにおいて、2つの変異株は生存率を向上させ、4つの変異株はマクロファージ内での増殖を示すはずです。このようなプールスクリーンで特定された生存表現型の変化は、単独感染アッセイで検証される必要があります。このビデオを視聴することで、目的の真菌病原体の口腔内での増殖プロファイルを研究するためのin vitro口腔システムの構築方法について、十分に理解できるはずです。さらに、このシステムを用いて大規模な変異株プールスクリーニングを実施できるようになります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

このビデオでは、人工多能性幹細胞を用いた神経芽腫のミクログリア食作用アッセイを行っています。このアッセイは、神経変性疾患におけるミクログリア機能の障害を評価するのに役立ちます。...

ミクログリア食作用アッセイ:iPS細胞マクロファージを用いた神経芽腫細胞のミクログリア食作用モデルを確立するためのIn vitroアッセイ

このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用してアポトーシス細胞のクリアランスを研究するエフェロサイトーシスアッセイを実演します。エフェロサイトーシスは、アポトーシス細胞が食細胞に飲み込まれ、エフェロソームと呼ばれる小胞内で分解される多段階のプロセスです。このプロトコルは、個々のアポトーシス細胞の内在化部分と非内在化部分を視覚化し、エフェロサイトーシスを定量化する方法を提供します。...

Fixed Cell Efferocytosis Assay:蛍光顕微鏡を用いたマクロファージによるアポトーシス細胞のエフェロサイトーシス取り込みを研究する方法

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します...

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

ここで提示するプロトコルは、顕微鏡法および蛍光染色を用いて生細胞培養におけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)産生を検出するプロトコルである。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって特異的なMETタンパク質マーカーを調べるためにさらに拡張することができる。...

分化ヒト単球由来マクロファージにおける細胞外トラップ放出のIn Vitro刺激と可視化

リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。...

共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査

マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。この原稿の目的は、 Trichoderma stromaticum conidiaで刺激されたヒト末梢血単核由来マクロファージの食作用とクリアランス能力を評価する方法を提示することです。...

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

単球とマクロファージは、健康と病気に不可欠な非常に可塑的で再プログラム可能な免疫細胞です。彼らは、特定の分化プログラムと表現型を採用することにより、幅広い刺激を感知し、反応します。私たちは、マクロファージの分極とリプログラミングを研究するためのin-vitroモデルを標準化し、研究に貴重なツールを提供しています。...

In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

学ぶCandida glabrataとTHP-1マクロファージの相互作用を解析するin vitroモデル構築法。PMA処理による細胞分化と細胞内挙動評価により、真菌病原性メカニズムの理解に貢献します。

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