設立

この手順の目的は、ヒトの日和見真菌病原体の細胞内挙動を研究するためのin vitro培養モデルシステムを構築することです。ヒト単球細胞株THP-1由来のマクロファージにおけるCandida labrattaの挙動を解析します。これを達成するために、まずTHP-1単球をPMAで処理し、マクロファージへと分化させます。

次に、THP-1マクロファージをCandida GTA細胞で感染させ、感染後2時間をおきます。貪食されなかったCandida GTA細胞はPBS洗浄によって除去し、感染したマクロファージを浸透圧的に溶解させることで、細胞内のCandida GTA細胞を回収し、さらなる解析に用います。このプロトコルは、マクロファージにおけるCandida GTA細胞のウイルス量だけでなく、Candida GTA感染に伴うTHP-1マクロファージにおけるファゴソームの成熟過程およびサイトカイン応答の評価に使用できます。

さらに、本プロトコルをスケールアップすることで、Candida collaborator 変異株ライブラリーにおける THP-1 マクロファージでの生存プロファイルの変化を、セミハイスループットな手法でスクリーニングすることが可能です。本プロトコルの主な利点は、比較的低コストであり、再現性が高く、さまざまな免疫細胞や真菌病原体に容易に適応できる点にあります。手順を開始するにあたり、感染の2日前に THP-1 単球細胞を 80% までのコンフルエント状態にします。1日目に、培養フラスコを取り出し、ゆっくりと穏やかに操作して、すべての細胞を懸濁させます。

THP-1単球細胞懸濁液を15 ml遠心チューブに移します。細胞懸濁液を室温で1000 RPMで4分間遠心分離します。培地を廃棄容器にデカンテーションし、5 mlのAPI培地をチューブに加えて再懸濁します。培地を3〜4回緩やかにピペッティングし、THP-1細胞ペレットを懸濁させます。

細胞懸濁液を10 µL取り、ヘモサイトメーターを用いて細胞密度を測定し、細胞密度を1 million cells/mlに調整します。最終濃度が16 nMとなるように、60 µMのPMAストック溶液を1 µL細胞懸濁液に加え、十分に混合します。1 million cellsに相当する細胞懸濁液1 mlを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注し、37 °C、5% CO2に設定したインキュベーターに移します。

12時間のインキュベーション後、古い培地を除去します。各ウェルにpre RPI mediumを1 ml加え、プレートをさらに12時間インキュベートします。これらの細胞は、後述する細菌感染に使用します。

適切な微生物学的手法を用いて、単一のEAコロニーをMLのYPD培地を含むフラスコに接種します。30 Degrees Celsiusに設定したインキュベーター内でフラスコを14〜16時間培養し、その後、MLの培養液を4,000 RPMで5分間遠心分離します。

上清を廃棄し、シェルを滅菌PBSで3回洗浄します。洗浄バッファーを廃棄した後、穏やかにピペッティングして、細胞ペレットを1 mlの滅菌PBSに懸濁します。次に、分光光度計を用いて600 nanometerでの細胞懸濁液の吸光度を測定し、PBSを用いて細胞密度を2 million cells per mlに調整します。

細胞懸濁液を50 µL取り、PBSで100倍に希釈します。YPD AGA培地に100 µLの培養液を塗抹します。プレートを30 °Cでインキュベートし、1〜2日後にYPDプレート上に現れたコロニー数をカウントします。この数に適切な希釈倍率を掛け合わせ、0時間のコロニー形成単位（CFU）を算出します。算出された数に相当するCanada RetaのCFUを用いて、マクロファージのDHE感染を行います。

次のステップでは、24ウェル培養プレート内のマクロファージ単層に、50 µLの樹状細胞懸濁液を加えます。プレートを揺らして各細胞を均等に分散させ、37 °Cで2時間インキュベートします。培養プレートを容器に反転させて培地を除去し、各ウェルの壁面に沿って1 mLのsterile PBSを慎重に加えてウェル内を十分に洗浄し、バッファーを除去します。

このステップをさらに2回繰り返します。次に、最初のウェルを除き、他のすべてのウェルにRPI培地を1 mL添加します。これは、感染後4、6、12、24時間におけるcandida atory細胞の細胞内複製をモニタリングするために使用されます。マクロファージへの感染から2時間後に細胞内e細胞を回収するために、phos.ウェルに滅菌水を1 mL添加します。2分後、1 mLピペットチップでウェルを優しくスクレイピングし、ウェル内のマクロファージの残渣を除去します。

ウェルを洗浄し、溶解物をマクロЦентリ（macrocentrifuge）チューブに回収します。PBSを用いてmicroFIT細胞溶解物の100倍希釈液を調製し、100 µLをYPD AGA培地に塗布します。プレートを30 °Cで1〜2日間インキュベートし、コロニー形成単位（CFU）数を計測します。

この数値に適当な希釈倍率を乗じて、感染2時間後にT2細胞およびマクロファージによって貪食されたCandida albicans細胞数を算出します。同様に、細胞内Candida albicans細胞数は異なる時点においても決定可能です。感染後の細胞内増殖は、ここに示した2時間時点で内部に取り込まれたCFUと比較して、24時間時点でCFUが増加したこととして表されます。

typical な実験のその他の結果として、TV one マクロファージに感染させた canida gator 細胞の総数が 6 × 10⁴ 個の場合、24 時間後に回収された細胞数は 3.76 × 10⁴ 個であった。これにより、24 時間の共培養期間中に 62.66% の割合で細胞が食作用を受けたことが示されている。

細胞内e細胞の数が3.76 times 10.4から1.96 times 10.5に増加したとき、can al細胞は5.2倍の複製を示した。本実験では、GFP発現E細胞を用い、共焦点顕微鏡を使用してcanida TER細胞の細胞内複製を評価することも可能である。24ウェル培養プレートについて先に述べたプロトコルに従い、4チャンバースライドを用いてTHVおよびマクロファージを準備し、感染させる。

感染から2時間後。スライドを廃棄容器に逆さまにして培地を除去し、スライドの各チャンバーに500 µLのPBSを加えます。十分に洗浄し、PBSを除去します。

細胞を固定するため、3.7% formaldehyde 500 µLを用いてこの手順をさらに2回繰り返します。スライドを室温で20分間インキュベートし、formaldehydeを除去します。各ウェルを500 µLのPBSで洗浄し、マクロファージを透過処理させるため、triton X 500 µLを添加します。5分間インキュベートした後、Triton Xを除去し、ウェルをPBSで洗浄します。

チャンバー除去ツールとエアライダー・スライドを用いて、チャンバースライドを慎重に分解します。スライドの各セクターにDPIを含むVector Shield封入剤を1滴ずつ滴下し、カバーガラスを載せて、エッジをネイルポリッシュで密封して共焦点顕微鏡下で細胞を観察します。ここに示されているのは、GFEを発現する野生型Canida laboratory細胞に感染したTP1マクロファージの代表的な共焦点画像です。2時間から24時間にかけて細胞内e細胞の数が約6倍に増加していることは、TP1マクロファージ内でのCanida laboratoryの複製を示しています。シグネチャータグ変異導入法は、微生物病原体の病原性因子を同定するために広く用いられており、独自のオリゴヌクレオチド配列タグを用いて、多数の変異体の増殖欠損を同時にスクリーニングします。

ここでは、Canadaライブラリおよび変異ライブラリのSTMスクリーニングに関するプロトコルを説明します。この手法は、以下の3つのステップで構成されています。まず、それぞれに固有のオリゴヌクレオチド配列スタックを保持する96種類のプラスミドを、ナイロンメンブレン上に固定します。

第2ステップでは、96種類のCANIDA ator変異株のプールを用いて、THV oneマクロファージにおける生存プロファイルの変化をスクリーニングします。続いて、YPDで培養しマクロファージに内部移行させた変異細胞を回収し、これらをそれぞれインプットサンプルおよびアウトプットサンプルとして定義します。最後に、インプットおよびアウトプットのゲノムDNAサンプルからDNAシグネチャータグをPCR増幅し、放射性標識を行います。PCR産物を固有のタグにハイブリダイズさせ、メンブレン上の放射性信号を定量し解析します。

96 12ドットボード装置を組み立てるには、湿らせたSwap Wind Treeペーパーの上に濡れたナイロンメンブレンを配置し、ユニットのネジを締めます。メンブレンを滅菌水で洗浄し、続いて0.4 M 水酸化ナトリウムで洗浄します。0.4 M 水酸化ナトリウムでの洗浄後、96 12ブロックからPLA BDNA溶液 200 ngをドットボード装置の対応するウェルに転送します。

UVクロスリンカーを用いて転移させたプラスミドBDNAをメンブレンに固定した後、ドットブロット装置からメンブレンを取り出します。メンブレンを、インプットおよびUNEボトル内のハイブリダイゼーション前バッファー中で、42 °Cで2時間インキュベートします。インプットおよびアウトプット細胞ペレットから抽出したゲノムDNAと、ユニークタグのインバート隣接領域に対するプライマーを用い、PCRによって放射標識プローブを調製します。

放射性標識プローブを99 °Cで5分間加熱して変性させ、氷上で急速冷却します。変性プローブを入力ボトルおよび出力ボトルに移し、42 °Cで14〜16時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション後。

プロトコルに従って、入力膜および出力膜を洗浄します。ボトルから膜を取り出して風乾させ、フォスフォーイメージングスクリーンに密着させます。2〜3時間後、フォスフォースクリーンをスキャンして画像を取得します。

この例では、生存率の変化を調べるために96株のcanida Gatory変異株のプールをスクリーニングした、2枚のハイブリダイズ済みメンブレンフィルターを示しています。マクロファージの定量および、インプットメンブレンに対するアウトプットメンブレンの各スポットの信号強度の比率を決定したところ、タグ番号13、26、75、85のアウトプットにおける割合が低いことが明らかになりました。これらのスポットは赤い円で囲まれており、4つの異なる変異株の増殖を反映しています。

対照的に、緑色で強調表示された独自の配列11および81を持つ変異株スタックは、出力サンプルにおいて過剰に表現されています。言い換えれば、このスクリーンから得られた96個の変異株プールにおいて、2つの変異株は生存率を向上させ、4つの変異株はマクロファージ内での増殖を示すはずです。このようなプールスクリーンで特定された生存表現型の変化は、単独感染アッセイで検証される必要があります。

このビデオを視聴することで、目的の真菌病原体の口腔内での増殖プロファイルを研究するためのin vitro口腔システムの構築方法について、十分に理解できるはずです。さらに、このシステムを用いて大規模な変異株プールスクリーニングを実施できるようになります。