Name: 発生と光学投影トモグラフィを用いたマウスにおける動脈病変の3次元定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学ぶ光学投影トモグラフィーを用いたマウス動脈病変の3次元可視化と定量化法。アテローム性および内膜増殖性病変の体積測定により、心血管疾患のメカニズム理解と治療戦略の改善に貢献します。

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英国心臓財団（PWFH、BRW、DJWからと資金;この作品は、エジンバラ大学（NSK）とカーネギー·トラスト（ヘンリーDryerreスキームLL）からstudentshipsによって支持されたRG / 05/008、PG / 05/007; PG / 08/068/25461）とウェルカム·トラスト（JRS、BRW、DJW; 08314 / Z / 07 / Z）。著者らは、心血管科学センターに研究優秀賞のBHF資金によるセンターが提供する彼らの仕事のサポートに感謝しています。 著者らは、新生内膜病変の生産の外科的モデルの確立に教授正隆SATA（徳島大学）と（マウントサイナイ医科大学で博士Ernaneレイス」グループ内）博士イゴールChersehnevからのアドバイスのために特に感謝しています。ビデオが生成され、佐田らによって使用可能になった。（http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm）が特に有用でした。

マウス大腿動脈における新生内膜病変の1外科誘導<ol><li>動物を用いた実験は、国や機関の倫理要件に従って行われるべきです。すべての手術は、適切な無菌技術を使用して実行する必要があります。新生内膜病変の誘導は、ロケら 12およびSATA ら 13によって記載された技術の改変を用いて達成されます。 </li><li>導入室で4〜5％のイソフルランを送達することによって麻酔し、その後、オスのC57Bl6 / Jマウス（体重25〜30グラム年齢10〜12週）を秤量します。麻酔が誘導された後、37℃の体温を維持するために加熱されたマットにマウスを転送します。マスクを介してイソフルラン（2-3％）の投与を続けます。 </li><li>麻酔の適切なレベルは、誘発された後、（つま先のピンチに応答の欠如）、（0.1ミリグラム/ kgの-1）ブプレノルフィンの投与により鎮痛カバーを提供します。そして、仰臥位のANにマウスを置きます左後肢の腹面を剃るdは。 </li><li>上側後肢の筋肉を露出させるために切開を行い、膝窩動脈との分岐部と腹壁の間、大腿神経から大腿動脈と静脈を分離するために鈍的切開を使用しています。 v必要に応じてリグノカイン/ wの1％を使用して傷を灌漑。 </li><li>血液の流れを制御するために、大腿動脈と静脈の周りに、近位（すぐに膝窩動脈との分岐下）（腹壁に近い）と遠位一時合字（6/0 Mersilk）を配置します。そして、（大腿動脈との分岐に遠位約2〜5ミリメ​​ートルのための）膝窩動脈を分離し、遠位連結。膝窩動脈下に第二、アンタイドリガチャーを配置します。 </li><li>近位の一時的な合字に圧力を適用することにより、出血を防ぐ、大腿動脈との分岐のすぐ遠位、膝窩動脈に小切開（動脈）を作ります。直進、0.014 &quot;ガイドワイヤを弾みます1〜1.5センチメートル腹壁の方向に大腿動脈に沿って、30秒（ 図1A）のための場所のままにしておきます。 </li><li>ガイドワイヤを取り外し、その目的のために配置された合字を使用して、大腿動脈を閉塞しないように注意しながら、動脈の上膝窩動脈を結紮。 注：ライゲーションによって誘発される損傷の場合。腔内損傷のない新生内膜のリモデリングは、大腿骨または膝窩動脈（ 図1Bおよび1C）を連結することにより誘導することができます。このフォローは1.1〜1.5のステップを達成するために。しかし、動脈切開をしないが、いずれかの（i）から（ステップ1.6を​​回避する）は膝窩動脈との分岐点で、大腿動脈または（ii）の連結総大腿動脈のすぐ遠位膝窩動脈を結紮します。そして、ステップ1.8に進みます。 </li><li> 、一時的な合字を削除不連続外部縫合糸（5/0 Mersilk）で傷口を閉じ、EMLAクリーム（2.5％リドカイン、​​2.5％プリロカイン）を適用します。動物は再することを許可します<html>部屋を保持に戻る前に（わずかな跛行が影響を受けた脚に明らかであろうが、これは手術後の最初の2〜3日かけて解決する必要があります）意識（通常5〜10分）を得て、彼らはケージの周りを自由に移動していることを確認します。マウスは、手術後に単独で収容する必要はありません。 </li><li>動物は最大3ヶ月で回復することができます。小さな病変は〜7日線損傷後表示されるように開始され、〜21〜28日後に安定した最大サイズに到達します。 </li></ol>アポリポタンパク質Eにおけるアテローム性動脈硬化症の病変の2誘導- / -マウス<ol><li>オスに;（リサーチダイエット、米国0.2％コレステロール）、（家で飼育）6週齢のApoE欠損マウス12週間西洋型食餌を管理します。 </li><li>アテローム性動脈硬化病変は、多くの場合、大動脈弓とその主要な枝（ 図2）の総点検に表示されます。 </li></ol> 3.解析法動脈病変用いて光学投影トモグラフィ（OPT） NT &quot;&gt;注：マウスの​​大腿動脈および大動脈弓の試料中の病変の画像をOPTは、光学投影断層撮影装置を用いて得ました。 <ol><li> 10％の中性緩衝ホルマリンに続く終末麻酔下に経心臓灌流固定および放血（80ミリグラム/ kgのペントバルビタールナトリウム）、（10 U / ml）をヘパリン化を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、マウスを安楽死させます。 </li><li>必要に応じて大腿動脈や大動脈弓とその主要な枝（左頸動脈、左鎖骨下動脈、腕頭動脈）を、単離し、および外来周囲外膜材料を除去します。必要になるまで70％エタノール中で貯蔵する前に、10％緩衝ホルマリンO / Nでポストフィックス、。 </li><li>ワットマンの113 V紙を通して事前にフィルタ処理を1.5％低融点アガロースに埋め込む動脈。磁気OPTに各サンプルを取り付け、マウントのそれに沿って容器軸とシアノアクリレート接着剤でマウントします。円錐形状に過剰なアガロースをトリミング。少なくとも12時間、100％メタノール中で脱水。 </li><li> C言語ベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジルの混合物中（12~24時間のために）浸漬することにより、リアの容器（1：2 v / v）でした。 </li><li>較正された断層撮影でクリアサンプルを置きます。 1,024×1,024の解像度を設定し、関心のある領域全体を見ることを可能にする光学倍率を決定します。 OPTボリュームがz軸が同じ解像度に再構成された等方性である（ すなわち 、1,024×1,024×1024）、ボクセルサイズ〜200μmです。再構成アーチファクトである可能性があるので、これは解像度の過剰推定値を表すことができます。それは明視野、伝送チャネルにおける視野の中心に自身の軸上に回転するように試料位置を調整します。 </li><li> GFP1フィルタ排出チャネル（励起フィルター425 nmのバンドパスから40nmと;発光フィルター：475 nmのロングパス）において、試料を集束し、得られた画像のダイナミックレンジを最大にするために、露光時間を調整し（過剰飽和を避けます）。 0.9°の回転ステップと、のみGFP1放出チャネルで容器をスキャンします。&lt;/ LI&gt; <li>完了時に、データビューアソフトウエアを用いてデータ取得の品質を確認します。スキャナから試料を取り出します。 </li><li>通常通りにパラフィンワックスために処理する前に、&gt; 24時間、100％メタノールでの場所のサンプルを、その後の組織学的分析を可能にします。 </li></ol> 4.画像再構成と分析フィルタ補正逆投影により断層撮影の再構築はNReconソフトウェアまたは類似を用いて行われます。再構成は、バッチで、無人で実行することができます。 <ol><li>位置ずれを補正し、画像強度レベルを調整することにより、画質を向上させます。 </li><li>データビューアソフトウェアを使用して画像再構成の品質を確認してください。 </li><li>分析用試料の適切なセクションを識別します。管腔の寸法を記録する場合の容器の間で一貫性この長さにしてください。 </li><li>手動ですべての50の再構築断面に1のための適切な境界線をトレースすることにより、病変の輪郭を定義します。 </li><li>コンピュータで生成された補間が正しいことを確認するために、各インターリーブの断面を確認してください。必要に応じて手動で境界線を調整します。 </li><li>唯一の病変が選択されるようにグレーレベル閾値を設定し、測定データをエクスポートします。 </li><li>各スキャンでは、損傷を含む、関心の垂直領域を定義し、メディアと新生内膜との境界をトレース（ すなわち 、内弾性板の位置）毎に50 番目の走査線に対する。ソフトウェアでのインターリーブ走査線用の内膜/中膜の境界線を補間し、必要なフィット感を確認し、修正してください。さらに、このセグメントは、白画素が新生内膜と黒画素を表現する二値画像のセットを生成するために、手動で定義された強度閾値に三次元ボリュームを定義したが、特許ルーメンを表します。 </li><li>得られる測定値が含まれます：総病変体積（対象ボリューム）、管腔ボリューム（全量 - 対象ボリューム）と病変部と内腔クロス宗派の分布を研究容器の軸方向の長さに沿ってionalエリア。 </li></ol>

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著者には競合する金銭的利害関係はありません。

3次元解析は、交換またはまだ動脈病変形成の研究の大部分を支える2次元の組織学的技術を追加するための大きな可能性を秘めています。ここでは、OPT（おそらく、この技術を使用してうまく分析することができる最小の血管を表すマウス大腿動脈に）小ネズミの動脈に示されています。これは、小規模から中規模の人間の血管を含む他の種からも、しかしながら、動脈（病変）で使用するのに適しています。当社グループは、正常（Bezuidenhout ら 、未発表）、ウサギの大動脈に病変を分析するための技術を使用しています。 OPTは、伝統的な組織像と比較してより高速な分析と増加構造情報を約束し、組織学的および免疫組織化学の両方の技術を使用して、試料のその後の分析を防止しないという利点があります。 OPTを使用して生成された画像は、病変形成の部位を示す、解剖学的詳細を与えますこれらの領域における病変の大きさ。これらの研究で使用された動脈は、したがって、（おそらく回転ずれ、不完全クリア、反射/屈折アガロース頂点で、フォーカスの問題に起因する）成果物によってある程度損なわれる技術と画質のための分解能の限界におそらく近いです。それにもかかわらず、必要な詳細（ すなわち 、血管壁の層）は識別可能のままであり、したがって、技術は、個々の層の定量化のために極めて有用です。実際、画像はサンプル中の選択された部位で血管のプラークベアリングセクションの病変および管腔の容積の測定、ならびに病変の断面積と内腔を提供するために、迅速かつ再現可能に定量化することができました。 （大動脈）大中規模（大腿、頸動脈、鎖骨下）は、マウスの動脈 - 一般のマウスにおいてアテローム性動脈硬化症とneotintimal病変形成の分析のために使用されるものは - 成功しましたこの方法を使用して分析しました。実際、我々は今、アテローム性動脈硬化症および新生内膜病変の大きさの薬理学的介入や遺伝子操作の効果を実証するために、OPTを使用しています。例えば、血管内皮からのエンドセリンB受容体の選択的削除は15なかったのに対し、新生内膜病変形成を変化させ、エンドセリン受容体遮断。アテローム性動脈硬化を起こしやすいマウスでは、酵素11β-HSD1 16またはガレクチンの遺伝子欠失3 17は、アテローム硬化性病変の大きさを減少させることが示されました。 病変体積の定量化は、OPTの明らかな利点です。これは通常の組織学的方法を用いて得られるよりも、動脈4の総病変負担のより有益な指標を与えます。病変全体を分析する容器の個別のセクションが分析のために選択された場合、必然的に発生する選択バイアスとエラーを低減します。縦病変プロファイルの生産はOPTのさらなる強さ、傷害13,16の異なるタイプ（ 図5）によって誘発される病変の比較によって強調しました。例えば、完全な連結およびワイヤー挿入の両方がfemero-膝窩分岐に近いほぼ完全閉塞を誘発しました。ワイヤ傷害は、しかしながら、動脈結紮により誘発される病変が急速にサイズが減少し、消滅するのに対して、スキャン部の全長に沿って拡張性病変を生じました。このパターンは、血管形成術用ガイドワイヤの挿入によって引き起こされる損傷の大きい程度と一致しています。組織切片を用いて、同様の結果を生成することは、高価で時間がかかり、労働集約的です。 OPTの利点は、（私たちが日常的に一日あたり20隻をスキャンした）それが生成する画像の品質とその相対速度とシンプルさがあります。画質は、3次元画像を生成するための他の方法にも、優れた、または少なくとも匹敵現れるエクスビボで 、Y（例えば、MRIおよびマイクロCTのような）らOPTが短いスキャン時間を必要とします（私たちの研究のための積分時間は、通常、1-2sec /画像であった）と安価です。サンプル調製は、数日間にわたって延びるが、血管がバッチで調製する​​ことができ、データは1つのセッションで取得することができ、少ない労力を必要とします。その結果、スループットが高く、スキャナの拡張使用を必要としません。重要なことに、OPTの非破壊的性質は、免疫組織化学的検査のために興味のある部位を同定するために使用できることを意味します。従って、切断の量を減少させ、必要に染色。それは、高解像度の超音波の開発は、動脈の病変、このサイズの体積定量化のための別の方法を提供することが可能であるが、著者らは、このアプリケーションを実証する任意の刊行物を知りません。 おそらく当然、OPTで画質が（もちろん、唯一の小さいサンプルで実施することができる）顕微鏡技術に劣っています。 reconstructioすることを提案改良データのnが画質19,20の将来の改善を可能にすることによって、この制限に対処することができます。別の方法論的な懸念は、組織処理は、サンプルの特性を変化させることです。例えば、クリアリング剤、ベンジルアルコール/安息香酸ベンジル（BABB）の親油性の性質は、脱水前に収縮を引き起こす可能性がある一方で、アテローム性動脈硬化病変から脂質を除去する可能性がある（もちろん、脱水及び脂質除去工程もの特徴である、が、パラフィンワックスに埋め込むためのサンプル調製）。 BABB（ 例えば 、グリセロール21）は、形態のわずかな変化を引き起こす親水決済剤と比較して、この研究で使用しました。 特に重要な細胞の3次元配置を追跡し、動脈リモデリングに関与する因子シグナル伝達に関してOPTのさらなる発展と洗練のためのいくつかの可能性があります。そのようなaは、動脈組織の強い自己蛍光、解剖学的画像の生成のn利点は、漂白22の既存の方法によりクエンチされず、RNAおよびタンパク質分布パターンを評価するための蛍光プローブの使用を制限することができます。伝送イメージングにより可視化比色プローブの使用（ 例えば、βガラクトシダーゼ）は、この制限を克服することができます。 結論として、OPTは、マウスの動脈の内膜における病変の3次元画像化のための大きな可能性を秘めています。これは、一般的に労働集約的であり、効果的に総病変体積を表すものではありません2次元の方法にかなりの進歩を表します。 OPTは、比較的、迅速、便利で非破壊的です。画像解析の新展開は、さらなる技術のパワーと有用性を向上させることを約束します。

動脈病変の形成は、心血管疾患1に関連する高い罹患率および死亡率の中心です。病変形成は、傷害2動脈する自由な炎症反応によって引き起こされると考えられています。再狭窄病変は、（例えば、ステント移植後に）急速に後の急性の機械的損傷を発症するのに対し、アテローム性動脈硬化病変は、動脈壁の慢性傷害に応答して、ゆっくりと形成されます。動脈の病変の発生に寄与するメカニズムは、多くの場合、関連する遺伝子操作1と組み合わせて、適切な動物モデルを使用することによってかなり明らかにされています。 これは、インビボおよびエクスビボの検出や小動物における病変の分析のための改良された方法の開発と変化しているものの、病変の大きさおよび組成の分析は、古典的（ex vivoで 、2次元の組織学に大きく依存してきました&lt;SUP&gt; 3）。動脈病変の組織学的分析は、労働集約的で時間がかかり、3次元構造の限られた情報を提供しています。例えば、病変の負担は、一般に、病変（ランダムに選択された部位で、または最大閉塞の部位でのいずれか）の断面積を測定することによって評価されます。これは、全体的な病変の負担の不完全な分析を提供します。ホールマウント3次元イメージング技術は、この問題に対する可能な解決策を提供するが、驚くべきことに、いくつかの適切なアプローチが記載されています。これは、磁気共鳴イメージング（MRI）4及びX線コンピュータ断層撮影（CT）5のための単一光子共焦点顕微鏡検査のためには大きすぎるが、小さすぎるマウスの動脈のサイズに主に起因し得ます。マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の病変の研究にex vivoでの MRIの適用とマイクロCTは、彼らも比較的大きな動脈で、限られた解像度を提供していますを示唆しています。これに加え、比較的長い取得時間が必要スループットを制限する（走査コストを増大させる）4,6。 （例えば、光コヒーレンストモグラフィー3,7と光音響トモグラフィ8のような）新たな光の画像診断法の開発は、マウス動脈の病変のイメージングを改善するための多くの可能性を提供しています。同様の電位は、マウス胚の分析を可能にするために開発された光学投影トモグラフィ（OPT）で示されています。 OPTは直径9〜0.3〜10ミリメートルの範囲の画像標本に設計されました。透過画像は多色可視光に対して半透明の試料の不透明度を記録し、解剖学的構造の識別のために使用することができます。内因性（ 例えば 、コラーゲン、エラスチン）と、試料中の外因性の蛍光団からの特定の波長での励起後の発光イメージングレコード放出。異なる組織成分は、自己蛍光種の種類および濃度が異なることができるので、これは、（解剖学的情報を提供することができ存在）。加えて、免疫反応性または遺伝子発現の分布は、適切な蛍光プローブ10を使用して決定することができます。撮影モード（送信または発光）のいずれかの場合は、光が試料回転（0.9°単位で通常400画像）として、反復画像キャプチャを可能にするために、電荷結合素子に集光されます。これらには、（例えば、フィルタ補正逆投影（コーンアルゴリズムを用いて）、または反復再構成のような）標準的な断層撮影の再構成方法により体積を計算するために使用することができます。 以前カークビーら 11に記載されているように、このビデオでは、アテローム性動脈硬化症および新生内膜病変の、迅速な定量化可能で費用対効果の高い3次元解析のためのOPTの私たちの新たなアプリケーションを示しています。技術は、3つの一般的に使用されるモデルに病変サイズを定量化するために適していることが示された：（I）大腿動脈ワイヤ傷害; apolipoprotei（ii）において、大腿動脈結紮、および（iii）食餌誘発性アテローム性動脈硬化症N E欠損（アポE - / - ）マウス。

<table><tbody><tr><td>手術顕微鏡</td><td>ツァイス、ドイツ</td><td></td><td>OPMI Pico i</td></tr><tr><td>麻酔器</td><td>獣医技術、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluovac</td><td>ハーバード装置 英国</td><td>340387</td><td></td></tr><tr><td>Fluosorber</td><td>ハーバード装置 英国</td><td>340415</td><td></td></tr><tr><td>ビーズ滅菌器</td><td>ファインサイエンスツール、英国</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>加熱マット</td><td>ファインシーンTools, UK</td><td>21061-10</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS1602S</td><td>PB1502 or equivalent</td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon, UK</td><td></td><td>5/0 Mersilk</td></tr><tr><td>Guidewire</td><td>Cook Inc, USA</td><td>C-PMS-251</td><td>0.014"</td></tr><tr><td>縫合糸シルク</td><td>ファインサイエンスツール、英国</td><td>18020-60</td><td>6/0 Mersilk</td></tr>サージ<tr><td>カルツール</td><td>ファインサイエンスツール、英国</td><td>14058-09</td>タ<td>フカットアイリスはさみ</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas春はさみ</td><td>ファインサイエンスツール、英国</td><td>15000-01</td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン#5/45鉗子</td><td>ファインサイエンスツール、英国</td><td>11251-35</td><td></td></tr>モ<tr><td>リアアイリス鉗子</td><td>ファインサイエンスツール、英国</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools、英国</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>ブルドッグ クリップ</td><td>Fine Science Tools、英国</td><td>18050-35</td><td></td></tr><tr><td>バイオオプトニクス 3001 断層撮影&nbsp;</td><td>バイオプトニクス、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁気OPTマウント</td><td>バイオオプトニクス、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>デル社、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ギルソン</td><td>F117606</td><td>Minipuls3</td></tr><tr><td>データビューアソフトウェア&nbsp;</td><td>Skyscan, Belgium</td><td>v.1.4.4</td><td></td></tr><tr><td>NReconソフトウェア&nbsp;</td><td>Skyscan, Belgium</td><td>v.1.6.8</td><td></td></tr><tr><td>CTan software</td><td>Skyscan, Belgium</td><td>v.1.12</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial Animal Health Ltd, UK</td><td>AP/Drugs/220/96</td><td>100% 吸入蒸気, 液体</td></tr><tr><td>医療用酸素</td><td>BOC Medical, UK</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Vetergesic</td><td>Alstoe Animal Health Ltd, UK</td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>1% リグノカイン</td><td>Hamlen Pharmaceuticals, UK</td><td>LD1010</td><td>10 ml アンプル</td></tr><tr><td>EMLA クリーム</td><td>Astra Zeneca, 英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pentobarbital</td><td>Ceva Animal Health Ltd, 英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Diet</td><td>Research Diets, USA</td><td>D12079B</td><td>0.2% コレステロール</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma UK</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン (粘液)</td><td>Leo Laboratories, UK</td><td>PL0043/003GR</td><td>250,000単位</td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン</td><td>シグマ、英国</td><td>HT501128</td><td>10%</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR BDH Prolabo、英国</td><td>20821.33</td><td>アブソリュートAnalaR&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen, UK</td><td>16020050</td><td>低融点</td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>113v</td><td>Whatman</td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>Henkel, UK</td><td>4304</td><td>Loctite</td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>Sigma, UK</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma, UK</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR BDH Prolabo, UK</td><td>20856.296</td><td>100%</td></tr></tbody></table>

発生と光学投影トモグラフィを用いたマウスにおける動脈病変の3次元定量

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

適切な動物モデルにおける血管病変の発生と分析は、病変形成の病因と新しい治療法の作用に関する重要な情報を生成し、心血管疾患の研究の基礎となるものです。アテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウス、病変の誘発、および食事の変更の外科的方法の使用は劇的に病気の開発や新たな治療の電位に寄与する機構の理解を向上させました。 古典的には、病変の分析は、2次元の組織学的技術を用いてex vivoで行われます。この記事では、動脈病変の3次元定量に光学投影トモグラフィ（OPT）の適用を説明しています。この技術は非破壊的であるので、標準的な組織学的および免疫組織化学的分析の補助として使用することができます。 新生内膜病変はマウス大腿芸術のワイヤー挿入または連結により誘導されましたアテローム性動脈硬化症の病変ながらERYは、アポE欠損マウスにアテローム発生食餌を投与することによって生成しました。 病変は、相補的な組織学的および免疫組織化学的分析に続いて自家蛍光発光のOPTイメージングを用いて調べました。基礎となる血管壁から明確に区別病変をOPT。病変サイズは、病変体積と最大断面積の計算を可能にする、面積測定を用いて、2次元の項で計算しました。 OPTを使用して生成されたデータは、技術の精度および解析の従来の方法を（むしろ代替以上）補体としての可能性を確認し、組織学を用いて得られた測定値と一致しました。 この作品は、アテローム性動脈硬化症および新生内膜病変を画像化するためのOPTの可能性を示しています。これは、血管リモデリングのルーチン3次元定量化のための迅速な、多くの必要なex vivoでの技術を提供します。

予備の健康な（非損傷）は、マウスの大腿動脈のスキャン（N = 5）は、送信イメージングは​​有用な画像を提供しなかったことを実証しました。これは、放出された信号のない吸光度/散乱がないので、これは、発光イメージングのために有益である、送信imaging.Howeverすぎ透明になってきてクリア動脈の結果（というよりも、あまりにも不透明）でした。対照的に、大腿動脈（14エラスチン410 nmの励起ピークと一致）405から445 nmでの励起後の最大の信号と、放射チャネルに強くautofluoresce。これらの画像から再構成2次元スライスが明らかに内腔と外膜と内腔からメディアを区別しました。 ワイヤ·28日後に回収し、マウスの大腿動脈に（N = 6）またはligation-（n = 5）を誘起損傷の新生内膜肥厚は、非放射断層突起（ 図3A）で明らかでした。再構成された2-dimensでionalスライス、同心の新生内膜病変は、それらの弱い発光（ 図3Bおよび図S1）によりメディアから区別することができました。 アテローム性動脈硬化症のマウスからのOPT発光大動脈弓の全載標本の画像とその主要な枝（N = 8）、予想される解剖学的分布と同定した病変（ すなわち 、大動脈弓、腕頭動脈、および起源の小弯で左頸動脈および左鎖骨下動脈（ 図4A）の断面像は、これらが（ 図4Bは、S2とS3の図 ）は、典型的には、偏心性病変であり、容易にメディア内腔から区別することを示しました。 OPT以下の組織学的分析のための処理動脈は正常組織学的（米国クローム、PICRを使用して染色した切片で、OPTの非破壊特性を確認しましたosirius赤）および免疫組織化学（α-SMA、マック-2）技術（ 図3Cおよび図4C）。 OPTを使用して、病変の大きさの測定は、同じ動脈11から採取した組織切片の画像解析を用いて得られた測定値と一致することが示されています。 ワイヤ·（R 2 = 0.92）とライゲーションによって誘導される（R 2 = 0.89）、新生内膜病変およびアテローム性動脈硬化プラーク（R = 0.85 2）のためのOPTおよび線形回帰によって密接に相関して組織学によって得られた病変領域の面積測定測定。 OPTの重要な利点は、3次元解析を可能にする能力です。この技術を用いて病変の体積定量化の開発により、我々は、ワイヤ·に病変ボリュームを記録することができました（0.1100±0.0091ミリメートル3であり; n = 6）および連結損傷大腿動脈（0.0200±0.0089ミリメートル3; n = 5）で、また、アテローム性動脈硬化症の腕頭動脈の（0。180±0.018ミリメートル3。 N = 8）。測定は、再現性の高い（それぞれ5.4％の変動係数は、11.4％及び4.8％、N = 4）であった病変のすべてのタイプの。ワイヤ損傷血管における新生内膜病変は、前者によって被害の大きい程度と一致して連結することにより製造されたものよりも大きく（P &lt;0.0001）でした。 生成されたデータは、（ 図を参照してくださいS1 - S3）病変プロファイル（ 図5）のように表され、ダイナミックな、定性的な評価のためにレンダリングすることができました。このアプローチは、明らかに異なる負傷手順に応じて、病変形成の程度を実証し、損傷した血管に病変形成の偏在を強調しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig1.jpg" /> 図1：マウスの大腿動脈に病変形成を開始するための方法＆＃。160は、膝窩動脈における動脈切開によって、大腿動脈内にガイドワイヤ、血管形成術の（A）逆行挿入損傷および内皮の除去を伸ばすために応じて病変の形成を刺激します。血流は、血管の損傷した部分の上に再確立されます。血流に対する腔内ストレッチ、裸地や中断の非存在下で、（B）新生内膜増殖は、大腿骨または大腿動脈の分岐部のすぐ遠位膝窩動脈のいずれかを連結することにより誘導することができます。 （C）より重篤な非denuding傷害/増殖応答は、一般的な大腿動脈の分岐点を横切って大腿膝窩動脈と動脈の両方を連結することにより誘導することができます。この技術は、大腿動脈の遠位部の血流を遮断します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig2.jpg" /> 図2：マウスの大動脈弓におけるアテロームの特性堆積アテローム性動脈硬化症を起こしやすい（Apolipopotein E欠損マウス）は12週間高コレステロール西洋食を与え、大動脈弓とその主要な枝病変沈着の特徴的なパターンを開発しています。示されるように、病変は、大動脈弓、腕頭動脈内、解剖顕微鏡下で肉眼検査によって、可視（矢印）は、左頸動脈および左鎖骨下動脈の小孔です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig3.jpg" /> 図3：左大腿動脈の結紮後損傷形成 （明瞭性を高めるために反転-暗い領域は、より強い発光に対応する）（A）非断層蛍光発光画像内膜肥厚の同定を可能にする（赤arrowhe広告）。 （B）個別の血 ​​管領域および内腔は、断層再構成に区別することができます。 （C）組織学的分析（アメリカ合衆国のトリクローム）OPTを使用して得られた画像との明確な類似点を強調しています。 （AC）におけるスケールバーは200ミリメートルです。カークビーらから適応。（AC）11スケールバーは200μmです。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig4.jpg" /> 図4：アテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスの大動脈弓におけるアテロームのイメージング（A）アテローム（赤矢じり）が非断層画像に容易に明らかである（より暗い領域は、このように透明性を向上させる、より強い発光を示すように反転）大動脈弓の、サイト内で（図2を参照）、光学顕微鏡下での検査によってアテロームベアリングと予測。 （B）は、分布のこのパターンは、断層CRで確認されていますOSS-セクション。 （C）組織学的（アメリカ合衆国トリクローム）染色は、断層のセクションと密接な類似性を示しており、いくつかの異なる抗体を用いた免疫組織化学は、病変分析の伝統的なアプローチとOPTの補完的な性質を強調しています。 （A-B）中のスケールバーは1mmです。 （C）中のスケールバーは250μmです。 RSA、右鎖骨下動脈。 RCA、右頸動脈。 LCA、左頸動脈。 LSA、左鎖骨下動脈、 BCA、腕頭動脈; AAO、大動脈を昇順。 DAOは、下行大動脈。カークビーらから適応。11 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig5.jpg" /> 図5：病変およびルーメンプロファイルの分析は、動脈損傷の異なる方法に応じて、新生内膜増殖の変化する範囲を示す光学投影断層撮影法は、病変内腔が断面measuremenを渡ることができます。TSは、大腿動脈に沿った距離に対してプロットします。合計ライゲーション（C）は 、ライゲーションの部位で完全な閉塞を生じさせるが、病変が動脈に沿って遠くに延びないのに対し、これは明らかに、無傷の動脈（A）と比較して、部分的なライゲーション（B）が小さく、比較的離散的な病変を生成する、ことを実証します。腔内ワイヤー損傷（D）は、ほぼ完全に試料の先端部を閉塞し、動脈のスキャン区間の全長に沿って延びている病変を生成します。カークビーらから適応。11 結紮損傷後のマウス大腿動脈から得られた断面画像の図S1。アニメーションの再構築。動画像のこのタイプは、定性的および定量的分析に有用です。アニメーションが動脈の遠位セクションの近位から閉塞性新生内膜の緩やかな発展を移動すると、ディスクルーメンとメディアからernibleは、容易に明らかです。側枝を容易に識別することができ、明らかな管腔閉塞およびサイズ​​の病変が増加するにつれて、動脈の外向きのリモデリングがあります。連結のサイトに到達すると、血管の完全な閉塞が発生します。カークビーらから適応。11 。。（ -最初に表示される左）と降順（右）大動脈図S2アテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスの大動脈弓の断面画像のアニメーションの再構築がアニメーションが昇順の断面で開始します。小さな病変は、大動脈弓の方向に走査移動すると、上行大動脈に表示されます。画像は腕頭（左）、左頸動脈（中央）、左鎖骨下（右）動脈の重く病変小孔を示すためにアーチを通って移動します。スキャンは、最初のSUBCで、病変は徐々に減少し、消えこれらの枝に沿って遠位に移動するとlavian動脈、頸動脈、その後で、最終的に腕頭動脈で。興味深いことに、この容器などの分流器の上に腕頭動脈を移動中の病変が右頸動脈と右鎖骨下動脈に分かれます。カークビーらから適応。11 図S3。アニメーション、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスの大動脈弓のボリュームレンダリング画像。光学投影断層撮影法は、アポリポタンパク質E欠損マウスの大動脈弓における病変分布を実証し、この場合には、3次元画像の生成を可能にします。 （A）アテローム（左頸動脈と鎖骨下動脈の心門にと大動脈弓の小弯に、腕頭動脈を通して）期待のサイトに存在しています。元の画像に重ねたときに（B）病変のセグメンテーションとレンダリング（赤で表示）の断面を有するプラークの分布を強調しています。カークビーらから適応。11

心血管疾患の動物モデルからの動脈病変のEx vivo分析は、古典的に組織学的および免疫組織化学的技術に依存しています。これらは、3次元病変の2次元測定を提供します。この原稿では、光学投影断層撮影法を使用して3次元で定量分析するための動脈病変の生成について説明します。

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

本手順の全体的な目的は、マウスにおける動脈硬化病変および新生内膜病変の可視化と3次元定量化に、光学投影トモグラフィーがいかに利用できるかを実証することです。これは、まず手術的に、あるいは動脈硬化を発症しやすい素因を持つマウスに高コレステロール食を投与することによって、マウスに動脈病変を形成させることで達成されます。次のステップでは、標的となる動脈を単離し、光学投影トモグラフィーを用いてスキャンします。最終ステップは、画像の再構成を行い、病変を特定し、病変の体積を測定することです。最終的に、画像解析を通じて、病変の解剖学的再構成、および病変体積と動脈狭窄の定量化の結果を得ることができます。私たちの研究グループは、心筋梗塞や脳卒中などの生命を脅かす合併症につながる動脈狭窄を引き起こす病変の形成メカニズムの解明に取り組んでいます。光学投影トモグラフィーのこの応用は、当グループのNicholas Kirkby博士がLucy Lowe博士と共に開発したものであり、本ビデオでは当研究室のポストドクターであるJung Shi Wu博士が実演します。組織学や免疫組織化学などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、手間が少なくて済み、2次元ではなく3次元的な解析が可能であることです。大腿動脈病変を誘発するためのこの手法は、RらおよびSadaらによる手法を改変したものです。本テキストプロトコルでは、食事操作によってアテローム性動脈硬化病変を誘発する方法について説明します。体重25〜30 gの10〜12週齢のC57BL/6マウスを用いて開始します。麻酔後、マウスを温熱パッドの上に置き、体温を維持しながら、ノーズコーンを介して2〜3%のisofluorineを投与します。マウスが足趾へのピンチ刺激に反応しなくなったことを確認した後、ブプレノルフィンを0.1 milligrams per kilogramで投与します。次に、マウスを仰臥位にし、左後肢の腹側を剃毛します。その後、切開を行い、膝窩動脈の分枝点から腹壁までの間の後肢上部の筋肉を露出させます。処置全体を通して、鈍的剥離を行い、大腿神経を大腿動脈および大腿静脈から分離します。組織は1% (w/v) の canine 液で湿らせて保持してください。次に、腹壁に近い位置と、膝窩動脈への分枝の直下の2箇所に、大腿動脈と大腿静脈を囲むように 6.0 Mers 絹糸で一時的な結紮を行います。これらは血流を制御するためのものです。次に、大腿動脈からの分枝より2〜5 mm末梢側で膝窩動脈を単離し、膝窩動脈の下方で結紮します。2つ目の結紮線を配置します。次に、大腿動脈との分岐点直後の膝窩動脈に、ガイドワイヤー挿入用の小さな切開を加えます。切開部から大腿動脈を通り腹壁側へ出血することを防ぐため、近位側の一時結紮を圧迫します。0.014 inch G ワイヤーを約1〜1.5 cm挿入します。そのまま30秒間保持した後、取り除きます。次に、結紮糸を用いて、切開部より近位の膝窩動脈を結紮します。この際、大腿動脈を閉塞させないよう注意してください。次に、一時的な結紮糸を除去します。5.0 Mercalを用いて、不連続走行縫合で創傷を閉鎖します。その後、EMLAクリームを塗布します。動物をリカバリーケージに入れ、意識と運動機能が回復したことを確認してからホームケージに戻します。脚に2〜3日間跛行が見られることが予想されますが、そのためBecauseにマウスを隔離する必要はありません。OPTを行う場合は、ペントバルビタールで終末麻酔を導入し、マウスを安楽死させてください。次に、採血を伴う経心腔灌流固定を行います。続いて、大腿動脈または大動脈弓とその分枝を単離します。その際、不要な周囲組織を除去してください。その後、組織を10%中性緩衝ホルマリンで一晩固定します。翌日、組織を70%エタノールで保存するか、またはろ過済みの1.5%LMP aerosに動脈を包埋させます。組織を約40 °Cの溶融したaerosにゆっくりと浸します。エアロゾルをトリミングして円錐形にします。次に、この調製物を100% methanolで少なくとも12時間脱水します。脱水後、benzo alcoholとbenzo benzoateを1:2の割合で混合した溶液で血管を透明化します。容器をこの溶液中で12〜24時間インキュベートします。翌日、あらかじめ校正しておいたトモグラフに、透明化処理済みのサンプルをロードします。解像度は1024に設定します。1024ピクセルに設定してください。関心領域の倍率を設定します。Z軸は自動的に同じ解像度に設定されます。ボクセルサイズは約200 micronsになります。次に、明視野チャンネルを用いて、試料が視野の中心で自転するように配置します。GFPフィルターの放出チャンネルを使用して、ピントを合わせ、画像のダイナミックレンジが最大になるように露光時間を調整します。過飽和を避けてください。次に、0.9度のステップでGFPの1つのエミッションチャンネルのみを用いて容器をスキャンします。その後、サンプルを100% methanolに戻し、パラフィン包埋を行う前に少なくとも24時間静置してください。組織学的解析を行うため、データビューアソフトを用いてn reconソフトウェアまたは同様のソフトウェアで取得した画像を開きます。画像再構成の品質を確認し、画質の改善と画像強度の調整を行い、サンプルが理想的な回転軸からずれている場合は、ソフトウェアでその位置ずれを補正します。各スキャンについて、病変を含む垂直方向の関心領域（ROI）を設定します。50スキャンラインごとに、中膜と内弾性板の境界をトレースします。その後、ソフトウェアを用いて他のすべてのスキャンの境界を補間し、これらの補間結果を手動で確認して、必要に応じて修正します。これで、白色ピクセルが新生内膜を、黒色ピクセルが開存腔を表すバイナリ画像セットを作成します。これは強度しきい値を定義することによって達成されます。これが完了すると、オブジェクト体積が総病変体積となり、管腔体積は総体積からオブジェクト体積を差し引いたものとなります。これにより、軸方向に沿った病変と管腔の分布が評価されます。ワイヤー誘発または結紮誘発による損傷から28日後に、マウス大腿動脈を採取した。再構成された2次元スライドのエミッション投影画像において、新生内膜の肥厚が認められた。同心円状の新生内膜病変を識別することができた。APOE欠損マウスの大動脈弓全体の光学投影トモグラフィー放出画像により、大動脈弓の小弯、腕頭動脈、および左総頸動脈と左鎖骨下動脈の起始部において、予想される病変が特定されました。同一の病変をセグメンテーションし、赤色でレンダリングしました。元の画像に重ね合わせた際のプラークの分布を強調するため、断層画像において中膜と内腔を区別し、これらが偏心性病変であることを示しました。ここで、スキャンがこれらの分枝に沿って末梢方向へ移動するにつれて、病変は徐々に減少し、まず鎖骨下動脈で、次に頸動脈で、そして最後に腕頭動脈で消失します。興味深いことに、腕頭動脈内のこの病変は、この血管が右頸動脈と右鎖骨下動脈に分かれる部位である血流分流点へと移動します。OPT処置の後、病変の組成は何かという追加の疑問に答えるために、組織学や免疫組織化学などの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、血管研究分野の科学者が、内膜新生およびアテローム性動脈硬化病変の形成における内皮受容体、レクチン、およびステロイド代謝酵素の役割を調査する道が開かれました。このビデオを視聴することで、光学投影トモグラフィーを用いて頚動脈から病変を採取し、解析する方法について十分に理解できるはずです。

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Medicine

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