発生と光学投影トモグラフィを用いたマウスにおける動脈病変の3次元定量

この手順の全体的な目標は、光学投影断層撮影法を使用して、マウスのアテローム性動脈硬化症および新内膜病変の視覚化と 3 次元定量を行う方法を実証することです。これは、最初にマウスに動脈病変を生じさせることによって、外科的に、またはアテローム性動脈硬化症を発症する素因のあるマウスに高コレステロール食を与えることによって達成されます。次のステップは、目的の動脈を分離し、光学投影断層撮影を使用してスキャンすることです。

最後のステップは、画像の再構成を行い、病変を特定し、病変の体積を測定することです。最終的に、結果は病変の解剖学的再構成と、画像分析による病変体積と動脈狭窄の定量化を示すことができます。私たちのグループでは、動脈狭窄を引き起こし、心臓発作や脳卒中などの生命を脅かす合併症を引き起こす病変の形成の根底にあるメカニズムを理解することに興味を持っています。

この光学投影トモグラフィーの応用は、私たちのグループでNicholas Kirkby博士とLucy Lowe博士によって開発されましたが、私たちの研究室で働くポスドク科学者であるJung Shi Wu博士によって実証されます。この手法が組織学や免疫組織化学などの既存の方法よりも優れている点は、労働集約的ではなく、2次元ではなく3次元の分析が可能であることです。大腿動脈病変を誘発するこの技術は、R and company と Sada and company の技術から変更されています。

テキストプロトコルは、食事操作によってアテローム性動脈硬化性病変を誘発する方法を説明しています。まず、10〜12週齢のC 57ブラックシックスマウス(体重25〜30グラム)から始めます。麻酔をかけたら、マウスを温かいパッドの上に置いて体温を維持し、ノーズコーンを介して2〜3%のイソフッ素を供給します。

マウスがつま先のつま先に反応しない場合は、ブプレノルフィンを1キログラムあたり0.1ミリグラムで投与します。.次に、マウスを仰向けにして、左後肢の腹面を剃ります。次に、膝窩動脈の分岐部と腹壁の間の後肢上部の筋肉を露出させるために切開を行います。

手順全体を通して、大腿神経を大腿動脈と静脈から分離するために、鈍い解剖を行います。ティッシュを体積の1%のli犬歯で湿らせてください。次に、腹壁の近くと膝窩動脈のある枝のすぐ下にある大腿動脈と静脈の周りに一時的な6.0 Mersシルク結紮糸を配置します。

これらは血流を制御するためのものです。次に、大腿動脈のある枝から2〜5ミリメートル離れた膝窩動脈を分離し、膝窩動脈の下に膝窩動脈を結紮します。2 番目の合字を配置します。

次に、大腿動脈のある枝のすぐ遠位にある膝窩動脈にワイヤーを挿入するための小さな切開を行います。近位の一時的な結紮糸に圧力をかけて、切開部から大腿動脈に出血して腹壁に向かって出血するのを防ぎます。0.014インチのG線を約1〜1.5センチ挿入します。

30秒間そのままにしてから取り外します。次に、結紮糸を使用して、切開部の上の膝窩動脈を結紮します。大腿動脈を閉塞させないように注意してください。

次に、一時的な合字を削除します。5.0メルカルを使用して不連続ランニング縫合糸で傷を閉じます。次に、EMLAクリームを塗ります。

動物をホームケージに戻す前に、回復ケージで意識と動きを取り戻すのを待ちます。脚は2〜3日間跛行を示すと予想されますが、これはマウスを隔離する必要があるという意味ではありません。OPTの場合、マウスは安楽死させ、ペントバルビタールから終末麻酔を誘発する必要があります。

次に、放血を伴う経心灌流固定を行います。次に、大腿動脈または大動脈弓とその枝を分離します。プロセスで無関係な周囲材料をすべて取り除きます。

次に、組織を10%中性緩衝ホルマリンに一晩後置します。翌日、組織を70%エタノールで保存するか、ろ過された1.5%LMPエアロに動脈を埋め込むことによって進行します。組織を約40°Cで溶融したエアロスに静かに下げます。

エアロをトリミングして円錐形にします。次に、この調製物を100%メタノールで少なくとも12時間脱水します。脱水状態になったら、ベンゾアルコールとベンゾ安息香酸の1〜2つの混合物で血管を透明にします。.

容器をこの溶液で12〜24時間インキュベートします。翌日、透明化したサンプルを断層撮影器にロードし、事前に校正する必要があります。解像度は 1024 に設定されています。

1024 ピクセル単位。対象領域の倍率を設定します。Z軸は自動的に同じ解像度に設定されます。

ボクセルサイズは約200ミクロンになります。次に、明視野チャネルを使用して、サンプルが視野の中心で自身の軸を中心に回転するようにサンプルを配置します。GFP One Filter Emission Channelを使用して、フォーカスを設定し、露出を調整して、画像のダイナミックレンジを最大化します。

過飽和は避けてください。次に、GFPの1つの発光チャネルで容器を0.9度ステップのみでスキャンします。その後、サンプルをワックスに埋め込む前に、少なくとも24時間100%メタノールに戻す必要があります。

組織学的解析を行うには、取得した画像をデータビューアソフトウェアを使用して、n偵察ソフトウェアまたは同様のソフトウェアで開きます。画像再構成の品質を確認し、画質を向上させ、画像の強度を調整し、ソフトウェアにサンプルの理想的な回転軸からのずれを補正させます。スキャンごとに、病変を含む関心のある垂直領域を定義します。

50 本目のスキャンラインごとに、メディアと内部弾性ラミナの位置との間の境界をトレースします。その後、ソフトウェアは他のすべてのスキャンで境界を補間し、これらの補間を手動でチェックし、必要に応じて修正できます。次に、新内膜を表す白いピクセルとパテントルーメンを表す黒いピクセルを持つバイナリ画像セットを作成します。

これは、強度のしきい値を定義することで実現されます。これが完了すると、物体体積は総病変体積であり、管腔体積は総体積から物体体積を差し引いたものです。したがって、軸方向の長さに沿った病変および内腔の分布が評価される。

マウス大腿動脈は、ワイヤー誘発または結紮誘発損傷の28日後に採取されました。新内膜の肥厚は、再構築された2次元スライドの発光投影で明らかでした。同心円状の新内膜病変を区別することができました。

APOE欠損マウスからの大動脈弓全体の光学投影断層撮影発光画像は、大動脈弓の小曲率、腕頭動脈、および左頸動脈と鎖骨下動脈の起源で予想される病変を特定しました。同じ病変をセグメント化し、赤でレンダリングしました。元の画像に重ね合わせたときのプラークの分布を強調するために、メディアと内腔を断面画像で区別し、これらが偏心病変であることを示すことができました。

ここでは、スキャンがこれらの枝に沿って遠位に移動すると、病変は徐々に減少し、最初に鎖骨下動脈で、次に頸動脈で、最後に腕頭動脈で消えます。興味深いことに、腕頭動脈のこの病変は、この血管が右頸動脈と右鎖骨下動脈に分かれるときに、フローディバイダーに移動します。OPT手順に続いて、病変の組成が何であるかなどの追加の質問に答えるために、組織学や免疫組織化学などの他の方法を実行できますか?

そのため、その開発後、この技術は、血管研究の分野で働く科学者が、新内膜およびアテローム性動脈硬化症の発症における内皮受容体、レクチン、およびステロイド代謝酵素の役割を調査する道を開きました。このビデオを見た後、光学投影断層撮影法を使用してライン動脈から病変を取得および分析する方法を十分に理解しているはずです。