微細藻類中の脂肪酸含量および組成の分析

この手順の全体的な目的は、微細藻類における総脂肪酸含量および組成を測定することです。これは、まず既知量の凍結乾燥藻類バイオマスを含む試料を調製することによって達成されます。次のステップは、微細藻類バイオマスを破砕することです。

次に、親油性成分を抽出および単離します。最終ステップは、ACell脂質を脂肪酸メチルエステルに転移エステル化することです。最終的に、ガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸を定量します。

トリクロロメタン（tric）測定などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、非常に精度が高く、すべての脂肪酸およびその他の親油性成分を特異的に測定できる点にあります。本手順のデモンストレーションは、当研究室の技術者であるNDI Aferが行います。この手順を開始する前に、記載されている参考文献の詳細に従い、培養液中の藻類乾燥重量濃度（g/L）を決定してください。藻類乾燥重量が5〜10 mg含まれる量の培養液を、ガラス製遠心チューブに移します。

previously 決定したバイオマス濃度を用いて、移送するバイオマスの正確な量を算出します。サンプルを 1200 Gs で 5 分間遠心分離します。上清の一部を廃棄し、チューブ内に約 0.25 milliliters を残します。次に、ペレットをピペッティングで緩やかに混ぜて藻類を残り上清に再懸濁させ、細胞混合液をビーズミル用チューブに移します。

200 µL ピペットを用いて、遠心チューブとピペットチップを ±0.15 mL の Milli-Q 水で洗浄し、その液体をビーズミルチューブに移します。ビーズミルチューブを最大 RPM で1分間遠心分離し、チューブの底に気泡が残っていないことを確認します。完了後、チューブ内の材料を以下に従って凍結乾燥させます。

クロロホルムとメタノールの強化体積比で、50 mg/Lのtrip Penta Deano溶液を調製します。ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、1 mLのtripod, no溶液をビーズビーターチューブに加えます。チューブのビーズが漏れる原因となるため、ビーズビーターチューブのキャップ内にビーズが残っていないことを確認してください。

ビーズビーターチューブを2,500 RPMで8回、各回60秒間処理し、各処理の間には120秒の間隔を設けます。次に、ビーズビーターチューブ内のビーズおよび溶液を、テフロン製インサート付きスクリューキャップを備えた清潔な耐熱性15 mLガラス遠心チューブに移します。ビーズビーターチューブを1 mLのトリプロン溶液で洗浄し、その洗浄液をガラス遠心チューブに移します。

この操作をさらに2回繰り返します。サンプルを5秒間ボルテックスし、その後10分間超音波処理します。超音波処理後、50 mM Trisおよび1 M NaClを含むpH 7のミリキュー水溶液 2.5 mLを遠心チューブに加えます。

サンプルをボルテックスし、2回目のソニケーションを行った後、1200 ×gで5分間遠心分離します。終了後、ガラスパステールピペットを用いて、底層のクロロホルム相を慎重に清潔なガラスチューブに移し、1 mLのクロロホルムで抽出を繰り返します。完了後、ガラスパステールピペットでクロロホルム相を回収し、最初のクロロホルム画分と合わせて回収します。

窒素ガス流を用いてクロロホルムを蒸発させ、抽出した脂質を乾燥させます。次に、乾燥させた抽出脂質が入ったチューブに5%硫酸を含むメタノール3 mLを加え、しっかりと密閉します。サンプルを5秒間ボルテックスします。

サンプルをブロックヒーターを用い、70 °Cで3時間インキュベートします。定期的にサンプルが沸騰していないことを確認し、確認後には毎回チューブをボルテックスします。サンプルが室温まで冷却されたら、3 mLのMilli-Q水と3 mLのn-ヘキサンをチューブに加え、ボルテックスで混合します。

試験管回転ミキサーを用いて、サンプルを15分間撹拌します。試験管回転ミキサーからサンプルを取り出した後、1200 Gsで5分間遠心分離します。ガラス製パステールピペットを使用して、上層のヘキサン相を2 mL採取し、新しいガラス管に移します。採取したヘキサン相を洗浄するため、ガラス管にmilli Q水を2 mL加えます。

次に、サンプルを5秒間ボルテックスし、5分間遠心分離します。1200 Gsで、ガラス製パステアピペットを用いてガラス管からヘキサン相をGCバイアルに回収します。その後、溶媒の蒸発を防ぐため、GCバイアルにキャップを閉めてしっかりと締め付けます。

サンプルバイアルをGC fit装置のオートサンプラーにセットします。最後に、新しいキャピラリーカラムを用い、全流量20 milliliters per minute、注入量1 µLの条件で装置を用いてサンプルを分析します。カラムの仕様およびクロマトグラフィー条件については、テキストプロトコルを参照してください。

このプロセスを通じて得られる典型的なクロマトグラムをここに示します。脂肪酸メチルエステルはGCカラムによってサイズと飽和度に基づいて分離され、本プロトコルでは鎖長の短い脂肪酸および飽和度の高い脂肪酸ほど保持時間が短くなります。使用したGCカラムおよびプロトコルは、脂肪酸の異性体を分離することを目的としていませんが、異なるGCカラムとプロトコルを使用することで分離が可能です。

窒素十分および窒素欠乏の両条件下におけるC Desus UEX 3 93の脂肪酸含有量と組成をここに示します。全脂肪酸含有量は、窒素充足培養条件下で8.6 ± 0.5%、窒素欠乏培養条件下で44.7 ± 1.7%でした。これらの値は、脂肪酸の組成と含有量が窒素飢餓の影響を強く受けることを示しています。

ESBLにおいて、パルミチン酸とオレイン酸は最も含有量の多い2つの脂肪酸です。脂肪酸含有量および組成の算出方法の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。窒素十分条件および窒素欠乏条件におけるOdum Trico UEX 6 4 0の脂肪酸含有量と組成をここに示します。

斜めのUUと同様に、脂肪酸の含有量および組成は窒素飢餓の影響を強く受けます。窒素十分条件下および飢餓条件下における全脂肪酸含有量は、それぞれ11.7 ± 0.9%および30.5 ± 1.1%でした。P triumはまた、I csapやPenta IC acidなどの高度に不飽和な脂肪酸を相当量生成します。

さらに、リグニサート酸などの極長鎖脂肪酸も本手法で検出可能です。本手順は、脂質抽出とエステル交換反応の間に脂質凝集物の分離ステップを追加することで拡張でき、プロトコル本文の参考文献に記載されている通り、マイクロLGの脂質クラス組成に関するさらなる知見を得ることができます。