Name: リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 学ぶレシオメトリックGFPバイオセンサーを用いたリビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPの測定法。リアルタイムでサブセルラー分解能を持つミトコンドリア機能モニタリングが可能です。

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この作品はHHMI 56006760から（GM45735、JDV、DMAWに国立衛生研究所（NIH）（2 TL1 RR 24158から6）、およびエリソン医療財団（AG-SS-2465）およびNIHからの賞によってサポートされていましたLPへGM45735S1とGM096445）。 GM45735S1は、2009年のアメリカの回復と再投資法の下でNIHから発行されました。これらの研究に用いられる顕微鏡はNIH / NCIの助成金（5 P30 CA13696）を通して部分的にサポートされていた。

1。バイオセンサーと酵母細胞の形質転換<ol><li>酢酸リチウム法27を用いたプラスミドベアリング水戸roGFPまたはmitGO-ATeam2で希望の酵母株を変換します。 </li><li>プラスミド媒介バイオセンサーとの変換を確認するために、プラスミドの損失を防ぐために、選択し、適切な選択的な合成完全培地（水戸roGFP用SC-浦、またはmitGo-ATeam2用SC-レイ）で形質転換体を維持します。蛍光プローブは、ここで説明したものとは異なるプラスミドにサブクローニングされている場合は、適切な選択培地を使用する。彼らは蛍光バイオセンサーを表現していることを確認し、正常なミトコンドリアの形態を示すように、蛍光顕微鏡で形質転換体を可視化する。 </li></ol> 2。イメージングのための細胞および準備の成長細胞機能および薬物治療に対する応答は、細胞密度および代謝活性に大きく依存している。最良の結果が得られた場合細胞（ - 1×10 7細胞/ ml半ば対数期、〜0.5）活発に分裂している。一貫性のある密度の中間対数期文化を生成するための最も信頼性の高い方法は、定常期前培養から接種することです。 <ol><li>定常期前培養の準備：プレートから形質転換細胞の単一コロニーを選択し、選択的な液体培地（50ミリリットルコニカルボトムチューブ5 ml）を接種。 600nmの（OD 600）での文化の光学密度がプラトー（24〜48時間）に達するまで、225 rpmで振とうしながら30℃で成長する。 </li><li>観察用半ば対数期の文化を準備：50 mlコニカルボトムチューブに選択培地を5mlに接種し前培養の適切なボリュームを使用しています。 YPD培地は自家蛍光であり、これらの研究のために使用すべきではありません。合成が完了すると、グルコース基づき、ドロップアウト（SC-浦）メディアを使用してください。 （ - 1×10 7細胞/ ml〜0.5）は、半ば対数期に到達するまで、4-16時間、225 rpmで振盪、30℃で細胞を成長させる。細胞密度を決定することができるOD 600を測定することにより、正確な読み取り値OD 600を決定するために分光光度計を較正する。当社ベックマンDU530（INベックマン·コールター、インディアナポリス、）では、中期対数期は0.1〜0.3のOD 600に対応しています。 </li></ol>水戸roGFP1代謝変化に反応して細胞小器官で感知する変動。たとえば、酵母が発酵性炭素源（ 例えば 、グルコース、SCメディアのように）と非発酵性炭素源（ 例えば 、グリセロール、SGlycメディアのように）で、さらには同じものの別のバッチで育つときミトコンドリアの酸化還元状態が変化し、このアッセイにおいてメディア。したがって、すべての実験のためのメディアの同じバッチを使用しています。 <ol start="3"><li>まだ処理が実行されていない場合、細胞は、濃度の準備ができて（ステップ2.4​​を参照）及び結像ある。細胞が治療を受けている場合は、適切な治療で細胞をインキュベートし、次のステップに進みます。 </li><li> 15秒間6,000×gで遠心分離により培養液1mlを集中し、メディア20μlの中の細胞ペレットの再懸濁。これらの条件は、視野内の識別可能なセルの数を最大化します。 </li><li>スライドに再懸濁した細胞2μlのを適用します。カバースリップ（第1.5、好ましくは、高パフォーマンスの170±5μmの厚さ）でカバー、クリアマニキュアまたはvalap（試薬を参照）でカバースリップの端をシールします。 valapで密封する、ブンゼンバーナーの炎の上に保持することによって金属へらで少量を溶かし、その後、カバースリップの端に沿って少量を広げた。 </li><li>撮影中に30℃で細胞を維持します。イメージングのために使用される100倍油浸レンズで客観ヒーターは、このアプリケーションに適しています。これらの条件、ミトコンドリアの形態、レドックス状態とATPレベルの下で10〜15分間の撮影中に変更されないままです。 </li></ol> 3。イメージングセットアップ<ol><li>広視野蛍光顕微鏡でイメージング水戸roGFP1のセットアップ ここでの手順はAxioObseに合わせて調整されコリブリLED励起源を備えrver.Z1顕微鏡、広視野オルカERカメラやAxioVisionの取得ソフトウェア。水戸roGFP1酸化のチャンネルと光変換の両方で退色は、水銀アーク灯照明（下記参照）に比べてLED照明を使用して大幅に減少します。 信号と解像度を最大にするために、客観的に可能な限り最高の開口数、十分な空間分解能を提供する最小の倍率を使用しています。また、水戸roGFPイメージングのため、目標は365 nmでよく送信することを確認します。 100x/1.3NA EC PlanNeofluar対物レンズ（ツァイス）は、このアプリケーションに適しています。 酸化および還元水戸roGFP1種をキャプチャするために取得ソフトウェアを設定します。我々は、次の条件を使用しています。 <ol><li>そのような付属excitatioと38 HEフィルターセット（ツァイス）として、365 nmの（100％電源LED）の励起とGFP適しエミッションフィルタを使用するために酸化水戸roGFPのチャネルを設定するnはフィルタがキューブから削除されます。励起フィルターの除去はこのようにして達成可能な時間分解能を増加させる、フィルタを切り替える必要なしに365 nmおよび470 nmでの励起の両方を可能にする。 </li><li>上述したように、470 nmの（100％電源LED）で励起を使用するように減少水戸roGFP用のチャネルを設定し、同じ発光フィルターキューブは、酸化水戸roGFPに使用。空間分解能を最適化するために、1x1のビニングにカメラを設定してください。 </li><li>各z位置におけるチャネルの両方を収集し、0.5μmの間隔で11スライスから成るAZスタックを取得するために、ソフトウェアを設定します。買収のこのモードでは、順番に各Zスタックを取得するよりも遅いですが、それは酸化および還元チャネルの獲得の間にミトコンドリアの動きから生じるアーチファクトを防ぐことができます。 </li><li>画像いくつかのセルが強くなく、飽和信号を生成し、適正な露光時間を決定する。すべての実験に酸化され、ミト-roGFP1低減するための露光時間の比率を維持することが重要であるS。水戸roGFP1酸化および還元のための露光時間は、それぞれ300および100ミリ秒、ある場合たとえば、その後水戸roGFP1酸化のための露光時間はためには、すべての実験のために水戸roGFPを減少させることを3倍にする必要があります。 </li></ol></li><li>スペクトル共焦点顕微鏡でイメージングmitGO-ATeam2のセットアップ mitGO-ATeam2、GFP（エミッション最大510 nm）をからの蛍光を用いたATPレベルを定量化するためにOFP（発光極大560 nm）をからその区別しなければならない。これらの蛍光プローブが発する蛍光を解決蛍光フィルターセットがあります。しかし、我々は、共焦点顕微鏡をスキャンし、多くのレーザーで利用できるスペクトル検出器は、このアプリケーションに最適に動作することを見つける。スペクトル検出器は、波長に応じて多くのコンポーネント（通常は32以上）に蛍光発光を分離。いくつかの隣接する波長帯域は、一つの画像チャネルに結合することができる。組み合わされる波長は、経験的にそうGからの信号を最大にするように選択されるFPとOFP FRET測定を混乱なる信号の交差は避けながら。利用可能な最高の開口数レンズを使用してください。我々は100x/1.49または60x/1.49のApo-TIRFレンズを使用しています。私たちは、NISの要素ソフトウェアを実行しているニコンA1R共焦点顕微鏡を使用しています。 ATP結合型とATP-結合していないmitGO-ATeam2種をキャプチャするために取得ソフトウェアを設定します。我々は、次の条件を使用しています。 <ol><li>我々のシステム上で0.42程度のAZ解像度に対応して1.0エアリー単位（AU）にピンホールを設定します。 </li><li>画像内の空間情報を最大化するナイキストサンプリング限界に近づくためにスキャンのズームを設定します。我々のシステムではピクセルサイズは0.12μmである。 </li><li>ミトコンドリアは、撮像中に移動することができるので、512×256ピクセルにフィールドをトリミングすることにより、撮像速度を高めるために役立つことができる。我々のシステムの画像1フレームに必要な合計時間は2倍のスキャンの平均を含む、1.0秒です。所望の空間分解能に応じて、フィールドがさらにincreasにトリミングすることができます電子時間分解能を。 </li><li> 488 nmで励起すると、500からの発光を収集 - GFPのために520 nmであり、かつ550〜 - OFPのために580 nmである。実際の最適値は、撮像システムの特性によって変化し得る。 </li><li>我々のシステムに対する最適なレーザパワーが6.0と6.4％の間である。最適なレーザパワーは、各顕微鏡シ​​ステムごとに異なりますが、それでも解釈画像を生成しながら、理想的にはできるだけ低くなる。任意の光学系では、時間の経過とともに通常は発生レーザパワーの変化を監視するために、内部または外部のパワーメータを使用してください。 </li><li>できるだけ多くの細胞などのために、信号を画素値の検出範囲を最大にするしかし飽和を避けるために、検出器利得と照明光の強度を調整する。 1％以上の飽和画素を含む任意の細胞を分析しないでください。イメージには、すべて同じ目的、レーザーパワー、スキャンズームを使用してサンプル、ピクセルサイズ、ゲイン、オフセット。 </li></ol></li></ol> 4。画像収集<ol><li>フォーカルPLAを見つけ<html>蛍光プローブを漂白最小限にするために透過光を使用して目的の細胞のね。 </li><li>興味のある1つまたは複数のセルを配置した後、0.5μmのステップサイズを用いた典型的なセル（約7ミクロン）の全体の深さを通してZシリーズを収集します。 </li><li>画像他のスライド上の目的の細胞が、イメージより長い15分間単一のスライドしない。スライド上で15分後、細胞は生存率を失う。 </li></ol> 5。分析ミトコンドリアATPレベルは510 nmでそれに560 nmでmitGO-ATeam2発光の比率を測定することによって決定される27オルガネラの酸化還元状態はミト-roGFPの（R / O）、酸化比率に減少として測定される; すなわち 365 nmで励起510 nmでの発光で割った470 nmで励起510 nmでの発光。比を計算する前に、我々は、バックグラウンドを差し引き、蛍光ミトコンドリアに属する画素のしきい値を決定する。 10トン&quot;&gt;公共ドメイン（ 例えば ImageJの30）または市販の（ 例えば Volocity、パーキンエルマー）ソフトウェアが水戸roGFP1またはmitGO-ATeam2の分析に使用することができます。画像取得のために、分析のために使用するソフトウェアによっては、画像第解析ソフトウェアでそれらを開く前に、例えばTIFFなど、別の形式に変換する必要があるかもしれない。画像が変換される場合は、画素値を変換中に変更されていないことを検証することが不可欠である。ミト-roGFP1データの解析を用いて両方のプログラムは以下のとおりです。各メニュー内で選択するには、プログラムのメニューとオプションは太字イタリック体で強調表示されています。 5.1 ImageJの分析<ol><li>画像を開くと32ビットにタイプを変更： 画像→タイプ→32ビット。 </li><li>まだ細胞が存在しない領域における関心領域（ROI）を描く。このROIの平均強度を計算します→測定を分析します。 </li><li> プロセス→数学→減算 ：スタックから計算された平均バックグラウンドを減算。 </li><li>減算zスタックを使用して、ミトコンドリアの中央スライスとしきい値を見つける： 画像は→→しきい値を調整し、しきい値ウィンドウで[Apply]をクリックします。スタック内のすべてのスライスに適用されます。 NaNに背景ピクセルを設定し確認してください。 </li><li>比率を作成し、Zスタック： プロセス→画像電卓水戸roGFP1解析用酸化Zスタックによって減少スタックを分割します。 mitGO-ATeam2解析用の510 nmの（ATPの結合していない）画像によって560 nmの（ATP結合型）画像を分割します。 </li><li>関心のある領域の周りにROIを描画します。 →ツール→ROIマネージャーを分析し選択し、ROIを記録するために[追加 ]をクリックします 。複数の領域にマネージャーに格納することができる。 ROIマネージャで、すべてのROIを選択して、[M]を選択します鉱石→すべてのスタックのスライスを測定するマルチ測定。分析のためのスプレッドシートにデータをエクスポートします。 </li></ol> 5.2 Volocity分析<ol><li> Volocityライブラリに画像をインポートして、2チャンネルの画像シーケンスを作成します。 </li><li>まだ細胞が存在しない領域における関心領域（ROI）を描く。選択してください：[ツール]→[比率。 </li><li> ROIから取得 ：バックグラウンドを計算するためにVolocityを使用します。 </li><li>ミトコンドリアの構造を含むようにしきい値を調整します。 </li><li>比チャネルに虹のLUTを適用するオプションをチェックします。強度変調チャネルプレゼンテーション-るためのノイズの少ない画像を生成することがありますが、それは平均的な比率の定量のために使用すべきではありません。 </li><li> 測定タブを選択し、比率のチャンネルを選択して、関心のある領域の周りにROIを描画します。ゼロ値を除いた比率チャネルを測定します。複数の領域を選択して測定することができる同時に。分析のためのスプレッドシートにデータをエクスポートします。 </li></ol>

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利害の衝突は宣言されていない。

ここでは、酵母細胞を生体内でミトコンドリアの酸化還元状態とATPのレベルを評価するためのバイオセンサーとして水戸roGFP1とmitGO-ATeam2を使用する方法について説明します。私たちは、定量的なミトコンドリアの形態や分布や細胞の成長率に明らかな影響を与えることなく、ミトコンドリアを標的にプラスミド媒介水戸roGFP1またはmitGO-ATeam結果の発現を見つける。3水戸roGFP1は高度からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出することができます高度に低下した状態に酸化する。同様に、mitGO-ATeamは、呼吸阻害剤で処理呼吸ドリブン成長および酵母を受ける酵母で発生するミトコンドリアATPレベルの変化を測定することができる。両方のバイオセンサーは、細胞内の分解能を提供しますので、また、彼らは、酸化還元状態や個々の細胞内のミトコンドリアのATPレベルの不均一性を検出することができます。両方のバイオセンサーは、レシオメトリックプローブであるので、最後に、それらは試料の厚さや病気中の濃度や変動性の変化によって影響を受けることはありませんumination。これらのプローブは、生きている細胞では細胞内の解像度...

ミトコンドリアは、アミノ酸、脂肪酸、ヘム鉄硫黄クラスターおよびピリミジンのATP産生合成に必須の細胞小器官である。ミトコンドリアはまた、カルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている、とアポトーシスの制御インチパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、およびハンチントン病を含む老化や加齢に伴う疾患にミトコンドリア1増やす証拠リンクしています。2個人がで彼らの全体の生活をしながら神経変性疾患に関連付けられているミトコンドリアタンパク質の変異は、病気の症状だけでその後の人生で起こる。これは、その変化が出現する疾患は病理許す年齢とともにミトコンドリアで発生することを示します。確かに、ミトコンドリアの適性が全体細胞の健康と寿命酵母および哺乳類細胞と相関している。ここ3,4、我々はmitocの2つの重要な機能を評価するために、遺伝的にコード化され、レシオメトリック蛍光バイオセンサーを使用する方法について説明します酵母細胞を生体内でhondria：レドックス状態とATPレベル。 有酸素エネルギー動員におけるミトコンドリア機能が十分に確立されている。ミトコンドリアの酸化還元状態は、NAD + / NADH、FAD / FADH 2、NADP + / NADPH、グルタチオン/グルタチオンジスルフィド（GSH / GSSG）と活性酸素種（ROS）を含む、オルガネラの種を還元し、酸化生成物である。ミトコンドリアまたは低酸素脱共役するミトコンドリア呼吸活性に影響を及ぼすとオルガネラにNADHにNAD +の比率を変更します。ミトコンドリア内膜における電子伝達鎖の複合体との間の非効率的な電子移動から、並びにミトコンドリア外膜5、破損脂質、タンパク質、および核酸におけるモノアミンオキシダーゼを介してアミンの脱アミノ化から製造し有するROS、 6,7,8老化や加齢に伴う神経変性疾患にリンクされて。 ROSはまたメートルのシグナル伝達に関与するitochondria、GSHの酸化による。例えば、NADHデヒドロゲナーゼは、ROS産生に寄与するだけでなく、グルタチオンプール9,10との相互作用を介して調節される。 α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとアコニターゼ、TCAサイクルのコンポーネントは、環境の11,12を酸化で還元活性を示す。 実際、アコニターゼ活性のレドックス依存性調節は、細菌から哺乳類13,14に保存されている。したがって、酸化還元状態とミトコンドリアのATP濃度を監視することは、疾患の病理にその機能と役割を理解する上で重要です。 生化学的方法は、酸化還元状態又は全細胞または単離されたミトコンドリアのATPレベルを評価するために使用されている。全細胞やミトコンドリア孤立の酸化還元状態を評価するため、広く用いられている方法は、酸化還元対GSH / GSSG 15のレベルを測定することに基づいています。ルシフェリン - ルシフェラーゼ系は、一般に、ミトコンドリア測定するために使用されるミトコンドリア膜透過し、全細胞又は単離されたいずれかATPレベル。16,17,18,19,20このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ量に比例するATPに結合し、ルシフェリンの酸化の化学発光を触媒する。21の出射光の強度反応混合物中のATP。22のこれらの方法は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する患者は、異常に低いATPレベルを有するという発見を含むミトコンドリア機能に関する基本的な情報を明らかにした。23しかし 、それらは画像の生活に使用されることができない、無傷の細胞。また、全細胞分析に基づく方法は、セルのすべてのコンパートメント内レドックス状態またはATPレベルの平均を提供する。ミトコンドリアの酸化還元状態やATPレベルは細胞下分画中に変更される可能性があるため孤立した小器官での測定は、潜在的に問題がある。最後に、我々の研究室等からの最近の研究では、ことを示している個々の細胞内のミトコンドリアが交互に母と娘細胞の寿命に影響を与える機能、不均質であるので、3つの細胞内解像度を有する生細胞におけるミトコンドリアATPレベルおよび酸化還元状態を測定する必要がある。 ここで説明するミトコンドリア機能のためのバイオセンサーは、両方のGFPに基づいています。レドックス感受性GFP（roGFP）24,25は、表面露出システインが分子に付加されたGFP変異体である。 roGFPは、野生型GFPのように、2つの励起ピーク（〜400 nmおよび480 nmで〜）および〜510nmで少なくとも一つの発光ピークを有する。 〜400 nmでの励起の増加roGFP結果中のシステイン残基の酸化。それらのシステインの減少は〜480 nmで励起を好む。これにより、480 nmおよび400 nmでの励起roGFP 510nmでの発光の比率は、フルオロフォアの環境の酸化還元状態を反映低減および酸化roGFPの相対量を明らかにする。 二つVERSroGFPのイオンが広く使用されています：roGFP1とroGFP2。どちらも同じシステインの挿入が含まれています。 roGFP1は、野生型GFPに基づいており、roGFP2はwtGFP 24に比べて400 nmで480 nmでのより効率的な励起の少ない効率的な励起を持っS65T GFP、に基づいています。 roGFP1はroGFP2とそのダイナミックレンジが減少の範囲にさらに拡張するよりも敏感な小さいpHである。したがって、roGFP1は以上の還元などのミトコンドリアなどの区分や細胞質ゾル、そのようなエンドソームなどの変数のpHとコンパートメントを監視するためのより便利かもしれません。 roGFP2が明るく信号と、いくつかの研究で、roGFP1 24,26よりも大きなダイナミック·レンジを提供しています。 シロイヌナズナにおける研究では、酸化還元状態の変化に対応するために必要な時間は、両方のセンサ（T½酸化のために、65と95秒とt½それぞれroGFP1とroGFP2ための削減、272および206秒、など）についても同様であることを示している。26 MitGO-ATeam2は、信頼性、低侵襲である出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でミトコンドリアのATPを測定するセンサ。 GO-ATeamは、ドナーとアクセプター蛍光タンパク質（GFPおよびオレンジ（OFP）蛍光タンパク質をそれぞれ）FRET F プレーヤーの間に挟まれたF 1-ATPシンターゼのεサブユニットから構成されるフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブである。27アクセプターの近くにドナーをFRETドナーからアクセプターへのエネルギー伝達を可能にさせるタンパク質の立体構造変化におけるεサブユニット結果にATPの結合。 GO-ATeam、GO-ATeam1とGO-ATeam2の二つの変種があります。 GO-ATeam2は、ミトコンドリア内で細胞質ゾルに比べて一般的に低い[ATP]を測定するための、それがより適切な意思、GO-ATeam1よりMgATPに対して高い親和性を持っています27 ミトコンドリアの酸化還元状態を調べるために、我々はATP9リーダー配列に融合roGFP1からなる融合タンパク質（水戸roGFP1）を構築しndは強いグリセルアルデヒド-3 - リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD）プロモーター（p416GPD、Addgene）の制御下でプラスミドセントロメア系（低コピー数）酵母発現から発現。我々はモデル菌サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の老化の文脈でミトコンドリアの酸化還元状態を調べるためにroGFP1を使用していました。我々はroGFP1、老化中および栄養可用性に応じて発生するが、酵母細胞には明らかな有害な影響を及ぼさないミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出できることがわかります。また、個々の生きている酵母細胞内のミトコンドリアの酸化還元状態の変動、細胞内の空間分解能でバイオセンサーの重要性を強調している知見を参照してください。 MitGO-ATeam2はGO-ATeam2のアミノ末端に挿入シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIIIAのミトコンドリアシグナル配列を持つGO-ATeam2の変種です。27私たちは、親切にHの研究室が提供するmitGO-ATeam2プローブ（修正野地研究所Oプラスミド低コピーである酵母発現ベクターpAG415GPD-CCDB（Addgene、ケンブリッジ、MA、USA）にXba1とHindIII部位を経由して、それをサブクローニングすることにより酵母で使用するためのfの科学産業研究、大阪大学、日本）、強力な構成GPDプロモーターを含む。私たちは、出芽酵母でmitGO-ATeam2を表明し、それがミトコンドリアのATPレベルの生理的変化を測定するための効果的なプローブとして機能し、それがミトコンドリアに排他的に局在し、DNA結合色素DAPI、、との対比により、見つける。 roGFPとGO-ATeamは、遺伝的にコードされている両方。結果として、それらが導入され、安定的に維持無傷の細胞において、酸化還元状態または個々の、生細胞内ATPレベルに関する情報を提供することができる。さらに、両方のバイオセンサーは、酸化還元状態や生理的条件下で発生するATPレベルの変化を監視します28両プローブもレシオメトリックである。その結果、これらのプローブを使用した測定は、茶の影響を受けませんバイオセンサー濃度またはサンプル照明や厚さNGES。最後に、両方のバイオセンサーは、細胞内の空間分解能を提供します。実際、roGFPはミトコンドリア、小胞体に標的化された、エンドソームと24ペルオキシソーム、およびpHの大部分は独立したこれらの細胞小器官のそれぞれの酸化還元状態の変化を検出することができる。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>1397-94-0</td><td>エタノールに溶解して2 mg/mLのストック溶液に溶解</td></tr>。<tr><td>SGlyc(合成グリセロール系)酵母増殖培地 ※SGlyc-Ura は省略 ※SGlyc-Leu</td><td></td><td></td>は省略 <td>H2Oに溶解 NaHCO3でpHを5.5に調整します。オートクレーブ 成分: 0.67% アミノ酸を含まない酵母窒素塩基 3% グリセロール 0.05% グルコース 2mg/ml アデニン 2mg/ml ウラシル* 1mg/ml L-アルギニン 1mg/ml L-ヒスチジン 1mg/ml L-ロイシン** 3mg/mlL-リジン 2 mg/ml L-メチオニン 4 mg/ml L-フェニルアラニン 2 mg/ml L-トリプトファン 3 mg/ml L-チロシン</td></tr><tr><td>SC (合成完全グルコースベース) 酵母増殖培地 *SGlyc-Ura は省略 **SGlyc-Leu</td><td></td><td></td> は省略 <td>H2O に溶解します。NaHCO3で pH を 5.5 に調整します。オートクレーブ。成分: 0.67% 酵母窒素塩基 (アミノ酸なし) 3% グルコース 2 mg/ml アデニン 2 mg/ml ウラシル* 1 mg/ml L-アルギニン 1 mg/ml L-ヒスチジン 1 mg/ml L-ロイシン** 3 mg/ml L-リジン 2 mg/ml L-メチオニン 4mg/ml L-フェニルアラニン 2 mg/ml L-トリプトファン 3 mg/ml L-チロシン</td></tr><tr><td>バラップ</td><td></td><td></td><td>材料を 1:1:1 (w:w:w) の比率で組み合わせます。70°Cに沈めて溶かします。C H2Oバス。ガラスのシャーレにアリコートします。室温で保存してください。原材料: ワセリンワセリン、ハードパラフィン、ラノリン</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment and Software</strong</td></tr><tr><td>>事前にクリーニングされたゴールドシールライトオンマイクロスライドトーマス</td><td>サイエンティフィック(ニュージャージー州スウェーデン)</td><td>3050</td><td>サイズ:25 x 75 mm;厚さ:0.93〜1.05 mm</td></tr>高性能<tr><td>カバースリップ、No.1.5、18x18 mm</td><td>ツァイス(ソーンウッド、NY)</td><td>474030-9000-000これらは</td><td>厚さの変動が少ない(170&plusmn;5 &mu;m) 標準的なカバースリップよりも、球面収差を低減し、3Dイメージング性能を向上させる</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド顕微鏡カバーガラス、No.1.5</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(ペンシルベニア州ピッツバーグ)</td><td>12-545E</td><td>サイズ:22 x 22 mm、厚さ1.5号(170 &mu;m)</td></tr><tr><td>スペクトル検出器と100倍/1.49 NA Apo-TIRF対物レンズを備えたA1レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ニコン(ニューヨーク州メルビル)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>100x/1.3NA EC Plan-Neofluar対物レンズ(Zeiss)とOrca ER冷却CCDカメラ(浜松)を装備し、Axiovisionソフトウェア</td><td>Zeiss(ニューヨーク州ソーンウッド)で制御するAxioObserver.Z1顕微鏡。浜松(日本・浜松市)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity 3D画像解析ソフトウェア</td><td>Perkin Elmer(マサチューセッツ州ウォルサム)</td><td></td><td>デコンボリューション用修復モジュール。比計算および測定用定量モジュール</td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア 国立</td><td>衛生研究所(メリーランド州ベセスダ)</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr></tbody></table>

リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とatpを測定レシオメトリックバイオセンサー

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

ミトコンドリアはエネルギー代謝や細胞の寿命とプログラム細胞死を制御するカルシウムの恒常性から、多くの細胞プロセスで役割を持っている。これらのプロセスには影響を与え、ミトコンドリアでの酸化還元状態とATP産生の影響を受けている。ここでは、酵母細胞を生きた細胞内での解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを検出できる2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用を記載している。ミトコンドリアの酸化還元状態は、ミトコンドリアマトリックスを標的とレドックス感受性緑色蛍光タンパク質（roGFP）を用いて測定される。水戸roGFPは、順番に、タンパク質の励起スペクトルを変えるリバーシブルと環境依存の酸化還元を受ける位置が147とGFPの204でシステインを含んでいます。 MitGO-ATeam F O F 1-ATPシンターゼのεサブユニットとの間に挟まれたフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブはドナー及びアクセプター蛍光のFRETされているrescentタンパク質。もたらすタンパク質における立体構造変化εサブユニット結果にATPの結合は近接ドナーとアクセプターとのFRETドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする。

水戸roGFPとミトコンドリアの酸化還元状態を測定ここでは、ミト-roGFP1は、酵母細胞増殖またはミトコンドリアの形態に影響を与えることなく、生きた酵母細胞を低減するために完全に酸化からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出するためにダイナミックレンジを有することを示す。まず、ミトコンドリアを標的とGFPとroGFP1を発現する細胞は、通常料金（ 図1A）で成長を見つける。最大成長速度は、対数増殖期と最大成長速度に達するまでの時間の間に成長曲線の最大傾斜によって測定される、ミト-GFPおよびミト-roGFP1を発現する細胞で類似している。さらに、水戸roGFP1展示野生型形態（ 図1B）を発現する酵母におけるミトコンドリア。具体的には、管状のですが、母の芽軸に沿って整列し、そして母と娘細胞の先端に蓄積されます。ミトコンドリアの機能不全は、しばしば断片化を誘発するので、通常の形態では、水戸roGFP1が行うという考えをサポートしていますしない摂動ミトコンドリア機能。 <p class="jove_content...

我々は、生きた酵母細胞における細胞内解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを監視するために、GFPをもとにしている2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用が記載されている。

リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

この手順の全体的な目標は、2つの緑色蛍光タンパク質またはGFPバリアントを使用して、生きた酵母細胞のミトコンドリア機能を測定することです。酸化還元センシングGFPには、表面に露出したシスチンが含まれており、シスチンは可逆的で環境依存的な酸化と還元を受け、タンパク質の還元列の励起スペクトルを変化させます。GFPの励起最大は470ナノメートルですが、酸化列GFPは365ナノメートルで励起不足が増加します。redoc状態は、365ナノメートルの励起でRO GFP発光上の470ナノメートルの励起でRO GFP発光として測定されます チームは、FゼロF1 A TP合成酵素のイプシロンサブユニットがフレットドナーGFPとフレットアクセプターオレンジ蛍光タンパク質またはイプシロンサブユニットへのTPのOFP結合の間に挟まれているフレットプローブです。フレットドナーとアクセプターが近接しているため、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が可能になります。次に、TPレベルは、488ナノメートルでの励起時のGFP発光よりも488ナノメートルでの励起時のOFP排出量として測定されます。生理学的条件下で発生する酸化還元状態またはTPレベルの変化を監視する結果が得られます。これらの方法が既存の方法よりも優れている点は、道路GFPとゴーです。チームは遺伝的にコードされており、生細胞に導入して安定的に維持することができます。その結果、細胞や細胞小器官の適応度に影響を与えることなく、生細胞のミトコンドリア酸化還元状態とTPを測定するために使用できます。どちらのプローブも、生理学的条件下での酸化還元状態またはTPレベルの変化をモニターします。その結果、両方のプローブも比率メトリックになります。これらのプローブで行われた測定は、バイオセンサーの濃度やサンプルの照明、厚さの変化の影響を受けません。どちらのバイオセンサーも、個々の細胞小器官のレベルで分解能を提供します。実際、RO GFPバリアントは、ミトコンドリア、小胞体、エンドソーム、ペルオキシソームを標的としており、pHに大きく依存せずに酸化還元状態の変化を検出しています。これらの方法は、ミトコンドリアの品質管理やミトコンドリアの経年変化に関する分野における重要な疑問に答えるのに役立つかもしれません。この方法の視覚的なデモンストレーションは、画像解析中の閾値化および比率ステップが困難であり、一貫した定義されたガイドラインを使用して実施する必要があるため、この手順を開始するために有用である。テキストプロトコルに記載されているバイオセンサーによる酵母の形質転換を行います。15ミリリットルの円錐形ボトムチューブ内の5ミリリットルの選択的完全ドロップアウト培地で細胞を中対数期まで増殖させます。すべての実験で同じバッチの培地を使用します。1ミリリットルの培養物を20マイクロリットルに濃縮した後、再懸濁した細胞の2マイクロリットルをスライドに塗布し、細胞をカバースリップで覆います。次に、金属ヘラで少量のVAPを溶かし、カバーのスリップエッジに沿って広げてシールします。あるいは、透明マニキュアを使用して、広視野蛍光顕微鏡でのmito RO GFP oneイメージングを行うこともできます。100 x 1.3 NA EECプランなど、365ナノメートルで光を透過する、可能な限り高い開口数を持つ対物レンズを使用してください。Neo Fluor対物レンズ。365ナノメートルと470ナノメートルで励起するように顕微鏡を構成し、酸化したミッター列GFPと減少したミッター列GFPをそれぞれ検出します。LEDを使用して励起波長を変更し、GFPに適した蛍光フィルターキューブを使用します。励起フィルターを取り外した状態で、最適な空間分解能を得るために、カメラを1つずつベニングに設定します。次に、0.5マイクロメートル間隔の11スライスからなるZackを集録するようにソフトウェアを設定し、各Z位置で両方のチャンネルを収集します。透過光を使用して細胞の焦点面を特定し、蛍光プローブの漂白を最小限に抑えます。次に、0.5マイクロメートルのステップサイズを使用して、一般的な細胞の全深さにわたってZシリーズを収集し、イメージング用にセットアップします。チーム2でスペクトル共焦点顕微鏡に乗るかもしれません。こちらで入手可能な最高開口数レンズを使用してください。100 x 1.49 APOターフレンズを使用しています。488ナノメートルでミーゴチーム2を励起し、TP結合の場合は500〜520ナノメートル、550〜580ナノメートルの発光を収集するように顕微鏡を構成します。TP の場合、非連結フォーム。実際の最適値は、イメージングシステムの特性によって異なる場合があります。ピンホールを1.0エリア単位に設定してからセットします。スキャン ズームを使用して、ナイキスト サンプリング制限に近づきます。イメージング速度を上げるには、フィールドを 512 x 256 ピクセルにトリミングします。必要に応じてスキャン平均化を使用して、ノイズを低減します。レーザー出力をできるだけ少なくしながら、解釈可能な画像を生成します。内部または外部のパワーメーターを使用して、任意の光学システムで時間の経過とともに通常発生するレーザー出力の変化を監視します。検出器のゲインと照明強度を調整して、ダイナミックレンジを最大化します。ただし、飽和状態は避けてください。1%以上の飽和ピクセルを含むセルは分析しないでください。0.5マイクロメートルのステップサイズを使用して一般的なセルのホールド深度を通じてZシリーズを収集する前に、透過光を使用してセルの焦点面を特定し、同じ対物レンズレーザーパワースキャン、ズームピクセルサイズ、ゲイン、およびオフセットを使用してすべてのサンプルを画像化します。取得した画像を開き、タイプを32ビットに変更して背景を決定します。セルがない領域に関心領域または ROI を描画します。選択、分析、測定して、この ROI の平均強度を結果ウィンドウに追加します。この値をスタックから減算するには、プロセス演算を選択し、減算します。次に、背景の平均強度を入力し、プレビューを選択します。はい、しきい値処理は手順の最も難しい側面です。成功を確実にするには、結果の画像が元の画像内の蛍光オブジェクトの実際のサイズを維持するように、しきい値パラメータを定義します。各実験でまったく同じ露光条件を使用すると、画像処理全体で一貫したしきい値を生成するのに役立ちます。しきい値が低すぎると、背景ピクセルが含まれます。閾値が高すぎると、減算されたザックを使用して分析からミトコンドリアの一部が排除され、中央のスライスを見つけて画像調整と閾値を選択し、適切な閾値を見つけた後にミトコンドリアに閾値を設定します。[適用] をクリックして、スタック内のすべてのスライスにこのしきい値を適用します。次に、[背景ピクセルをNANに設定するか、数値ではないか]をオンにして、[OK]をクリックし、[はい、はい、他の画像に対してこのプロセスを繰り返します]をクリックします。[プロセス]、[画像計算機]の順にクリックして、比率Zスタックを作成します。MIT O-R-G-F-P one analysisの場合、還元スタックを酸化Cスタックで除算します。migo AAM 2 解析にも同じプロトコルが使用されます。その場合は、A TP束縛560ナノメートル像をA TP非束縛510ナノメートル像で割る。対象領域の周囲にROIを描画します。解析ツールを選択します。ROIマネージャーをクリックし、[追加]をクリックしてROIを記録し、[さらにマルチメジャー]を選択して[OK]を選択します。最後に、スライス番号の面積と平均をコピーし、分析のためにデータをスプレッドシートにエクスポートし、スプレッドシートを使用して、ミトコンドリアを標的とするGFPを発現する加重合計と加重平均細胞の面積時間を計算します。最大増殖速度は、mito GFPを発現する細胞とMIT行GFPを発現する細胞で類似しています。さらに、MIT RO GF P oneを発現するミトコンドリアと酵母は、母芽軸に沿って管状に整列し、母母細胞と母娘細胞の先端に蓄積します。この正常な形態は、MIT RO GF P oneがミトコンドリア機能を乱さないことを示しています。mitg FPのダイナミックレンジを評価するために、1つのミッドロック相の野生型酵母細胞を過酸化水素とdihi three etoolで処理し、平均ミトコンドリアの還元比を測定して、過酸化水素またはDTTによるミトコンドリアの酸化還元状態の滴定を0〜10ミリモルで評価しました。平均すると、ミトコンドリアは酸化に還元された比率で、酸化条件下での0.6から還元条件下での1.23までの測定範囲でした。したがって、mitg FP oneは、生細胞内のミトコンドリアの日付変更の解析に有効なバイオセンサーです。Mito RO GFP oneは、ミトコンドリア酸化還元状態の細胞内分解能も提供します。この細胞内分解能は、個々の酵母細胞内のミトコンドリアが相対的な酸化還元状態が異なることを明らかにしています。光は、高強度の400ナノメートルの光列にさらされるとGFPクロモ4の変化を誘発することができます。GFP1は、低強度励起を使用して異なる発光スペクトルを持つ種に光変換されます。分析対象期間中に大幅な写真変換は行われていません。光変換を減らす好ましい方法は、365ナノメートルで酸化型GFPの列GFPを励起することです。MIGO AAM 2つは、酵母のDAPI染色ミトコンドリアDNAに共局在し、野生型酵母ミトコンドリアに典型的な管状構造に見られます。さらに、MIGO AAM 2を発現する細胞の増殖速度は、グルコースおよびグリセロール培地の両方でGFPを標的とするミトコンドリアを発現する細胞の増殖速度と類似しています。したがって、migo A 2の発現は、細胞またはミトコンドリアに有害であるとは思われません migo A 2がミトコンドリアA TPレベルの変化に応答するかどうかをテストするために、細胞は、ミトコンドリアA TP産生を阻害する薬剤であるアンチマイシンAで処理されました。フレット比の中央値は、アンチマイシンで処理された細胞で減少します。興味深いことに、予備データは、同じ細胞内の異なるミトコンドリアでTPレベルに違いがある可能性があることを示しています。一度習得すると、このテクニックは数時間で実行できます。さらに、この手順を試みる際には、ミトコンドリアの断片化やその他の光毒性の兆候について細胞を監視しながら、イメージングパラメータを一定に保つことが重要です。光退色を避け、閾値化のための一貫した基準を開発します。これらのバイオセンサーは、生きた植物菌類や哺乳類細胞のミトコンドリアの変化を監視するために使用できます。また、神経変性、代謝性疾患、およびミトコンドリア機能の欠陥に関連するその他の疾患のミトコンドリア変化のモニタリングにも使用できます。このビデオを見た後、ミトコンドリアのターゲット比メトリック蛍光色素を使用して、生細胞のミトコンドリア酸化還元状態とTPをモニターできるようになるはずです。

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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過酸化水素(H2O2)は、酸化的損傷の原因であり、シグナル伝達分子でもあります。このプロトコルは生きているイーストのミトコンドリア目標とされたHyPer7 (mtHyPer7)の遺伝的にコードされたratiometricバイオセンサーを使用してミトコンドリアH2O2...

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸は、細胞の生体エネルギー学の貴重な指標です。ここでは、さまざまな酵母種に適用できるこの表現型を定量化するためのプロトコルを紹介します。...

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

蛍光寿命イメージング（FLIM）はイメージに重要な手法として、生きた細胞内の特定のタンパク質と色素の環境との相互作用を浮上している。蛍光分子ローターのFLIMは、生体細胞内の粘度のマッピングを可能にします。...

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。...

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

この資料では、詳細多重ニードルベースの​​センサの構築を。デバイスは、迅速かつ選択的に複数の分析物のin...

多重経皮電気化学センシングのための中空マイクロニードルベースの​​センサ

有機半導体ポリマーの使用に基づく、可視光によるin-vitro細胞培養の電気的活動の刺激方法が説明されています。...

生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

最近、多くのFRETベースの力のバイオセンサーが開発され、細胞内力のタンパク質特異的な解決が可能になりました。このプロトコルでは、核骨格-細胞骨格(LINC)複合体タンパク質Nesprin-2Gのリンカー用に設計されたこれらのセンサーの1つを使用して、核LINC複合体に対するアクトミオシン力を測定する方法を示します。...

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

本論文では、遺伝子操作された細胞およびプログラマブル材料表面を制御し、操作するために、合成遺伝子操作大腸菌を有効に官能基化表面を開発するための一連のプロトコルを提示します。...

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

学ぶレシオメトリックGFPバイオセンサーを用いたリビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPの測定法。リアルタイムでサブセルラー分解能を持つミトコンドリア機能モニタリングが可能です。

リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー

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