リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー

我々は、生きた酵母細胞における細胞内解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを監視するために、GFPをもとにしている2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用が記載されている。

この手順の全体的な目標は、2つの緑色蛍光タンパク質またはGFPバリアントを使用して、生きた酵母細胞のミトコンドリア機能を測定することです。酸化還元センシングGFPには、表面に露出したシスチンが含まれており、シスチンは可逆的で環境依存的な酸化と還元を受け、タンパク質の還元列の励起スペクトルを変化させます。GFPの励起最大は470ナノメートルですが、酸化列GFPは365ナノメートルで励起不足が増加します。

redoc状態は、365ナノメートルの励起でRO GFP発光上の470ナノメートルの励起でRO GFP発光として測定されます チームは、FゼロF1 A TP合成酵素のイプシロンサブユニットがフレットドナーGFPとフレットアクセプターオレンジ蛍光タンパク質またはイプシロンサブユニットへのTPのOFP結合の間に挟まれているフレットプローブです。フレットドナーとアクセプターが近接しているため、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が可能になります。次に、TPレベルは、488ナノメートルでの励起時のGFP発光よりも488ナノメートルでの励起時のOFP排出量として測定されます。生理学的条件下で発生する酸化還元状態またはTPレベルの変化を監視する結果が得られます。

これらの方法が既存の方法よりも優れている点は、道路GFPとゴーです。チームは遺伝的にコードされており、生細胞に導入して安定的に維持することができます。その結果、細胞や細胞小器官の適応度に影響を与えることなく、生細胞のミトコンドリア酸化還元状態とTPを測定するために使用できます。

どちらのプローブも、生理学的条件下での酸化還元状態またはTPレベルの変化をモニターします。その結果、両方のプローブも比率メトリックになります。これらのプローブで行われた測定は、バイオセンサーの濃度やサンプルの照明、厚さの変化の影響を受けません。

どちらのバイオセンサーも、個々の細胞小器官のレベルで分解能を提供します。実際、RO GFPバリアントは、ミトコンドリア、小胞体、エンドソーム、ペルオキシソームを標的としており、pHに大きく依存せずに酸化還元状態の変化を検出しています。これらの方法は、ミトコンドリアの品質管理やミトコンドリアの経年変化に関する分野における重要な疑問に答えるのに役立つかもしれません。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、画像解析中の閾値化および比率ステップが困難であり、一貫した定義されたガイドラインを使用して実施する必要があるため、この手順を開始するために有用である。テキストプロトコルに記載されているバイオセンサーによる酵母の形質転換を行います。15ミリリットルの円錐形ボトムチューブ内の5ミリリットルの選択的完全ドロップアウト培地で細胞を中対数期まで増殖させます。

すべての実験で同じバッチの培地を使用します。1ミリリットルの培養物を20マイクロリットルに濃縮した後、再懸濁した細胞の2マイクロリットルをスライドに塗布し、細胞をカバースリップで覆います。次に、金属ヘラで少量のVAPを溶かし、カバーのスリップエッジに沿って広げてシールします。

あるいは、透明マニキュアを使用して、広視野蛍光顕微鏡でのmito RO GFP oneイメージングを行うこともできます。100 x 1.3 NA EECプランなど、365ナノメートルで光を透過する、可能な限り高い開口数を持つ対物レンズを使用してください。Neo Fluor対物レンズ。

365ナノメートルと470ナノメートルで励起するように顕微鏡を構成し、酸化したミッター列GFPと減少したミッター列GFPをそれぞれ検出します。LEDを使用して励起波長を変更し、GFPに適した蛍光フィルターキューブを使用します。励起フィルターを取り外した状態で、最適な空間分解能を得るために、カメラを1つずつベニングに設定します。

次に、0.5マイクロメートル間隔の11スライスからなるZackを集録するようにソフトウェアを設定し、各Z位置で両方のチャンネルを収集します。透過光を使用して細胞の焦点面を特定し、蛍光プローブの漂白を最小限に抑えます。次に、0.5マイクロメートルのステップサイズを使用して、一般的な細胞の全深さにわたってZシリーズを収集し、イメージング用にセットアップします。

チーム2でスペクトル共焦点顕微鏡に乗るかもしれません。こちらで入手可能な最高開口数レンズを使用してください。100 x 1.49 APOターフレンズを使用しています。

488ナノメートルでミーゴチーム2を励起し、TP結合の場合は500〜520ナノメートル、550〜580ナノメートルの発光を収集するように顕微鏡を構成します。TP の場合、非連結フォーム。実際の最適値は、イメージングシステムの特性によって異なる場合があります。

ピンホールを1.0エリア単位に設定してからセットします。スキャン ズームを使用して、ナイキスト サンプリング制限に近づきます。イメージング速度を上げるには、フィールドを 512 x 256 ピクセルにトリミングします。

必要に応じてスキャン平均化を使用して、ノイズを低減します。レーザー出力をできるだけ少なくしながら、解釈可能な画像を生成します。内部または外部のパワーメーターを使用して、任意の光学システムで時間の経過とともに通常発生するレーザー出力の変化を監視します。

検出器のゲインと照明強度を調整して、ダイナミックレンジを最大化します。ただし、飽和状態は避けてください。1%以上の飽和ピクセルを含むセルは分析しないでください。

0.5マイクロメートルのステップサイズを使用して一般的なセルのホールド深度を通じてZシリーズを収集する前に、透過光を使用してセルの焦点面を特定し、同じ対物レンズレーザーパワースキャン、ズームピクセルサイズ、ゲイン、およびオフセットを使用してすべてのサンプルを画像化します。取得した画像を開き、タイプを32ビットに変更して背景を決定します。セルがない領域に関心領域または ROI を描画します。

選択、分析、測定して、この ROI の平均強度を結果ウィンドウに追加します。この値をスタックから減算するには、プロセス演算を選択し、減算します。次に、背景の平均強度を入力し、プレビューを選択します。

はい、しきい値処理は手順の最も難しい側面です。成功を確実にするには、結果の画像が元の画像内の蛍光オブジェクトの実際のサイズを維持するように、しきい値パラメータを定義します。各実験でまったく同じ露光条件を使用すると、画像処理全体で一貫したしきい値を生成するのに役立ちます。

しきい値が低すぎると、背景ピクセルが含まれます。閾値が高すぎると、減算されたザックを使用して分析からミトコンドリアの一部が排除され、中央のスライスを見つけて画像調整と閾値を選択し、適切な閾値を見つけた後にミトコンドリアに閾値を設定します。[適用] をクリックして、スタック内のすべてのスライスにこのしきい値を適用します。

次に、[背景ピクセルをNANに設定するか、数値ではないか]をオンにして、[OK]をクリックし、[はい、はい、他の画像に対してこのプロセスを繰り返します]をクリックします。[プロセス]、[画像計算機]の順にクリックして、比率Zスタックを作成します。MIT O-R-G-F-P one analysisの場合、還元スタックを酸化Cスタックで除算します。

migo AAM 2 解析にも同じプロトコルが使用されます。その場合は、A TP束縛560ナノメートル像をA TP非束縛510ナノメートル像で割る。対象領域の周囲にROIを描画します。

解析ツールを選択します。ROIマネージャーをクリックし、[追加]をクリックしてROIを記録し、[さらにマルチメジャー]を選択して[OK]を選択します。最後に、スライス番号の面積と平均をコピーし、分析のためにデータをスプレッドシートにエクスポートし、スプレッドシートを使用して、ミトコンドリアを標的とするGFPを発現する加重合計と加重平均細胞の面積時間を計算します。

最大増殖速度は、mito GFPを発現する細胞とMIT行GFPを発現する細胞で類似しています。さらに、MIT RO GF P oneを発現するミトコンドリアと酵母は、母芽軸に沿って管状に整列し、母母細胞と母娘細胞の先端に蓄積します。この正常な形態は、MIT RO GF P oneがミトコンドリア機能を乱さないことを示しています。

mitg FPのダイナミックレンジを評価するために、1つのミッドロック相の野生型酵母細胞を過酸化水素とdihi three etoolで処理し、平均ミトコンドリアの還元比を測定して、過酸化水素またはDTTによるミトコンドリアの酸化還元状態の滴定を0〜10ミリモルで評価しました。平均すると、ミトコンドリアは酸化に還元された比率で、酸化条件下での0.6から還元条件下での1.23までの測定範囲でした。したがって、mitg FP oneは、生細胞内のミトコンドリアの日付変更の解析に有効なバイオセンサーです。

Mito RO GFP oneは、ミトコンドリア酸化還元状態の細胞内分解能も提供します。この細胞内分解能は、個々の酵母細胞内のミトコンドリアが相対的な酸化還元状態が異なることを明らかにしています。光は、高強度の400ナノメートルの光列にさらされるとGFPクロモ4の変化を誘発することができます。GFP1は、低強度励起を使用して異なる発光スペクトルを持つ種に光変換されます。分析対象期間中に大幅な写真変換は行われていません。

光変換を減らす好ましい方法は、365ナノメートルで酸化型GFPの列GFPを励起することです。MIGO AAM 2つは、酵母のDAPI染色ミトコンドリアDNAに共局在し、野生型酵母ミトコンドリアに典型的な管状構造に見られます。さらに、MIGO AAM 2を発現する細胞の増殖速度は、グルコースおよびグリセロール培地の両方でGFPを標的とするミトコンドリアを発現する細胞の増殖速度と類似しています。したがって、migo A 2の発現は、細胞またはミトコンドリアに有害であるとは思われません migo A 2がミトコンドリアA TPレベルの変化に応答するかどうかをテストするために、細胞は、ミトコンドリアA TP産生を阻害する薬剤であるアンチマイシンAで処理されました。

フレット比の中央値は、アンチマイシンで処理された細胞で減少します。興味深いことに、予備データは、同じ細胞内の異なるミトコンドリアでTPレベルに違いがある可能性があることを示しています。一度習得すると、このテクニックは数時間で実行できます。

さらに、この手順を試みる際には、ミトコンドリアの断片化やその他の光毒性の兆候について細胞を監視しながら、イメージングパラメータを一定に保つことが重要です。光退色を避け、閾値化のための一貫した基準を開発します。これらのバイオセンサーは、生きた植物菌類や哺乳類細胞のミトコンドリアの変化を監視するために使用できます。

また、神経変性、代謝性疾患、およびミトコンドリア機能の欠陥に関連するその他の疾患のミトコンドリア変化のモニタリングにも使用できます。このビデオを見た後、ミトコンドリアのターゲット比メトリック蛍光色素を使用して、生細胞のミトコンドリア酸化還元状態とTPをモニターできるようになるはずです。