Name: 非接触型誘電泳動によりラベルフリーの単離と細胞の濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ非接触型誘電泳動によるラベルフリーの細胞分離・濃縮法。PDMSマイクロ流体デバイスを用いて、細胞の誘電特性に基づき無菌かつ非破壊的に生細胞と死細胞を分離できる。腫瘍細胞の単離や薬剤効果解析に有用な技術である。

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サポートされるこの作品は、助成金番号EFRI 0938047の下で国立科学財団によって部分的にサポートされ、重要な技術と応用科学のためのバージニア工科大学（ICTAS）によってされています。著者は、MOSE-L細胞のその種類のギフトのために博士エヴァSchmelz博士とポール·ロバーツへの感謝の意を表したいと思います。著者は、彼女のこの文書を編集し、実験の準備から彼女の助けのための細胞培養、Caitlan Swaffarの支援、およびすべてBioelectromechanicalシステム研究室メンバーのアンジェラ·アンダーソンを認める。

1。概要：プロトタイプのcDEPマイクロ流体デバイスを製造<ol><li>フォローは、以前に、シリコンウェハ（ 図2）内に所望のチャネル設計（ 図1）をエッチングするためにフォトレジスト及びディープ反応性イオンエッチング（DRIE）を使用して、手順22を報告した。ウェハからマイクロデバイスの放出を改善するためにテフロン（登録商標）の薄い層を堆積させる。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> 図1。低周波数の概略連続選別装置。サンプルチャネルが実行されると、左から右へと100μmのノコギリくびれと500μm幅です。流体の電極チャネルの2対はそれぞれ、ソースとシンクの電極を構成し、厚さ20μmのPDMSバリアによって試料流路から分離される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> 図2。 fabrのcDEP装置のication工程であって、（a）60秒の場合、UV光を選択的にのcDEP装置の幾何学的形状のマスクパターンを介して露光されたフォトレジストと反応し、（b）はフォトレジストを現像液を用いて除去される。（c）のディープ反応性イオンエッチング（DRIE） 50μmの深特徴をエッチングするために使用され、70°Cでの水酸化テトラメチルアンモニウム（TMAH）によるウェットエッチングを5分間25％側壁の粗さを低減するために使用される。（d）にテフロンコーティングがからデバイスの放出を改善するために添加されウェハ。（e）は PDMSを脱気した後に再使用可能なウエハスタンプ上に注ぎ、100°F（f）は、PDMSがウェハから除去されるで45分間硬化される。 PDMS及び清潔なガラススライドを2分間、空気プラズマに曝され、接合されている。 <ol start="2"><li>波及を防ぐために、アルミホイルでウェーハをラップします。約20分間脱ガス、硬化剤とエラストマーの10:1の比で、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を混合する、及びウエハ上に注ぐ。スタンプのテフロンコーティングの損傷を回避するために、100℃で45分間加熱する。デバイスを冷却することができます。 </li><li>冷却後、アルミニウム箔を除去する外科用ブレードを用いてPDMSをトリミングし、管の大きさに適した平滑パンチャーを用いてチャネル入口/出口のアクセス穴パンチ。ここでは1.5mmで平滑パンチャーを使用する。 </li><li>それぞれの水と石鹸リンス、エタノール、DI水、空気と乾燥を使用して、ガラス顕微鏡スライドを清掃してください。スコッチマジックテープを使用したPDMSデバイスを清掃してください。チャンネルが汚れていないことを確認するために、顕微鏡下で調べる。 2分間、空気プラズマにスライドとPDMSデバイスを公開します。しっかりとスライド装置（ 図3）との間の気泡の形成を回避し、スライドガラスにデバイスのチャネル側を押してください。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> 図3。 </st栄&gt;（A）、シリコンウェーハスタンプ製作、およびサンプルをそれぞれ緑と赤の食品着色料で満たさ流体電極チャンネル（B）、完成したPDMS-ガラスデバイスの間に、フォトリソグラフィに使用されるマスク。寸法については図1を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 2。 DEPバッファ中の細胞懸濁液を準備する<ol><li> 「DEPバッファ」と呼ぶことにする低伝導率を作製（100μS/ cm）で緩衝液（8.5％スクロースの[w / v]で、0.3％グルコースの[w / v]で、0.725パーセントRPMI [重量/容量]） 。16 </li><li> 3×10 6細胞/ mlでDEP緩衝液中で細胞を懸濁する。ここでは、癌末期のマウスの卵巣表面上皮（MOSE-L）細胞が使用されている。 </li></ol> 注：トリパンブルー色素排除法により細胞生存率分析は、生存率のわずかな減少を示した5時間後、室温でDEP緩衝液に懸濁し、早期MOSE（MOSE-E）は、細胞の（95.1から91.6パーセント）。これは、生存率のわずかな減少同様の細胞は、長期バッファDEPに格納されるべきでないことを示す、MOSE-L細胞について起こることが予測される。 <ol start="3"><li>このような酵素的に活性化カルセインAM、蛍光膜透過性色素を用いて細胞を染色。 </li><li>染め細胞懸濁液の導電率を測定します。導電率は、約100μS/ cmである必要があります。導電率測定が高すぎると、3×10 6細胞/ mlでDEP緩衝液中に再懸濁し、試料をスピンダウンし、導電率測定を繰り返す。 </li></ol> 3。のcDEPマイクロ流体チップのロード<ol><li> 30分間真空下でのマイクロ流体チップを置きます。 </li><li>一方、マイクロ流体チップが配置される顕微鏡のステージにシリンジポンプからの距離をまたがるようにフレキシブルチューブの部分をカット。ここで、チューブの6インチの長さ必要とされている。注射器の先端を針にフィットチューブ。 </li><li>チューブの断面積で目標収集されたサンプルボリュームを分割して出口管に必要な長さを推定する。ザ·チューブの長さを必要とするカット。 </li><li>シリンジ内に細胞懸濁液を描画します。気泡がチューブ又はシリンジ内に配置されていないことを確認してください。 </li><li>真空からチップを取り外す際に、チャンネルに閉じ込められた空気の泡を避けるために、すぐに出口チューブとプライムサンプルチャネルを挿入します。それはバリアが破裂することなく5ミリリットル/時のほぼ一定の高スループットに耐えられることが観察されているものの、（20ミクロン）の薄い絶縁バリアを破壊を避けるために、プライミング時に優しく、注射器をタップします。 </li><li>プライム電極チャネルに、迅速に、各流体電極チャネルの1コンセントに空のピペットチップを配置します。ローダミンBを少量含有する200μlのPBSをピペットで穏やかに電極チャネルの反対側の端部に流体を導入するためにタップする。穏やかな圧力を維持するローダミンBを含むPBSまで目に見えて、空のピペットチップの先端を進む。各電極のチャネルに対して繰り返します。ローダミンBのみ蛍光流体の電極チャンネルを視覚化するために使用される。 </li><li>ピペットチップ貯水池内の気泡形成を避け、ゆっくりと上下にピペッティングすることにより、目に見える気泡を除去ローダミンBとPBSで各ピペットチップリザーバーを満たし、プライミング後に。アウトレットチューブを外し、ターゲットボリュームを収集するために、新鮮な出口チューブ容器を挿入した後、適切に廃棄します。 </li></ol> 4。のcDEPチップを用いて細胞の特徴クロスオーバー周波数<ol><li>デジタルカメラ（ 図4）を備えた倒立顕微鏡のステージ上のチップを置きます。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> 図4。 </stroNG&gt;（A）のcDEP実験のための全体的な実験。のcDEPチップは、倒立顕微鏡の台上に配置されている。カメラは、記録のためにパソコンに画像を送信します。シリンジポンプは、一定の入口流れを維持する。関数発生器は、高電圧増幅器で昇圧し、ワイヤ電極のcDEPによりチップに接続された信号を生成する。オシロスコープは、チップに送られる信号を監視している。（B）のcDEPチップと流体と電子接続の詳細ビュー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <ol start="2"><li>シリンジポンプにシリンジをマウントし、流体電極チャネル貯水池にワイヤ電極を挿入します。 </li><li>シリンジポンプとシリンジとの間の良好な接触を確保するためには1ml /時間でを通して流体をポンピング。視覚的に妨げられない細胞のフロー及び気泡または漏れがないことを確実にするために、チャネル長を検査する。レッド0.005ミリリットル/時UCE流量。 注意：1ミリリットル/時の31,35と高いスループットが他の形状のデバイスで実現しています。 </li><li>安全のために、関数発生器、高電圧アンプ、オシロスコープの電源をオンにし、所望の電圧と周波数を調整することにより、電子機器をテストします。ここで、これらのパラメータは、200 Vおよび20 kHzのです。許容可能なパフォーマンス、電源オフの検証時に。高電圧アンプに電極を接続します。 注：これらの実験に使用される高電圧での電子機器を操作するときに適切な電気安全手順に従ってください。 </li><li>定常流を達成すると、所望の周波数で所望の電圧を印加する。この実験では、電圧は5〜60 kHzの間の周波数で200 V RMSです。 </li><li>チャネル内の細胞分布を定量化するためのクロスオーバー周波数を特徴付けるために画像処理技術（ステップ5）を有する細胞応答の記録ビデオファイル。これを行うには、一定の電圧を維持し、体系的に周波数を変える。実験の開始時と終了時と同様に、ランダムに実験ランの間に、任意の電界を印加することなく、細胞の分布をコントロール細胞分布を記録する。 （ここでは5分）監視対象の場所に入口から流入するセルに必要な時間の量を推定する。この時間を待って、新しい周波数を設定した後、それから（ここでは、細胞分布の2分のビデオ）を記録を開始。 </li></ol> 5。特徴分析クロスオーバー周波数のための画像処理<ol><li>計算スクリプトを使用して、相対的なy位置を決定するために、フレーム毎のビデオフレームを分析する（z方向は、チャネルの垂直深さであり、y方向はチャネル幅であり、x方向、チャネル長）の各蛍光細胞または粒子のダウンストリーム·チャネル、高誘電泳動力の領域から、x座標が指定されました。相対DISのグラフを作成します。tribution。 </li><li>コントロール分布の中心線と各電圧と周波数の分布の中心線を比較してください。与えられた電圧と様々な周波数では、中心線がコントロールのy位置と一致するクロスオーバー周波数を決定する。 </li></ol> 6。細胞選別または濃縮を行うために実験を変化<ol><li> 3×10 6粒子/ mlの総濃度でDEPバッファ内の所望の混合物を一時停止します。ここでは、この混合物をDEPバッファ内の4ミクロンの蛍光ビーズとMOSE-L細胞である。のcDEP素子を作製するために、前述の手順を実行します。 </li><li>混合物からの細胞を選別または濃縮するために、前述したように、標的細胞とのバックグラウンド粒子のクロスオーバー周波数を決定する。粒子の二つの集団が反対の（d）にDEP力を受けるように、標的細胞とのバックグラウンド粒子を2クロスオーバー周波数の間の周波数で動作する実験irections。 MOSE-L細胞と4μmのビーズを並べ替えるには、11.90±0.63 kHzを超えるマイクロデバイスを操作してください。最近Salmanzadeh ら 33により報告MOSE-L細胞の第一のクロスオーバー周波数</li><li>ソートされたサンプルの内容を収集するために、出口開口部にグローブの指を置き、ゆっくりとチューブに引っ張ることで、ターゲットボリュームを集める際に出口チューブを外します。さらなる分析のために貯水池に集め、ターゲットボリュームを注ぐ注：他のサンプル回収方法は、チップへの恒久的な貯蔵器を取り付け、簡単なピペッティングして、サンプルを除去することを含む可能性があります。 </li></ol>

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</ol>

博士ラファエルDavalosは、非接触型誘電泳動のための特許を申請中。

DEPは、粒子の誘電特性を決定し、隔離、または濃縮アプリケーションを並べ替えるに向けて粒子運動を指示するための強力な手法です。原因サンプルと直接電極コンタクトの有害な影響に、他の人が接触しないように、以前に提示した方法と同様のアプローチをとっている。例えば、バシルら、薄いガラスカバースリップによりプリント回路基板電極から分離されたPDMSマイクロ流体デバイスを用いて非接触DEP装置を開発し、この技術は、ビデオフォーマットで利用可能にされる。23,36を ここでは、単一のPDMS基板を用いたのcDEPチップと前記流体の電極の製造、及び細胞および蛍光ビーズの混合物から卵巣癌細胞を分離するための実験プロトコルを示している。記載した技術は、正常LIVソーティングを含む、より複雑かつ生理学的に関連する種々の用途に使用されているeおよび死細胞、28腫瘍が前立腺癌細胞からの細胞、希赤血球から30の癌細胞、31,32を開始し、乳癌37および卵巣癌のステージを区別する。29のcDEPは、粒子を混合するために使用されている。38これらのアプリケーションが提示単純な技術を用いて、多様な目的は、チャネルの形状の設計を変更することによって簡単に達成することができることを示唆している。 。DEPは、粒子の操作のためのマイクロスケール上で有用である球状粒子のための13、並進誘電泳動力の大きさと粒子の電気的特性とその懸濁媒体だけでなく、乗 ​​電場の勾配によって異なります。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> εmは懸濁媒体の誘電率であり、rは半径である粒子、およびRC [K（ω）]クラウジウス-モソッティ（CM）因子の実数部である。 CM係数は懸濁媒体と比較して、粒子の相対的な分極率の尺度であり、誘電泳動力の方向を決定する。それは次のように記述されている<img alt="式2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> どこ<img alt="式3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" />と<img alt="式4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" />粒子と媒体との複合体誘電率は、それぞれ、である。複素誘電率、 <img alt="式5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> 、導電率（σ）と周波数（ω）に依存します。球状​​粒子のCMの係数は、理論的には-0.5と1との間で結合されている。 CM係数が負である場合には媒体は、粒子よりも分極性であるため、粒子が領域から離れるので、粒子はNDEPを体験高電界勾配。 CM係数が正である場合、粒子が媒体より分極​​可能であり、それらは高電界勾配の領域に向かって移動するPDEPを経験する。 細胞のような構造において不均一である生物学的粒子、例えば、クラウジウス - モソッティ因子は、粒子の誘電率の有効値から決定することができる。 <img alt="式6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> どこ<img alt="式7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" />と<img alt="式8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" />それぞれ、例えば、細胞質、細胞内部の効果的な複素誘電率と、原形質膜の複素誘電率であり、rはセルの半径であり、dは、原形質膜の厚さである26。 DEPは中に浮遊する粒子を発生した場合流体は、流体に対する粒子の相対運動は、粒子上に抗力を発生する。粒子に作用する全体の力を決定するときに、この抗力を考慮しなければなりません。ここで興味のある状況では、粘性力が支配し、粒子が球状小さく、比較的低速度で移動すると仮定しているので、ストークス抗力法律は抗力のために良い近似を提供します。 <img alt="式9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> ηは流体の粘度であり、uはpは粒子の速度であり、u fはまた移動することができる流体の速度である。誘電泳動力、流体と粒子​​の特性を知られており、既知の流速が所定のドラグ力と誘電泳動力とのバランスは、粒子速度を推定するために解くことができる。細胞の経験が閾値以下である必要があり、せん断速度は、cでエル溶解が発生する可能性があります。 粒子の電気的性質の特徴付けは、彼らが、DEPの下でそれらをどのように応答するかを予測し、制御する必要がある。本研究では、特異的に細胞の第一クロスオーバー周波数を決定するためのプロトコルを示すためにMOSE-L細胞を用いた低周波のcDEPを利用し、その後、それらの対向DEP応答に基づいてポリスチレンビーズとMOSE-L細胞の連続的な選別を示した。 のcDEP装置の形状は、デバイスは、高周波数または低周波数動作のために設計することができるように、電場の空間勾配を変更し、高い選択性及び特定の細胞型のソートの効率を変化させるであろう。さらに、ハイスループットデバイスは、より広いチャネルを作製することによって開発することができ、並列、又は電極30内のチャネルは比較的深い垂直に上方および下方に積層された多層の製造35、30チャネルサンプルチャネル。薄い膜は、層の間に障壁を形成する。ポリメチルメタクリレート（PMMA）で製造されたデバイスおよびポリカーボネート（PC）膜を用いた予備試験はMOSE-L細胞のDEP応答を実証した。現在の努力は、多層の高スループットデバイスを絞り込み、最終的プラグ·アンド·プレイ·プラットフォームに向かって周辺システムを改善するために進行中である。提示され、基本的な実験手法から展開するには、デバイスのアプリケーションと仕様は、このような特性評価に対してソート、またはデバイスにサンプル貯水池や半自動化システムを追加するなどの特定の要求に適合するように調整することができる。

生物学的サンプル濃縮および粒子選別、その後の分析のためにしばしば必要である。1は例えば、体液から稀な細胞の単離は、癌の検出および個別化医療において重要な用途を有する。2,3最も一般的に使用される濃縮技術は、蛍光活性化細胞選別である（FACS 4）細胞を区別するために発現される表面マーカーに依存ソーティング（MACS）、磁気活性化細胞、5。他の戦略は、流体力学6または慣性7,8ソート、光ピンセット、9 acoustophoresis、10と誘電泳動が含まれています。11,12誘電泳動は、不均一な電場の存在下での偏光の粒子の動きである。13 DEPが使用されている並べ広い応用範囲、生存能力に基づいて細胞を選別するなど、2,14、15が細胞の生体電気特性を特徴付ける、16とこれは強力な技術であるが、課題が生じ得る。17,18繁体DEPは、電圧を印加し、不均一な電場を誘導するためにマイクロ流体チャネル内にパターン平面電極を利用する。細胞の生物物理学的特性の誘起変化に13 ING、等電極剥離、電解。絶縁体ベースの誘電泳動（IDEP）19 DC電場の不均一性を引き起こす構造をパターニングして絶縁汚損、電極層間剥離、及び電極フィールドの空間的な分解の課題に対処している。 IDEPを選択的に、生存および死亡細菌細胞を分離19は、細菌胞子を単離し、20およびDNAを操作し、他の用途のうち、21に使用されている。それは多くの場合、必要​​とされる高DC電圧の結果として発生する可能性があるため、ジュール加熱が困難な場合があります。これらの課題を改善するために、非接触DEPマイクロデバイスが開発されている。22-24 22で満たされた流体電極チャンネル付きの金属電極の交換です導電性の高いソリューションを提供します。これらの流体電極は、容量的にAC電圧を介してサンプル流路に薄い絶縁バリアを越えて結合されている。電極とのサンプルの接触を排除することは、電気分解やバブル形成、サンプル汚染、電極の剥離などのDEPベースの方法に関連する問題を軽減します。それは、サンプル中の細胞の生存率をサポートしているため、結果として、のcDEPは、生物学的サンプルのために特に便利です。重要なのは、のcDEPは、サンプル無菌性を維持することができます。チップは、細胞培養フード内で調製する​​ことができ、実験は、金属電極へのサンプルの接触を必要とするか、サンプルがenvironmeに開かれることを必要とせずに行うことができるNT。単純なリザーバは、滅菌サンプル回収を容易にするために、チップ出口に固定することができる。さらに、試料チャネルと同じ生体適合性ポリマー材料（PDMS）からの流体の電極の製造は、金属電極のカスタム·パターニング、製造に要する時間で発生した高いコストを削減し、初期のパターニングに特殊なクリーンルーム設備の必要性を制限する再利用可能なシリコンウェーハのスタンプ。 DEPによる粒子の移動は、粒子および媒体、ならびに電場の空間的変化の特性に依存する。粒子および周波数に依存する因子は、クラウジウス - モソッティ（CM）因子と呼ばれる、範囲-0.5〜1の値をとり、そしてDEP力の方向を決定する。 CM係数が正確にゼロとなる周波数は、クロスオーバー周波数と呼ばれる。これは、誘電泳動力が粒子とCM率変化サインを与えない点である。 S不活性固体マイクロスフェアのためイングルのクロスオーバー周波数が発生したときに負から正へのCM係数の変化は0.01 S / M、NDEPからPDEPが10近く存在への移行を示す第クロスオーバー周波数程度の低い導電率·バッファ内の哺乳動物細胞に25。 - 100 kHzおよびサイズ、形状、細胞骨格、および細胞の膜特性に影響される。26,27 NDEP体制に対するPDEPからのシフトにおける第クロスオーバー周波数は、10MHzのオーダーであり、によって影響される核-細胞質比、細胞質導電率、および小胞体27 DEP力は、流体流の存在なしに適用することができるが、ここでは懸濁粒子の連続的な選別を達成するために、流れる流体を利用する。誘電泳動力とストークス抗力を合わせた影響は、粒子の並進運動を指示する。 我々は2つ​​の周波数範囲で動作する装置を開発した。高い周波数yのデバイス（100〜600 kHzの）は、前立腺腫瘍開始細胞（TICを）、マウスの卵巣表面上皮（MOSE）細胞、MDA-MB-231乳癌細胞として、PDEPおよび細胞の達成バッチソーティングを用いて操作、又はTHPの生きている-1選択的にサンプルチャネル内に配置ポストを絶縁に目的の細胞を捕捉することで細胞が28〜31低い周波数（5から100 kHzの）デバイスが連続的に動作し、1集団がバックグラウンドの人口の経験ながらPDEPを経験する頻度動作時NDEPは、ソーティング達成するために、粒子軌道をリダイレクトすることができる。32-34これらの低周波デバイスは、赤血球からの癌細胞をソートプログレッシブMOSE細胞株の誘電特性の変化を決定し、非影響を解明するために使用されてきた攻撃的なMOSE細胞の攻撃的な特性を逆にするに有毒スフィンゴ脂質の治療。さらに、マイクロデバイスのcDEPは、現在までを1ml /時間、スループットの向上で動作するように設計することができるR。31,35 上述したように、製造プロセスの柔軟性および低コストが提示されている実験手順は、広範囲の用途に関連することを可能にカスタム設計されたデバイスの幾何学的形状を可能にする。のcDEPの長期的な目標は、その後の培養や処理のサンプルの回収と、臨床レベルでのラベルフリー細胞選別および濃縮を実現することである。ここで紹介するテクニックは、DEPのアクセス可能性を増加させる、製作から実験を、簡単で安価な方法です。我々は、特徴付けおよび蛍光マイクロスフェアからの卵巣癌細胞の濃縮を達成するためのcDEPチップの調製および実験プロトコルを示す。

<table><tbody><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州、米国</td><td>シルガード184</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド </td><td>顕微鏡デポ</td><td>76079</td><td>2x3インチグランドエッジ</td></tr><tr><td>マイクロボアPTFEチューブ</td><td>コールパーマーインストゥルメント株式会社、バーノンヒルズ、イリノイ州、米国</td><td>EW-06417-31</td><td>薄肉20ゲージ、0.032インチID x 0.056インチOD、100フィート/ロール</td></tr><tr><td>ルアースリッププラスチックシリンジ</td><td>ナショナルサイエンティフィック会社</td><td>S7510-1</td><td></td></tr>針<tr><td>先ハ</td><td>ワード電子機器</td><td>JG20-1.0</td><td>20ゲージ1.0 "、ID = 0.025 "OD = 0.036 "</td></tr><tr><td>D(+)-ショ糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー</td><td>州S3-500</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース、試薬ACS、無水</td><td>アクロス有機NV、フェアローン、ニュージャージー</td><td>州</td>AC410955000 <td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>112-025-101</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM, Molecular Probes</td><td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td><td>C3100MP 励</td><td>起波長 488/発光波長 516</td></tr><tr><td>Rhodamine B, O</td><td>Science Lab</td><td>SLR1465-100G</td><td>励起波長 540/発光波長 625</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (10X)</td><td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td><td>RC-147</td><td></td></tr><tr><td>Leica,倒立光学顕微鏡 </td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DMI 6000B</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC420, カラーカメラ</td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DFC420</td><td></td></tr><tr><td>Function generator </td><td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td><td>GFG-3015</td><td></td></tr><tr><td>Wideband power amplifier </td><td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td><td>AL-50HF-A</td><td></td></tr><tr><td>HFHV Output変圧器</td><td></td><td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td><td></td></tr><tr><td>高電圧増幅器</td><td>トレック</td><td>モデル 2205</td><td></td></tr><tr><td>USB モジュラー オシロスコープ、100 MHz</td><td>AgilentTechnologies</td><td>U2701A</td><td></td></tr><tr><td>拡張プラズマ クリーナー</td><td>ハリック プラズマ</td><td>PDC-001/002 (115/230V)</td><td>エア プラズマ</td></tr><tr><td>スコッチ マジック テープ</td><td>3M</td><td></td><td>任意の利用可能な幅で十分です</td></tr><tr><td>1.5 mm パンチャー </td><td>Harris Uni-Core</td><td>Z708836-25EA.25</td><td></td></tr><tr><td>% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8858</td><td>4.0 &mu;m、赤色蛍光灯(励起波長580/発光波長605)</td></tr><tr><td>AZ 9260フォトレジスト </td><td>AZエレクトロニックマテリアル</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>AZ400K 現像液</td><td>AZエレクトロニックマテリアル</td><td></td><td></td></tr>ズ 水<tr><td>酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)25%</td><td></td><td></td><td>バージニア工科大学製クリーンルーム</td></tr><tr>ド<td>リー機シリコンを使用してテ</td><td>フロンコーティング</td><td></td><td></td>を施す</tr><tr><td>ウェーハ</td>大学<td>ウェーハ</td><td>452</td><td>100 mm直径、500 &mu;m thickness, one side polished (SSP) </td></tr><tr><td>Deep Reactive Ion Etching(DRIE)</td><td>Alcatrel</td><td>AMS SDE 100</td><td></td></tr></tbody></table>

非接触型誘電泳動によりラベルフリーの単離と細胞の濃縮

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

誘電泳動（DEP）は、不均一な電場中の粒子が並進運動を偏光していることにより現象であり、表面マーカーに依存しない方法で微粒子の動きを指示するために使用することができる。伝統的に、DEP装置は、サンプルチャネルにパターニング面状の金属電極を含む。このアプローチは、高価であり、特殊なクリーンルーム環境を必要とすることができる。最近では、非接触型誘電泳動（のcDEP）と呼ばれる非接触のアプローチが開発されている。この方法は、単一のポリジメチルシロキサン（PDMS）基板からの流体の電極とサンプル流路をパターニングして、電極と試料との間の直接接触を回避しながらDEPの古典的な原理を利用し、微粒子をソートし、濃縮するために設計された迅速なマイクロ流体戦略としての用途を有する。この方法に固有の分離された高導電性流体を含む流体の電極チャネルを介して電界が生成されることである薄い絶縁バリアによってサンプルチャネル。金属電極を直接試料に接触しないので、電気分解、電極層間剥離、および試料汚染は回避される。さらに、これは、安価で簡単な製造プロセスを可能にする。 のcDEP従って、敏感な生物学的粒子を操作するために適している。粒子に作用する誘電泳動力は、装置の幾何学的形状のカスタマイズ可能な設計により発生する電界の空間的変化が、細胞の固有の生物物理学的特性に依存するだけでなく依存する。このように、のcDEPはまだ生体粒子の特性、濃縮、および並べ替えを可能にしながら可変、集団内で発現させることができる表面発現分子バイオマーカーに応じて、回避ラベルフリー技術です。 ここでは、のcDEPを使用して製作し、実験の基本を示しています。我々はソフトリトグラフを使用してのcDEPチップの簡単な準備を説明Yテクニック。我々は、粒子または細胞のクロスオーバー周波数、誘電泳動力がゼロとなる周波数を特徴付けるための実験手順について述べる。最後に、我々は、卵巣癌細胞の混合物を選別し、微小球（ビーズ）蛍光を発するためのこの技術の使用を示す。

DEPは、電界が存在しているときにデバイスが動作しているを確認するためにサンプルチャネルで定性的に観察されるべきである。 DEPの存在をテストする1つの方法は、はるかに強力なPDEPとNDEPが予測され、クロスオーバー周波数PDEPとInほとんどの哺乳動物の癌細胞のためにNDEPを観察する&lt;10 kHzのを観察する（およそ&gt; 40 kHzのからの値に周波数を調整することです）100μS/ cmの導電率のバッファ。それは、不活性微小球がそのクロスオーバー周波数より上、そのクロスオーバー周波数以下PDEPを示し、NDEPことに留意すべきである。ここで紹介するノコギリフィーチャジオメトリの場合は、PDEPは低い試験周波数にいる間、NDEP、パールチェーン化とチャンネルのノコギリの特徴エッジでの細胞または粒子の集束の発生によって示される、高いテスト周波数でセルに見られるべきである細胞は、チャネルのストレートエッジにより近い領域に制限されるように明らかなはずである。これらの低周波数では、細胞は、Lysよい原因エレクトロポレーションへのEので、サンプルが少ない細胞を含むように表示されることがあり、酵素的に活性化蛍光色素を用いた場合に表示されているものが拡大、ぼやけて表示されることがあります。 PDEPおよびNDEPが発生する周波数の確認プロトコルに記載のようにクロスオーバー周波数を決定することができる。ここで用いられるようなMOSE-Lなどの哺乳動物の癌細胞に関しては、60 kHzの（ 図5b）で5 kHzの（ 図5a）と強いPDEPでNDEPを観察した。 MOSE-L細胞は17.7±3.3であった（n = 268セル）の直径を有し、ビーズを4ミクロンの公称直径を有する。進行の早い段階でMOSE細胞と比較してMOSE-L細胞の誘電特性の完全な分析はSalmanzadeh らによる最近の研究で見つけることができます。33 PDEPとNDEPはこれらの両極端で観察されていない場合は、様々な問題が発生している可能性があります。試料の導電率は、汚染物または細胞溶解に対して高すぎる可能性があります。 Insufficientの電界は、サンプルチャネルに隣接するチャネルの部分への電流の伝導を防止する流体の電極チャネルに捕捉された気泡を生成することができる。非定常流に起因する不十分貼りPDMSの離層に、注射器または入口管にトラップされたバブルに起因する十分な時間、真空下でデバイスを保っていないか、すぐに真空から除去する際に、デバイスを充填しないから生じる気泡漏れすることがありポンプの動作範囲の極値でチャネルを充填し、又は流量時、スライドガラス、過度の力に対するバリア膜中の涙が加わる。 細胞のクロスオーバー周波数を決定することに加えて、この技術は、MOSE-L細胞およびビーズの混合物によってここでは図示混合物を、ソートするために使用することができる。この例では、MOSE-L細胞は、正の誘電泳動（PDEP）を経験周波数で4μmのビーズが示す負の誘電泳動（NDEP）を利用しています。我々O200 V RMSおよび10 kHzの（図6a）でデバイスをperated、それらがNDEPを経験したように、細胞およびビーズの両方を混合したことを観察した。ビーズを二つの成分（ 図6b）に混合物の分離を可能に、チャネルの下側部分に制限している間50 kHzで、我々は、チャネルの上部にMOSE-L細胞の動きを観察した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> 図5。 MOSE-L細胞の位置は、印加電界の周波数を変化させることにより操作される。写真はサンプルチャネルの最終鋸歯特徴で採取され、流体電極は右側の隅に位置している。それらは、PBSチャンネルを可視化する蛍光を発するローダミンBを含有する充填されている。（a）の MOSE-L細胞は200 V RMSでNDEPを体験<html>と5 kHzの。（B）MOSE-L細胞は、200 V RMS、60 kHzで真珠のチェーン化とPDEPを体験。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> 図6。 MOSE-L細胞（緑色）および4ミクロンビーズ（赤色）の混合物を 200 Vで（a）の低周波のcDEP装置のサンプル流路の最終鋸歯状の特徴を通って流れ 、10kHzの細胞およびビーズを混合する。矢印は、200 Vで（B）。かすかに可能性が高いため、低周波条件に死亡した細胞を登場をポイントし、50 kHzの細胞がPDEPを体験し、チャネルの特徴エッジに移動し、ビーズがNDEPを体験しながら、地域のより近くに閉じ込められたままストレートエッジ。p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

非接触誘電泳動（のcDEP）は、それらの本来の誘電特性を経由して、ソートや粒子の濃縮実現しています。流体電極チャネルは、生物学的粒子の非損傷性の滅菌特性評価およびソートするのcDEPを作動特性、DEPに伝統的な金属電極を交換してください。私たちは、のcDEPのマイクロデバイスを準備し、セルのキャラクタとソート実験を行う方法を示しています。

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

この手順の全体的な目的は、電極をサンプルに接触させることなく、色素電気泳動を用いて圧力駆動流中に懸濁した細胞の並進運動を誘導することです。これはまず、目的の細胞を低電導度バッファーに懸濁させることで達成されます。次のステップとして、マイクロ流体デバイスに細胞懸濁液をロードし、電極チャネルに高電導度液体を導入します。次に、作製したデバイスを高電圧電子回路に接続し、倒立顕微鏡に取り付けたカメラからのビデオ映像によって細胞運動の周波数応答を記録します。最後のステップは、ビデオ画像を解析して細胞の電気的特性を定量的に予測することです。最終的に、非接触誘電泳動を用いることで、安価で作製が容易なマイクロ流体デバイスを使用して、異なる電気的特性を持つ細胞をラベルフリーかつ非破壊的に分級できることを示します。したがって、本手法は、生細胞と死細胞の分取、腫瘍開始細胞の単離、ステージに基づいたがん細胞の分離、および誘電特性に基づいた異なる細胞への薬剤の影響の検討などのアプリケーションに有用です。蛍光活性化細胞分取（FACS）などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、バイオマーカーに基づく標識を必要とせず、細胞固有の生物物理学的特性に基づいて細胞を分取および特性評価できること、また、電極とサンプルの接触を排除することでサンプルの無菌性を維持できることです。もともと、従来の誘電泳動デバイスに関連するサンプル汚染、電気分解、高コストな作製などのいくつかの問題を回避する技術を開発したいと考えたことが、このアイデアのきっかけとなりました。哺乳類細胞の単離に使用します。フォトレジストと深反応性イオンエッチングを用いた既報の手順に従い、シリコンウェハーに目的のチャネル設計をエッチングし、ウェハーからのマイクロデバイスの剥離性を向上させるためにテフロンの薄層を堆積させます。液の溢れを防ぐため、ウェハーをアルミホイルで包みます。ポリメチルシロキサン（PDMS）と硬化剤DGAsをエラストマー：硬化剤＝10：1の比率で混合し、約20分間攪拌した後、ウェハ上に流し込みます。その後、ウェハを100 °Cで45分間加熱し、冷却後にスタンプのテフロンコーティングが損傷するのを防ぎます。最後に、アルミホイルを取り除きます。外科用メスでPDMSをトリミングし、チャネルの入口と出口にアクセスホールをパンチします。ここではチューブのサイズに適した鈍端パンチャーを使用しており、1.5 millimeterの鈍端パンチャーを使用します。次に、テキストプロトコルに従ってガラス顕微鏡スライドを洗浄します。Scotch Magicテープを用いてPDMSデバイスを洗浄します。顕微鏡下で観察し、チャネルが清潔であることを確認してください。次に、スライドガラスとPDMSデバイスを2分間エアプラズマにさらし、デバイスのチャネル側をガラススライドに強く押し付けます。この際、デバイスとスライドの間に気泡が形成されないように注意してください。テキストプロトコルに従って低電導度バッファーを調製します。これをDEPバッファーと呼びます。細胞をDEPバッファーに懸濁し、濃度を3 million cells/mLに調整します。ここでは、蛍光性膜透過性色素で染色した、癌化したマウス卵巣表面上皮細胞（Moss L細胞）、または末期段階の同細胞を使用します。染色後の細胞懸濁液の電導度を測定します。導電率は約 100 µS/cm である必要があります。導電率の測定値が高すぎる場合は、サンプルを遠心分離し、depth buffer で再懸濁させてから、導電率の測定を繰り返してください。このプロトコルで最も困難な点は、電極チャネルとサンプルチャネル内での気泡の混入を防ぐことです。電極チャネル内の気泡は電極接点の接続を妨げ、サンプルチャネル内の気泡は安定した流れを妨げる可能性があります。C dipマイクロ流体チップをロードする前に、気泡を回避し安定した流れを確保するために、実演された手順を必ず実行してください。また、30分間真空状態に置いてください。その間に、シリンジポンプから、ここにマイクロ流体チップを設置する顕微鏡ステージまでの距離をカバーする長さの柔軟なチューブを切断します。チューブの長さは6インチ必要です。チューブをシリンジの針先に装着してください。次に、目的の回収サンプル量をチューブの断面積で除して、必要な流出口チューブの長さを算出します。算出した長さのチューブを切断します。続いて、細胞懸濁液をシリンジで吸い上げます。チューブやシリンジ内に気泡がないことを確認します。真空装置からチップを取り出した後、流出チューブを挿入し、サンプルチャネルを速やかにプライミングします。チャネル内に気泡が閉じ込められるのを防ぐため、プライミング時にシリンジを軽く叩いてください。電極チャネルの薄い絶縁バリアの破損を避けて電極チャネルを迅速にプライミングするため、各流体電極チャネルの一方の出口に空のピペットチップを配置し、少量のbromine Bを含むPBS 200 microlitersをピペッティングします。その後、軽く叩いて流体を電極チャネルの反対端に導入します。bromine Bを含むPBSが空のピペットチップの先端まで視認して上昇するまで、緩やかな圧力を維持してください。各電極についてこの操作を繰り返します。Channel R domine Bは、蛍光標識にのみ使用されます。プライミング後、流体電極チャネルを確認します。各ピペットチップのリザーバーにPBS（R domine Bを含む）を満たします。ピペットチップのリザーバー内に気泡が形成されないようにし、気泡が見られる場合は、穏やかにピペッティングして除去してください。出口チューブを取り外し、適切に廃棄します。次に、新しい流出チューブリザーバーを挿入します。目的の量を回収してください。デジタルカメラを備えた倒立顕微鏡のステージ上にチップを設置します。シリンジをシリンジポンプに取り付け、ワイヤ電極を流体電極チャネルのリザーバーに挿入します。シリンジポンプとシリンジが確実に密着するように、1 mL/hrの速度で液体をポンプで送液します。チャネルの長さを目視で確認し、細胞の流れに妨げがなく、気泡や漏れがないことを確認してください。その後、流速を5 µL/hrに下げます。安全のため、ファンクションジェネレーター、高電圧アンプ、およびオシロスコープの電源を入れ、希望の電圧と周波数に調整して電子機器のテストを行います。本手順では、これらのパラメータは 200 volts および 20 kilohertz とします。性能が許容範囲内であることを確認した後、電源を切ります。次に、電極を高電圧アンプに接続します。流れが安定したら、任意の周波数で目的の電圧を印加します。本実験では、5～60 kHzの周波数において、電圧は200 volts RMSとしています。画像処理技術を用いて細胞応答のビデオファイルを記録し、チャネル内での細胞分布を定量化するとともに、クロスオーバー周波数を特性評価します。このため、電圧を一定に保ち、実験の開始時と終了時、および各実験ランの間で系統的かつランダムに周波数を変化させます。また、電界を印加しない状態での細胞分布である、コントロールの細胞分布を記録してください。新しい周波数待機時間（細胞が入口からモニタリング位置まで流れるのに必要な時間。その後、記録を開始する）を設定した後、テキストプロトコルに記載されている通り、クロスオーバー周波数を特性評価するための画像処理を実行します。目的の混合物をDEPバッファーに懸濁し、全濃度を3 million particles per milliliterに調整します。ここでは、この混合物はDEPバッファー中のmoss L cellsと4 µmの蛍光ビーズであり、前述の手順に従って操作を行います。CEPデバイスを準備するには、標的細胞とバックグラウンド粒子の決定された2つのクロスオーバー周波数の間の周波数で実験を行い、2つの粒子集団が互いに逆方向のDEP力を受けるようにします。各種サンプルの内容物を回収するには、目的の量に達した時点で、出口の開口部をグローブを着用した指で押さえながら、チューブをゆっくりと引っ張って取り外します。回収した目的の量を、さらなる分析のためにリザーバーに注ぎます。本研究で使用したL細胞などの哺乳類がん細胞では、5 kHzで負のDEP、および強い正のDEPが観察されました。60 kHzにおいて、MOS L細胞の直径は17.7 ± 3.3 µmであり、ビーズの公称直径は4 µmです。この手法は、細胞のクロスオーバー周波数を決定することに加えて、ここに例示するMOS L細胞とビーズの混合物のような混合物を分級するためにも使用できます。この例では、MOS L細胞が正の誘電泳動を示す周波数において、4 µmのビーズが示す負の誘電泳動を利用しています。デバイスを実効値200 V、10 kHzで動作させた際、ここに緑色で示される細胞と赤色で示されるビーズは、ともに50 kHzで負のDEP（誘電泳動）を受けたため混合されました。MOS L細胞がチャネルの上部へ移動する一方で、ビーズはチャネルの下部に留まったため、混合物を2つの成分に分離することができました。この手順に続き、細胞培養や免疫蛍光イメージング、あるいは生化学的アッセイなどの他の手法を後段で実施することで、細胞の誘電特性がその物理的特性とどのように相関しているかといった追加の疑問を明らかにすることが可能です。開発後、この手法はマウス卵巣がんモデルを用いて、代謝物による細胞細胞骨格の変化が誘電特性とどのように相関するかを生物学者が研究するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、非接触電気泳動を用いた細胞の濃縮および分取方法について十分に理解できるはずです。

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