フライトのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）100kDaのより大きなインタクトタンパク質の質量分析

この手順の全体的な目標は、100キロダルトンを超えるインタクトタンパク質をマルディ質量分析法により高感度に分析することです。これは、最初にマトリックス溶液を準備することによって達成されます。2番目のステップは、ターゲットに薄層溶液を堆積させることです。

次に、サンプルとマトリックスの混合物をターゲットに堆積します。最後のステップは、顕微鏡下でサンプルスポットを観察することです。最終的には、マルチ-質量分析計を使用して、インタクトタンパク質を分析し、質量スペクトルを記録します。

エレクトロスプレーイオン化などの他の分析アプローチに対するマルディ質量分析の主な利点は、塩、汚染物質、洗剤に対してより耐性が高いことです。マルディのもう一つの利点は、エレクトロスプレーに比べて電荷が少ないイオンを生成することです。したがって、MDIデータの取得と解釈は非常に簡単です。

レック結晶化を開始するには、Pyrexqueに10ミリリットルの40%エタノールを注ぎます。次に、ウォーターバスと抵抗ヒーターを使用してマトリックスの600ミリグラムで。マトリックス溶液を温め、マトリックスが完全に溶解するまで攪拌します。

ソリューションが飽和するまで、前の手順を繰り返します。溶液を室温で数時間ゆっくりと冷まし、摂氏4度で一晩保存します。結晶が形成されない場合は、ガラス棒を使用して結晶化を誘導するために、ビーカーの内側を溶液表面のすぐ下に引っ掻きます。

最後に、ろ過によってマトリックス結晶を収集します。フラスコ内の残留結晶を最小限の氷冷溶媒ですすぎ、ろ過します。ろ過が完了したら、結晶を乾燥させてマルディターゲットプレートを洗浄します。

メタノールですすぎ、キムワイプでやさしく拭きます。その後、水ですすぎ、キムワイプで拭きます。マルディターゲットを600ミリリットルのビーカーに挿入し、50%エタノールで覆います。

次に、ターゲットをエタノール溶液中で超音波洗浄し、超音波浴で10分間超音波処理します。プレートに残留物が残っている場合は、前の手順を繰り返します。ターゲットをメタノールで洗い流すか、使用した溶媒に水を加えることで、サンプルの広がり方を決定します。

次に、ターゲットを傾けて、すべての液体がキムワイプに集まるようにします。窒素ガスの流れを使用してターゲットを乾燥させます。次のステップでは、α CHCAをアセトンに溶解します。

飽和溶液を作るには、10マイクロリットルのピペットチップをα CHCA飽和溶液に浸して、少量の溶液がチップ内を流れるようにします。ピペットチップでマルディターゲットにすばやく触れ、1.5ミリリットルのプラスチックチューブを使用してアルファCHCA溶液をマルディターゲットに沈着させます。α CHCAをアセトニトリルと5%ギ酸の7〜3容量比で溶解することにより、20ミリグラム/ミリリットルのα CHCA溶液を調製し、溶液をα CHCA溶液としてラベル付けします。

これに続いて、DHBをアセチルニトリルと0.1%Triフルオロ酢酸の7〜3容量比に溶解することにより、20ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルのDHB溶液を調製し、溶液をDHB溶液としてラベル付けします。α CHCA 溶液と DHB 溶液を 1 対 1 の体積比で混合します。この手順を開始する前にC-H-C-A-D-H-B溶液を取得するには、オプションのステップとして、リストされた参考文献に示されているバッファー交換によりタンパク質サンプルを精製します。

それ以外の場合は、未精製のタンパク質サンプルをMALDIターゲットに沈殿します。次に、調製したα CHCA薄層に0.5マイクロリットルのタンパク質サンプルを堆積させます。この直後に、0.5マイクロリットルのC-H-C-A-D-H-B溶液を追加します。

0.5マイクロリットルのCain標準をMALDIプレートに堆積させ、次に0.5マイクロリットルのマトリックス溶液を追加します。サンプルとカインが乾燥したら、顕微鏡でスポットを観察し、ターゲットを装置に挿入し、適切な装置のセットアップを選択できます。次に、適切な質量と電荷比の範囲を選択します。

caのスペクトルを取得し、適切なレーザー強度を使用して装置を校正します。タンパク質サンプルのスペクトルを取得します。無傷の染色体領域のMALDIトフ解析 メンテナンス1タンパク質がここに示されている。

C-H-C-A-D-H-B混合物は、S/N比と感度の点で高品質のマススペクトルをもたらしました。特に、MALDIターゲット上に沈着したタンパク質は0.5ピコモル検出できましたが、同量のタンパク質はほとんど検出できませんでした C-H-C-A-D-H-B混合物を利用したSINO NIC酸を使用すると、タンパク質の多価イオンが観察され、アキシャルマルチtoff装置の場合、ピーク分解能がマスターチャージ比に反比例するため、より高い精度で質量測定が可能になりました。さらに、C-H-C-A-D-H-B混合物を使用して、マトリックス堆積に選択した方法は薄層アプローチでした。

乾燥液滴法では、100キロダルトンを超える質量のタンパク質は検出されませんでした。単量体βコレクトアーゼタンパク質を、同様にマルチTOFで解析した。C-H-C-A-D-H-Bスペクトルは、感度と分解能の点でSINO NIC酸スペクトルよりも優れていました。

さらに、多価イオンの存在により、タンパク質の質量をより高精度に確認することができました。ここには、無傷の免疫グロブリンの分析に対するMALDIが示されています。C-H-C-A-D-H-B混合物を使用して得られたスペクトルは、SAおよびαCHCAスペクトルよりもはるかに強かった。

より具体的には、タンパク質シグナルはC-H-C-A-D-H-Bスペクトルでより高く、より高分解能でした。C-H-C-A-D-H-B混合物の使用と薄層堆積法により、大きなインタクトタンパク質の品質が大幅に向上しました。MALDIを使用して取得したマススペクトル to 装置。

提示されたプロトコルは、複数の機器を使用して高分子量タンパク質の高品質質量スペクトルを取得する方法を示しています。この種の分析を行う際には、3つのことが重要です。まず、新しく準備したメトリクスソリューションを使用します。

次に、サンプルをマリターゲットに適切に堆積させることです。そして第三に、レーザー強度などの適切な機器設定を使用すること。