フォワード遺伝的アプローチで

本手順の目的は、化学的変異導入を行い、遺伝子型と表現型の関連性を決定することで、chlamydia tritusの遺伝学的解析を行うことです。まず、化学的変異導入を用いてchlamydia tracom変異株を作製します。次に、全ゲノムシーケンシングを行い、続いてリファレンスガイドによるゲノムアセンブリを行うことで、化学的に導入されたすべての変異を特定します。

次に、変異株における表現型と遺伝子型の関連性を特定します。最後に、組換え株を作製し解析することで、表現型と遺伝子型の関連性を確認します。最終的に、古典的な化学的変異導入法と次世代シーケンシングを組み合わせることで、特定のクラミジア遺伝子の変異が目的の表現型につながることを示す結果を得ることができます。

現在、クラミジアにおける遺伝子置換法は確立されておらず、その研究のための分子遺伝学的ツールはまだ初期段階にあります。本手法は、組換えDNAによる形質転換や分子遺伝学的ツールの開発を必要とせず、個々の遺伝子産物への機能割り当てという同様の目的を達成することができます。

培養細胞を準備するには、約 1 × 10⁶ 個の vir 細胞を 25 cm² あたり、10% FBS 含有 DMEM 3 mL 中に播種し、37 °C、5% CO₂ 条件下でインキュベートします。約 24 時間後に細胞がコンフルエントに達したら、培地を吸引し、感染多重度（MOI）5 でクラミジアを感染させます。この際、200 ng/mL のシクロヘキシミドを含む DMEM-FBS を用い、総量 3 mL とします。感染から 18 時間後に変異導入を開始するため、化学薬品用フード内で、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む PBS を用いて 20 mg/mL のエチルメタンスルホン酸（EMS）を調製します。

EMSは強力な変異原および発がん性物質です。したがって、その廃棄についてはテキストプロトコルを参照してください。Vero細胞から培地を吸引し、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムを含むPBS 3 mLで1回洗浄します。

次に、3 mLのEMS溶液を加え、ドラフト内で室温にて1時間インキュベートします。インキュベーション後、EMSを除去し、1 Mの水酸化ナトリウム溶液が入った容器に入れて変異原を不活化させます。その後、細胞を3回洗浄して残留したEMSを取り除きます。続いて、200 ng/mLのシクロヘキシミドおよび25 µg/mLのゲンタマイシンを含むDMEM 10% FBS 6 mLを加え、37 °C、5% CO2条件下で48〜72時間インキュベートします。

変異導入後36時間から72時間で、インクルージョン内から細菌が消失したように見えます。インクルージョンの約10%には細菌が充満していますが、残りは空の状態となります。低張溶血によりエレメンタリーボディ（EB）を抽出するには、培地を完全に吸引除去します。1 mLの水を加え、10分間ロッキングして細胞を遊離させ、ピペッティングを少なくとも10回繰り返して細胞を溶解させます。

マイクロ遠心チューブにライセートを回収した後、5x ショ糖・リン酸グルタミン酸緩衝液（SPG）を最終濃度が 1x になるように 0.25 milliliters 添加し、-80 °C で保存します。6ウェルプレートに、1ウェルあたり 3 milliliters の 10%FBS 含有 DMEM 中に約 0.4 × 10⁶ 個の VES 細胞を播種し、細胞をコンフルエントな単層にします。その後 24 時間かけて、細胞に均一な単層を形成させます。次に、変異株 Chlamydia のストック溶液を氷上に置きます。

次に、DMEM 10%FBSを用いて、1希釈あたりの総量200 µLで10倍段階希釈したチューブを6本準備し、氷上に置きます。PBSを1ウェルあたり3 mL使用し、Vero細胞を2回洗浄します。その後、6ウェルプレートの各ウェルに3 mLのDMEMを加え、細菌希釈液を100 µLずつ2連（duplicate）で添加します。

プレートを回旋させ、均一に混合させます。感染させたプレートを15 °Cで2,700 ×g、30分間遠心分離します。その後、加湿された5% CO2インキュベーター内で37 °Cで1〜2時間培養します。

その間に、まず以下の成分を合わせて混合し、DMEM中で0.54%AROSを調製します。次に、凝集を防ぐように攪拌しながら、18.9 millilitersの加熱滅菌済み1.2%aros水溶液を混ぜ合わせます。この混合液を55 degrees Celsiusのウォーターバスで保温してください。

ディッシュから細菌懸濁液を吸引し、温めたaro溶液を6 mL加えます。フード外の室温で完全に凝固させます。次に、バイオセーフティーフード内で蓋を取り外し、さらに15分間プレートを乾燥させます。プレートが乾燥したら、二酸化炭素インキュベーターを用いて37 °Cで7〜10日間培養します。

変異株を分離する1日前には、解剖顕微鏡を用いてプラークが確認できるはずです。1ウェルあたり100 µLに1×10⁴個の細胞を播種してください。96ウェルプレートでは、24時間以内に細胞がコンフルエントになります。

解剖顕微鏡下でピックアップするプラークに印を付け、滅菌済みの1 mLバリアピペットを用いてプラークのプラグを回収します。プラークを、10% FBS、400 ng/mL cycloheximide、および50 µg/mL Gentamicinを添加した100 µLのDMEMに再懸濁させ、変異株を拡大培養するため、この懸濁液をコンフルエントなVero細胞の単層の上にオーバーレイします。

プレートを2,700 ×g、15 °Cで30分間遠心分離します。その後、細胞の50%以上が感染した時点で回収し、インキュベートします。感染は、感染後早ければ48時間、遅ければ14日後に発生します。この量の感染細胞があれば、感染細胞の低張溶血によりEVを抽出するために十分な生存細菌を保存することが可能です。培地を吸引した後、160 µLの滅菌水で置換し、室温で10分間インキュベートします。

バリアチップを用い、ピペッティングで数回吸引・吐出を繰り返して細胞を破壊し、完全に溶解させます。最後に、各溶解液 160 µL をマイクロ遠心チューブに移します。5 XSPG を 40 µL 加え、アッセイおよび目的の表現型を持つ変異体のスクリーニングを行うまで -80 °C で保存します。

変異原への曝露により、おそらく細菌の細胞死が原因で、細菌が存在しないように見える封入体が形成されます。通常、セロバーLGVL 2は感染後48時間以内に感染細胞を完全に溶解させますが、変異原による処理はこのサイクルを90時間以上に延長させることができ、我々の実験では封入体の約10%が回復することが予想されます。この図に示されているように、20 mg/mLのEMSで処理した感染Vero細胞では、未処理の対照群と比較して、感染性後代の回復が99%減少しました。

変異原処理により、小プラークを含む形態が変化したプラークも出現しました。その他の形態には、ここに示すように、顆粒状、凝集状、またはハニカム状に見えるプラークがあります。これらの研究で使用されたEMSの用量は、NGSによる実験的評価に基づくと、KCLゲノムあたり3〜30個の変異を誘発させ得ます。

密度勾配精製されたEBSは宿主細胞由来物質がほとんど含まれていませんが、本手順に従った後のゲノム調製物には、宿主DNAが約10～15%検出されます。組織培養細胞における複製能の低下、生化学的活性の消失、または細菌形態の改変などの表現型スクリーニングを行うことで、クラミジアの病原性因子の形成および維持にどのような細菌因子が必要かといった追加の疑問を明らかにすることができます。