Name: 携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 57 s
Description: 学ぶCaco-2細胞を用いた薬物送達システムの細胞障壁輸送評価法。標的ポリマーナノキャリアの経上皮電気抵抗測定と免疫染色によるバリア機能検証により、経口薬物送達の効率性を評価する。

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この作品は、RGのハワード·ヒューズ医学研究所と国立科学財団のフェローシップでサポートされ、資金は米国国立衛生研究所（助成R01-HL98416）および米国心臓協会（グラント09BGIA2450014）によって、SMに授与されました。

1。トランスウェルインサート中の細胞単層を培養<ol><li>無菌のバイオセーフティーレベル2の細胞培養フードでは、0.8ミリメートルのPETは、鉗子で（統計的有意性のために、条件あたり4ウェル）を24ウェルプレートへの挿入をトランスウェル細孔置く。フードに入るすべての材料は、エタノールで消毒しなければならない。 </li></ol> 注：フィルターの孔径は、NCの平均サイズに合った選択する必要が膜を横切る輸送を可能にするために、用いられる。また、統計学的に有意な結果を得るため、各実験条件は、同一実験内で4リピート（井戸）の最小値を必要とし、3つの独立した実験の最小値。 <ol start="2"><li>水浴中で4.5g / Lグルコース、15％ウシ胎児血清および1％ペニシリンストレプトマイシン、37℃まで熱を補充したDMEM培地を含む細胞培養培地を調製する。 </li><li>細胞培地および代わりにヒト上皮結腸直腸腺癌（のCaco-2）細胞を希釈1.5×10 5細胞/ cm 2の密度でトランスウェルインサートの上部（頂端）チャンバ内に細胞溶液の200〜400μlの。細胞培地900μlの - 700と下（基底外側）室を埋める。 </li><li>ステップ1.3に示されているボリュームを使用して37℃、5％CO 2、および3〜4日ごとに上部及び下部チャンバーに培地を交換16-21日間、湿度95％、少なくとも培養細胞。細胞単層（むしろ下記より）上記の圧力を維持するには、次の順序でメディアを交換してください。、下室からメディアを吸引上部チャンバーからの培地を吸引、新鮮な培地で上室を満たし、かつと下室を埋める新鮮な培地。 </li></ol> 2。タイトジャンクショ​​ンの経上皮電気抵抗（TEER）および免疫染色を使用して、GI上皮透過性障壁の検証<ol><li>短期保存（2週間未満）については、電解質ソリューションでSTX100電極水没たTiON（0.1〜0.15 MのKClまたはNaCl）。システムは、内部で短絡して、電極の対称性が維持されるようにEVOM電圧抵抗計の電極端子に電極ケーブルを接続します。長期保存の場合は、D.H. 2 Oで洗浄し、乾燥した、暗い状態で保管してください。 </li><li> 、電極を殺菌15分間エタノールに浸し、15秒間空気乾燥できるようにする。あるいは、電極はUVフードに格納することができる。各抵抗測定の前に、無菌電解質溶液（リン酸緩衝生理食塩水、PBS）または0.1から0.15 MのKClまたはNaCl溶液に電極を洗浄します。 </li><li>電圧抵抗計は、抵抗の設定に設定すると、垂直方向に上室短い電極とウェルの底に触れて下室で長い電極と、うまくトランスウェルインサートを含む、電極を配置。各ウェルについて、EVOMの指示が安定したら、（Ωオームで与えられる）抵抗値を記録します。 </li><li>抵抗率を計算する（RESISTAN面積に対して標準化のce;Ω×cm 2）の試料のバックグラウンド抵抗（細胞を含まないトランスウェルインサートのTEER）を減算し、膜面積を掛けることによって。抵抗率の値は、ほとんどの場合、文献に報告されている。 （説明を参照してください） </li><li> TEERは、典型的には、細胞plattingの瞬間から2〜3週間かかり透過障壁の形成を示し、最大値と高原に上昇値まで1〜2日ごとに測定を繰り返します。プラトーTEER値と​​バリアの完全性を達成するの​​に必要な時間は、細胞の継代数に応じて変化し得る。 </li><li> （バリア形成のための閾値以上等しい）高いTEERを有する細胞単層に密着結合の存在を確認するために、15分間、冷2％パラホルムアルデヒドとのインキュベーションにより細胞を固定。次いで、1μg/ mlの抗オクルディンと共に室温で30分間、それらをPBSで細胞を洗浄し、インキュベートする。再びPBSで細胞を洗浄し、7.5μg/ mlのfで室温で30分間、それらをインキュベートするluorescentlyで標識した二次抗体。バリア形成の陰性対照として低TEERでウェルを使用してください。 </li></ol> 注：抗オクルディンの代替として、代替のタイトジャンクションタンパク質に対する抗体を使用することができる。 <ol start="7"><li>慎重に固定された単層が取り付けられたフィルター膜を切除し、エピ蛍光または共焦点顕微鏡を用いて撮像するためのスライド上にマウントする。 </li></ol> 3。ターゲットキャリアの経上皮輸送を評価<ol><li>先に説明したように07、125 Iで標的とする抗体（この例では、ICAM-1に対するマウスモノクローナル抗体、抗ICAMなど）を標識する。次いで、標識された抗体（CPM）/ mgのカウント毎分で比活性を算出し、抗体上の125 I含有量を決定し、タンパク質濃度、ガンマカウンターを推定するためにブラッドフォードアッセイを使用する。 </li></ol> 注：特異性を制御するには、再非標的コーティングされたNCを調製するために使用される標識マウスIgGによる手順を泥炭。治療の貨物の輸送を研究するために、この例では、貨物にラベルを付ける手順、例えば、α-ガラクトシダーゼ（α-GAL）を繰り返します。代替物はターゲッティング剤、非特異的対照、または治療貨物のために使用することができる。代替の方法はまた、化合物を標識し、標識された対応物の濃度を推定するために使用することができる。 <ol start="2"><li>夫婦NCの表面に抗体（この例では抗ICAM）を標的ラベル。この例では、07のように、表面吸着を可能にするために125 I-抗ICAMとともに室温で1時間ポリスチレンナノビーズ（100 nmの直径）をインキュベートする。 </li></ol> 注：非固有のコントロールを使用する125 I-IgGについて。貨物の輸送をトレースするには、抗体と125 I標識貨物（この例ではα-GAL）を標的とを組み合わせて使用します。 <ol start="3"><li> 3分間13,000×gで遠心分離し、吸引によって、上清中の非塗工の対応を削除します。ピペッティングによりPBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を用いてコーティングされたNCを含むペレットを、潜在的な粒子凝集（20-30短いパルス）を破壊するために低電力で超音波処理を再懸濁する。 </li><li> NCの特性評価のために、大きさ、多分散性、および動的光散乱（ベンダーの指示に従って）を使用して、コーティングされた粒子のζ電位を測定し、数を定量化する125使用して粒子表面に抗体分子（ 例えば抗ICAM）を標的I標識ガンマカウンター。 </li></ol> 注：これらの方法は、非特異的および治療 ​​的対応物について繰り返すことができる。コーティングされた粒子のサイズは約200 nmの範囲である。 <ol start="5"><li> （ 例えば 125 I-抗ICAMのNC; 56をnCi / ml）を、125 I-抗体のNCを追加TEER＆でコンフルエントのCaco-2単層上の上部チャンバーに＃8805;背景上のCM 2×350Ω（説明を参照）（16〜21日後に播種）。 1つまたは複数の所望の時間間隔で37℃で培養する。透過障壁に対するNCの効果を評価するために、インキュベーションの前と後のTEER（セクション2.3）を測定します。 </li></ol> 注：この手順は、非特異的および治療 ​​的対応物について繰り返すことができる。 <ol start="6"><li>上下のチャンバーからの培地を回収し、37℃（上室）で0.5ミリリットルDMEMまたは1ミリリットルのdH 2 O（下室）で一回、それらを洗ってください。ガンマカウンターを用いて放射性同位元素の合計含有量の測定のための洗浄を集める。 </li><li>細胞画分の測定には、通気フィルタを切除し、 例えば、（細胞内容物を放出する）エッジの周りに切断し、10分間、1％トリトンX-100でガンマ計数管でインキュベートし、カミソリの刃を使用して、セルの測定を行う前総放射能の関連。 </li><li>私は再度125を測定するには潜在的な劣化、最初のミックスPBS中の3％BSAを700μlの200μlのトリクロロ酢酸（TCA）で（、上下、または細胞画分から）の試料300μlに輸送中のNCからまたはリース。 15分間室温でインキュベートする。一方今回は、ガンマカウンターでこのサンプルの全放射能を測定します。 </li><li>劣化したタンパク質または125 I画分（上清）から完全なタンパク質（ペレット）を分離するために、5分間3000×gで遠心分離TCAサンプル。無料の125 I画分の放射能を定量化し、遠心分離前に測定した全放射能からこの値を減算します。これは、劣化していない標識されたタンパク質の量を提供する。 </li></ol> 4。ターゲットナノキャリアの経上皮輸送のメカニズム<ol><li>ラベル以前のセクション3.1に記載されているような、私は125とアルブミンは、7を報告した。 </li></ol> 注：アルブミンは66.5であるkDaタンパク質、従って、比較的大きな物質。より大きな物体の受動輸送のための有効な制御（例えば、200nmでのNCは、ここで使用される）ものの、より小さな薬物担体の輸送を研究するときに、より小さな不活性トレーサー分子で置換されるべきである（説明を参照）。 <ol start="2"><li>アルブミン傍漏出、上記のようにトランスウェルインサート上で培養されたCaco-2単層を使用して傍細胞輸送を評価する。 </li><li>細胞単層上の上部チャンバー媒体に、125 I-アルブミン単独（漏れの基礎レベルを示すネガティブコントロール）、または125 I-アルブミンと非放射性標識された抗体標的NCS（セクション3.5を参照）のいずれかを追加します。 NC輸送をテストするときに検討したものと一致する必要があり、選択した時間間隔（秒）、37℃でインキュベートする。前、間、TEER（セクション2.3）を測定し、示されているようにインキュベートした後、その合計125 Iで無料の125 I測定のためのすべての画分を収集第3節では注意してください：125 I-アルブミンと非放射性標識されたコントロールのIgG NCの併用に加え、コントロールとして使用することができる。 </li><li>間接合部を開放するための陽性対照として、トランスウェルインサートの上部及び下部チャンバーに5mMのH 2 O 2を含有する細胞培地を追加し、30分間37℃でインキュベートする。その後、TEER（セクション2.3）を測定し、選択した時間間隔で上室への125 I-アルブミンを追加します。細胞間結合のH 2 O 2誘導性開口によって引き起こさTEER値の減衰を同定するために、インキュベーションを通して様々な時点でTEERを測定する。 </li><li>平行実験において、50μMのモノダンシルカダベリン（MDC、クラスリン依存性エンドサイトーシスの阻害剤）のいずれかでコンフルエントのCaco-2単層をインキュベートすることにより、125 Iを標的とNCのもトランスサイトと呼ばれる細胞間輸送を、評価し、1μg/ mlのフィリピン（カベオラの阻害剤媒介性エンドサイトーシス）、0.5μMのwortmann内、または20μMの[5 - （N-エチル-N-イソプロピル）アミロ]（ホスファチジルイノシトール3マクロピノサイトーシスに関与するキナーゼ[PI3K]の阻害剤）（マクロピノサイトーシスとCAMを介したエンドサイトーシス15の阻害剤EIPA）。 </li></ol> 注：125 I-NCのIgGを125 I-アルブミンは、これらの阻害剤の効果についてのネガティブコントロールとして使用することができる、他の方法（例えば、siRNAの技術）は、より選択的阻害を提供することができる。 <ol start="6"><li>単層透過性に対する阻害剤の効果のための追加コントロールとして、その間、および阻害剤および放射性標識された物質で細胞をインキュベートした後、前にTEER（セクション2.3）を測定します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上述の方法を用いて、細胞壁を越え標的NCの輸送を研究するための細胞モデルは、このような場合には血液中にGI管腔から輸送を評価することに関連したCaco-2上皮細胞を、示した例のように、確立することができる経口薬物送達システム。トランスウェルインサート中のGI上皮細胞単層の培養は、細胞透過性障壁の形成を確認するために、タイトジャンクショ​​ンのTEERおよび蛍光免疫染色の測定を可能にした。その後、125でターゲットとし、治療薬の放射能標識は、私は、消化管細胞単層へと渡ってターゲットを絞ったNCの迅速かつ高感度な定量を提供した。最後に、機構研究は、トランスポートは傍細胞経路に対する水疱性経路を介して生じるかどうかを評価するために、エンドサイトーシス阻害剤、TEERおよび傍細胞アルブミン漏出アッセイを用いて塗布した。 私は同様のモデルを確立する上で重要なパラメータ細胞型の選択は、研究対象の細胞のバリアの生理的性質を反映すべき、だ。ヒトまたは動物起源からの様々な上皮細胞および内皮細胞が16,18-20市販されている。これらは、16,18...

外部環境と内部区画の間のゲートウェイとしてのボディの行為中の細胞の障壁。これは、胃腸（GI）管および血流1-3の外部露出面を分離する上皮層の場合である。携帯の障壁はまた、血流と実質および組織や臓器の細胞成分との間のインタフェースを表す。体内でこれらの細胞障壁を横断する能力は、治療薬および診断薬の効率的な送達のために重要である1これは、血液などの肺関門、血液脳関門のような血管内皮の内側ライニングの場合である循環へと介入が必要とされる組織/器官。 治療薬または診断薬の送達を改善するために、これらの化合物は、サブミクロンナノキャリア（NCS）にロードすることができる。これらの薬物送達ビヒクルは、様々な製剤化することができる薬物の溶解性、保護、薬物動態、リリース、および代謝4,5を最適化するための化学的性質と構造。 NCはまた、治療上の処置が必要とされる2,6身体の領域への接着を容易にするために、親和性またはターゲティング部分（ 例えば、抗体、ペプチド、糖、アプタマーなど ）で官能基化することができる。携帯障壁の表面に発現決定にNCの標的化は、さらに2,6におよび/ ​​またはこれらのライニングを横切る輸送を容易にすることができる。 選択的に2環境の間の物質の輸送の役割は、細胞層の中で、特定のユニークな機能を必要とします。一つのこのような特徴は、キャビティの内腔に面する頂端膜は、膜の形態および脂質、トランスポーター、および受容体2の組成物に関して、組織の間質に向かって配向基底膜まで変化することにより、細胞極性である。もう一つの特徴は、細胞間を必要とするjunctio隣接するセル間を接続NS。タイトジャンクショ​​ンを形成するタンパク質の制御、特に接合部接着分子（JAM）、オクルディン、およびクローディン、選択的傍細胞輸送として知られている細胞、間の物質の輸送を可能にするかどうバリア機能を調節し、内腔から材料の許可通過に基底外側のスペース3。体内の細胞の障壁に多くの天然および合成の要素（白血球、分子、粒子、および薬物送達システム）の結合はのアクセスの危険なので、一過性で比較的無害またはより長期であってもよい細胞ジャンクショ​​ンの開口を誘導することができバリア2,5,7-9全体の不要物。したがって、この経路は、アミンの電流または増加傍漏れに対する抵抗を減少することにより、経上皮電気抵抗（TEER）及び（本明細書傍漏れと呼ばれる）分子の受動傍細胞拡散を測定することによって評価することができる基底外側空間にRT化合物は、それぞれ5,10,11、細胞間結合の開放を示している。染色はすべての細胞周辺5,10,12の周囲に細胞-細胞境界に集中して表示される場所、これらの方法を補完するために、上記のタイトジャンクションタンパク質のいずれかは、それらの完全性を評価するために染色することができる。 あるいは、クラスリン被覆ピットやカベオラと呼ばフラスコ状の膜陥入に関連するものなどの特定の細胞表面決定基を標的とする薬物送達システムは、細胞内区画5への薬物送達のための道を提供し、エンドサイトーシスによって細胞に小胞の取り込みをトリガすることができる13。また、エンドサイトーシスは、側底側のリリースのために細胞体全体に小胞の人身売買にtransyctosis、または経細胞輸送14と呼ばれる現象を引き起こすことがあります。そのため、エンドサイトーシスの動態とメカニズムについての知識は、細胞内のAを活用するために用いることができる傍細胞経路に比べて納期の比較的安全かつ制御モードを提供していますND経薬物送達、。エンドサイトーシスの機構は、古典的経路の調節因子（クラスリンとカベオリン媒介エンドサイトーシス、およびマクロピノ）または（例えば、細胞接着分子（CAM）を介したエンドサイトーシスの場合のような）非古典的ルートに評価することができる5,13,15 。 細胞内輸送は、多くの場合、標準的なウェルまたはカバースリップで研究されているのに対し、基底外側コンパートメントの不在は、細胞極性と細胞層を横断する輸送を研究する能力を妨げる。この障害を克服するために、細胞単層を横切る輸送は、長いトランスウェルの上部（頂端）チャンバ、細胞が付着し、タイトな単層を形成する多孔性透過膜で構成され、10,11,16,17が挿入され、下部用いて研究されている（基底外側）室（ 図1）。この構成では、輸送は、で測定することができる上部チャンバーに処置を施す細胞単層とその下の多孔質膜を通って輸送を次の、そして最終的に輸送され、材料の定量化のための下部チャンバー内の媒体を収集することにより、頂端から側底方向。側底から頂端方向への輸送は、上部チャンバー5,10,12,16から下室とその後のコレクションに最初の投与によって測定することができる。上記のように様々な技術が、TEERおよび傍細胞輸送アッセイを含む、トランスウェル上で透過障壁の形成を確認するために存在する。また、細胞が培養された通気フィルタは、さらに、細胞単層モデルの検証ならびに輸送のメカニズムとして、（蛍光、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡法により）イメージング分析のために除去することができる。異なる孔サイズ、材料、および表面エリアで利用可能である膜型の選択は、種々のファクトに依存する例えば、輸送される物質または物体の大きさ、細胞型、及び撮像方法としてrsを16,18-20。トランスウェルインサートはまた、チャンバーおよび細胞表面領域のボリュームは既知の定数であり、哺乳動物のような複雑なシステムと比較して、輸送の制御された正確な定量化を容易にする。 in vivo送達に関与する多くの要因が、腸の粘液の存在を含む、せん断応力、消化酵素、免疫細胞などを排除しているが、 インビトロモデルでのこの小さな規模は、輸送に関する有用な予備情報を提供しています。 携帯障壁10,11,16,17間でのNCの輸送を研究するため、これらの方法の適応を説明するための例として、ここでは消化管上皮を通過するのNC輸送の可能性は、モデル薬物送達の通過を評価することによりモデル化した場合について説明ヒト上皮結腸直腸腺癌（のCaco-2）細胞の単層を介してシステム。この目的のためにあり、cのエルは透明であり、顕微鏡イメージングのために使用することができる0.8μmの細孔ポリエチレンテレフタレート（PET）フィルター（6.4ミリメートル直径）上で、トランスウェルインサートで培養した。透過障壁の状態がTEER、コントロール物質、アルブミン、タイトジャンクショ​​ンの元素の蛍光顕微鏡可視化、オクルディンタンパク質の頂端から側底輸送を測定することによって検証される。標的ポリマーNCのモデルを100nm、非生分解性ポリスチレンナノ粒子からなる、使用される。 NCは、表面だけでは標的とする抗体との吸着または標的とする抗体の組み合わせの成分のいずれかが放射性同位元素のトレースのための125 Iで標識することができる治療貨物によってコーティングされている。選択された例では、抗体は、細胞間接着分子-1（ICAM-1）を認識し、タンパク質が細胞内および経細胞輸送oをを促進することが示されているGI上皮（および他の）細胞の表面上に発現<html> F薬物担体とその貨物21。カーゴは、α-ガラクトシダーゼ（α-ガラクトシダーゼ）、ファブリー病、遺伝リソソーム貯蔵障害22の治療のために使用治療用酵素である。 サイズが約200nmのコーティングされたNCのは、上のNC 125 Iは、細胞単層に関連するおよび/ ​​または検出することができ、その後、細胞単層上に先端チャンバーに添加し、そして様々な時間にわたって37℃でインキュベートし細胞下の側底室に搬送される。無料の125 Iの追加の決定は、コーティングされたNC輸送の劣化した分と推定の減算を可能にする。経細胞輸送は、エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスの経路を調節する際の輸送の変化を調べることによって決定される輸送の機構はさらに、上述のパラメータを介して、傍細胞経路に関連する透過障壁の変化を調べることにより評価される。 ontent &quot;&gt;これらの方法は、完全に細胞の障壁を横切る薬物送達のための潜在性の評価を可能にする、貴重なセルラバリア·モデルに関する情報、薬物送達システムの輸送の程度と速度、およびそのような輸送の機構を提供する。

<table><tbody><tr><td>トランズウェルが</td><td>BDファルコン</td>を挿入 <td>353095</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルスミディアム(DMEM)、1x</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CM</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-015-CV&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>溶連菌ペン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒト上皮性結腸直腸腺癌(Caco-2)細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-37TM&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>125ヨウ素</td><td>パーキン エルマー</td><td></td><td>NEZ033H002MC 放射性ハザード</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝液 生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-235</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Equitech Bio</td><td>BAH-66</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(16%)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15710</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス免疫グロブリンG(IgG)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>015-000-003</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒトICAM-1に対するマウスモノクローナル抗体(抗ICAM)</td><td>Marlin 1987</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;-ガラクトシダーゼ、グリーンコーヒー豆Sigma</td><td></td><td>G8507-25UN</td>から<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FITCラテックスビーズ、100 nm</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>234729-500ML&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸(TCA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SA433-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>オクルージン抗体 (Y-12)、ヤギポリクローナル抗ヒト</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-27151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>モノダンシルカダベリン(MDC)</td><td>Sigma</td><td>D4008</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>フィリピン</td><td>シグマ</td><td>F9765</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>5-(N-エチル-N-イソプロピル)アミロライド(EIPA)</td><td>Sigma</td><td>A3085</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ワートマニン</td><td>シグマ</td><td>W1628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガンマカウンター</td><td>パーキン・エルマー</td><td>Wizard2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ボルトオーム計</td><td>ワールド精密計</td><td>EVOM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TEER電極</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX100</td><td>電極は、さまざまなウェルプレートに対応</td></tr><tr><td>動的光散乱(DLS)</td><td>Malvern</td><td>Nano-ZS90</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

サブマイクロキャリア（ナノキャリアは、NCは）は、溶解性、安定性、循環時間、ターゲティング、および放出を向上させることによって薬物の効力を高める。また、体内で細胞の障壁を横断することは、介入が必要とされる組織への血液から循環と輸送への治療NCの両方の経口送達のために重要である。材料は、エンドサイトーシスによって内在細胞体を通過して輸送され、分泌される一過性の隣接するセルを連動ジャンクショ​​ンの破壊、または（ii）経細胞経路を介して（I）傍細胞経路、、：携帯の壁を越えたNC輸送はによって達成される反対細胞表面（transyctosis）で。細胞の障壁を横切る送達は、輸送に関与する細胞表面マーカーに特異的に結合するターゲティング剤と治療薬またはそれらのキャリアを結合することによって容易にすることができる。ここでは、WHIのモデル細胞関門を越えて広がりとNC輸送のメカニズムを測定する方法を提供CHはトランスウェルインサートにあり、多孔質膜上に成長した胃腸の単層（GI）上皮細胞で構成されています。透過障壁の形成は経上皮電気抵抗（TEER）、対照物質の経上皮輸送、および密着結合の免疫染色を測定することによって確認される。一例として、〜200nmのポリマーのNCは、治療貨物を運び、細胞表面決定基を標的とする抗体で被覆され、使用されている。抗体または治療の貨物は、放射性同位体の追跡とラベルされたNCのために125 Iで標識されている時間の変化期間の細胞単層を介して上部チャンバーに追加されます。 NCは、細胞に関連したおよび/または下にあるチャンバに搬送を検出することができる。無料の125 Iの測定は、劣化した分を差し引くことができます。傍細胞経路は、上述したバリアパラメータNC輸送による電位の変化を測定することにより評価される。経細胞輸送iをエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス経路を調節する効果に対処することによって決定されよ。

目標とNCの経上皮輸送を研究する私たちの細胞モデルの検証として、 図2は 、Caco-2細胞単層を、合流〜12日目に到達した1.5×10 5細胞/ cm 2の密度でプレートし、18日目までの単層の完全性を維持していることを示していますTEER（ 図2A）で示される。これは、低TEER苦手タイトジャンクション標識（CM 2×17Ω、5日目と比較して高いTEER（CM 2日目14×390Ω）と単層でオクル陽性タイトジャンクション（ 図2B）の存在によって検証された）。 NC要素の放射性標識のトレースは、これらのコンポーネント（NC標的とする抗体又は貨物）の合計量は、最初に、頂端チャンバに、それらの細胞関連画分を添加決定、およびその画分は、側底側へ搬送される。これらの値は、ノースカロライナ輸送を記述する様々なパラメータを計算するために使用することができるより関連性の高い方法で、特に劣化した対応を示し...

多くの治療用途は、体内の細胞の壁を越え薬物担体とその貨物の安全かつ効率的な輸送を必要とする。この記事では、胃腸（GI）上皮のような細胞壁を越えた薬物ナノキャリア（NCS）の輸送速度とメカニズムを評価するために確立された方法の適応を説明します。

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

この手順の全体的な目的は、薬物輸送システムまたは治療剤の輸送能を評価することです。これは、経口薬物輸送に関連する胃腸上皮モデルなどの細胞バリアを通過して行われます。まず、Transwellインサート上でCaco-2細胞を培養し、細胞の分化と細胞単層の形成を促すことでこれを達成します。第2段階では、経上皮電気抵抗の測定、細胞接合部の免疫染色、および検出可能なトレーサー分子の受動的透過性の評価を行い、このモデルが透過性バリアを形成していることを検証します。次の段階では、薬物輸送システムを調製します。本例では、標的性ポリマーナノキャリアを使用しています。キャリアに薬物を封入してもしなくても構いませんが、非標的性キャリアや遊離薬物などのコントロールを含める必要があります。これらの成分は、検出を可能にするために放射性同位体で標識されています。インキュベーション後、キャリアを細胞単層上のアピカルチャンバーに添加します。異なるタイムポイントにおいて、アピカルチャンバー、バゾラテラルチャンバー、および細胞単層からキャリアを回収し、標識成分の分解の有無を試験します。最後に、輸送メカニズムを調査するために、細胞単層を通過するナノキャリアの輸送量を算出します。同様の実験を、細胞を横切るトランスサイトーシス（細胞透過輸送）の薬理学的阻害剤の存在下で、あるいは細胞間のパラセルラー輸送（細胞間隙輸送）のレポーターを用いて実施する必要があります。ここで述べる手法は、体内の細胞バリアを模した培養細胞単層における、薬剤および薬剤ナノキャリアの輸送速度とメカニズムを評価するために用いられる、確立された手法を応用したものです。ここでは、標的化ポリマーナノ粒子の胃腸上皮モデルを介した輸送の検証に焦点を当てましたが、同様の手法を、これらの細胞単層や、血流と組織・器官の間のバリアを通常形成する血管内皮細胞などの異なる細胞単層を通過する、さまざまなドラッグデリバリーシステムの検討に適用することも可能です。例えば、血液脳関門の場合などが挙げられます。一般的に、この手法に不慣れな方は、特に細胞を介して少量が輸送される場合に、ドラッグデリバリーシステムを適切に追跡するためのラベル選択に苦労することがあります。この点に関しては、研究において薬剤輸送システムの標識に放射性同位体を用いますが、もう一つの重要な懸念事項は、モデル細胞バリアの完全性を検証し、実験を通じて適切なコントロールを用いてこれを検証することです。この手順は、バイオセーフティレベル2の滅菌済み細胞培養フード内で行い、フードに入れるすべての材料はエタノールで滅菌する必要があります。統計的に有意な結果を得るため、ピンセットを用いて0.8 µmのポリエチレンテレフタレート製トランスウェルインサートを24ウェルプレートに配置します。各実験条件につき、最低4回の繰り返し操作が必要です。あらかじめ調製した細胞培地で、ヒト上皮大腸腺癌細胞またはCaco-2細胞を希釈します。200から400 µLの細胞懸濁液を、トランスウェルの上部またはアピカルチャンバーに分注します。1.5 × 10⁵ cells/cm²の密度で播種します。下層または基底側チャンバーに700〜900 µLの細胞培地を満たし、37 °C、5% CO₂、95%湿度の条件下で16〜21日間培養し、3〜4日ごとに上層および下層チャンバーの培地を交換します。細胞単層上の圧力を維持するため、以下の順序で培地を交換します。まず下部チャンバーから培地を吸引し、次に上部チャンバーから培地を吸引します。上部チャンバーに200～400 µLの新鮮な培地を注入し、下部チャンバーに700～900 µLの新鮮な培地を注入して、TEERにより上皮透過性バリアを検証します。電圧計を抵抗設定にし、トランスウェルインサートが入ったウェルに電極を垂直に配置します。短い電極を上部チャンバーに、長い電極を下部チャンバーのウェル底面に接触させて配置します。電圧計の読みが安定したら、それぞれの抵抗値をオーム（ohms）で記録します。各ウェルの測定を1〜2日ごとに繰り返し、値が最大値に達してプラトー（停滞状態）になるまで行います。これは透過性バリアが形成されたことを示しており、通常、細胞播種から2〜3週間かかります。高層の細胞単層においてタイトジャンクションの存在を確認するために、まず細胞を固定し、両方のチャンバーから培地を吸引して、温めたDMEMで細胞を3回洗浄し、冷sの2%パラホルムアルデヒドで15分間インキュベートします。15分後、パラホルムアルデヒドを除去し、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、各チャンバーに1 µg/mLの抗オクルディンを添加します。バリア形成の陰性対照として、リークの少ないウェルを使用します。室温で30分間インキュベートします。30分後、細胞を再びPBSで洗浄し、各ウェルに7.5 µg/mLの標識二次抗体を加え、室温・暗所で30分間インキュベートします。最後に、細胞をPBSで洗浄し、固定した単層が付着しているフィルターメンブレンを慎重に切り出し、スライドグラスにマウントして、落射照明、蛍光または共焦点顕微鏡を用いてイメージングを行います。本手順は、既報のプロトコルに従い、標的抗体を iodine 1 25 で標識し、標識抗体の比活性を counts per minute per microgram で算出することから始まります。この例では、特異性を制御するために、標的抗体としてヒト細胞間接着分子-1に対するマウスモノクローナル抗体（anti ICAM one）を使用します。治療用カーゴの輸送を研究するために、iodine 1 25 で標識したマウス IgG を用いて、非標的コートナノキャリアを調製します。カーゴはヨウ素125でも標識されています。この例では、カーゴとしてα-ガラクトシダーゼA（Alpha G）を使用しています。これは遺伝性リソソーム蓄積症であるファブリー病の治療に用いられる治療用酵素です。この手順において最も困難な点の一つは、輸送物質を十分に検出することです。成功を確実にするためには、ナノキャリアの成分を高い比放射能で十分な量のアイソトープで標識する必要があります。次のステップは、標識したanti ICAMをナノキャリアの表面に結合させることです。本検討では、非特異的コントロールのモデルとして、$^{125}\text{I}$標識anti ICAMを直径100 nmのポリスチレンナノビーズと単に混合します。125I標識IgGを使用し、またカーゴの輸送を追跡するには、抗ICAMおよび125I標識Alpha Gの組み合わせを使用します。表面吸着をさせるため、混合物を室温で1時間インキュベートします。1時間後、13,000 ×gで3分間遠心分離し、吸引ピペットを用いて上清中の非被覆体を除去した後、被覆ナノキャリアを含むペレットをPBS中の1%牛血清アルブミンに懸濁させます。続いて、低出力で超音波処理を行い、粒子凝集体の可能性を解消します。合流したCaco-2単層上のアッパーチャンバーに、高タイターの125I標識抗ICAMナノキャリアを添加します。タイターを測定後、非特異的対照および治療用対照についても同様の手順を繰り返します。37 °Cで、1回または数回の任意の時間間隔でインキュベートします。インキュベーション後、再度透過度を測定します。これらの透過度測定は、ナノキャリアが透過障壁に及ぼす影響を評価するためのものです。上室および下室から培地を回収します。上室を37 °CのDMEM 0.5 mLで洗浄し、下室を脱イオン水1 mLで洗浄します。細胞画分を測定するため、ガンマカウンターを用いて総放射性同位体量を測定し、これらの洗浄液を回収します。カミソリを用いて縁に沿って切り出し、透過性フィルターを切り離します。細胞内容物を放出させるため、1% Triton X 100を含むガンマカウンターチューブ内で10分間インキュベートし、その後、輸送中または潜在的な分解によってナノキャリアから放出された iodine 1 25 を測定するため、細胞結合全放射能を測定します。まず、各サンプル 300 µLを、PBS中の 3% BSA 700 µLおよびトリクロロ酢酸（TCA） 200 µLと混合し、室温で15分間インキュベートします。この15分間のインキュベーション中に、ガンマカウンターを用いてサンプルの全放射能を測定します。TCAサンプルを3000 GSで5分間遠心分離し、無傷のタンパク質を分解されたタンパク質または iodine 1 25 分画から分離します。遊離 iodine 1 25 分画の放射能を定量し、この値を遠心分離前に測定した全放射能から差し引きます。これにより、ラベル化タンパク質の量と、そこから脱離した放射性トレーサーの分画を算出できます。albumin パラセルラー漏出を用いてパラセルラー輸送を評価するため、既述の通り transwell インサート上に KCO two 単層を培養し、細胞単層上のアッパーチャンバー培地へ、漏出の基底レベルを示すネガティブコントロールとして iodine 1 25 ラベル化 albumin 単独、または iodine を添加します。$^{125}\text{I}$標識アルブミンおよび非放射標識抗体。標的型ナノキャリアを37℃で規定の時間間隔でインキュベートする。この時間間隔は、nz.Transportの試験時に検討したものと一致させる必要がある。インキュベーション前、最中、および後に、前述の手順に従って涙液量を測定する。細胞間接合の開口に関するポジティブコントロールとして、インキュベーション後にすべての分画を回収し、総ヨウ素1 25および遊離ヨウ素1 25を測定します。トランスウェルの上室および下室に、5 mMの過酸化水素を含む細胞培地を加えます。これを挿入し、37 °Cで30分間インキュベートします。涙液量を測定し、選択した時間間隔で上部チャンバーに iodine 1 25 albumin を添加します。インキュベーション中のさまざまな時点で涙液量を測定し、過酸化水素による細胞間接合の開口に起因する涙液値の減衰を特定します。並行して行う実験では、コンフルエントな Caco two 単層を各阻害剤とともにインキュベートし、iodine 1 25 標的ナノキャリアの経細胞輸送またはトランスサイトーシスを評価します。クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤である50 µMのMDC、クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤である1 µg/mLのフィリピン、マクロピノサイトーシスに関与するホスファチジルイノシトール3キナーゼの阻害剤である0.5 µMの Wortmannin、および20 µMのEIPA。マクロピノサイトーシスおよび化学媒介エンドサイトーシスの阻害剤を用い、阻害剤および放射性標識物質を細胞とインキュベートする前、最中、および後にTEERを測定した。これは、Caco-2単層膜を標的ナノキャリアの経上皮輸送モデルとして検証するために、阻害剤が単層膜の透過性に及ぼす影響を確認するための追加的なコントロールとした。Caco-2細胞をトランスウェルインサート上で1.5 × 10⁵ cells/cm²の密度で培養し、単層膜の完全性を評価するために経上皮電気抵抗（TEER）を測定した。このグラフに示すように、単層膜は12日目にコンフルエントとなり、18日目まで単層膜の完全性が維持された。この結果は、14日目に高いTEER（380 Ω·cm²）を示した単層膜において、低いTEER（17 Ω·cm²）の場合と比較して、オクルディン陽性の密接接合（タイトジャンクション）が認められたことでさらに検証された。5日目に、Caco-2細胞単層膜を介したanti-ICAMナノキャリアの輸送を評価するため、トランスウェルインサート上で培養したコンフルエントなCaco-2単層膜を、アピカルチャンバーに添加した¹²⁵I標識anti-ICAMナノキャリアと共にインキュベートした。基底側室内のIodine 1 25含量を指示された時点において測定し、上パネルに示すように、細胞あたりに輸送されたナノキャリア量を算出した。下パネルでは、輸送されたナノキャリアの割合を、基底側画分で検出されたキャリアの量を、基底側画分と細胞画分の合計量で除した比として算出した。この例で推定したIodine 1 25 anti-ICAMナノキャリアのこれらのパラメータを、非標的対照であるIodine 1 25 IgGナノキャリアのものと比較して輸送効率を実証し、その結果を上パネルに示した。放射性ラベルがナノキャリアの貨物に組み込まれている場合の、$^{125}\text{I}$抗ICAMナノキャリアまたは$^{125}\text{I}$IgGナノキャリアの輸送速度を反映した見かけの透過係数も、下パネルに示した通り算出されました。記述されたパラメータは、本例ではファブリー病として知られる遺伝性ライソゾーム蓄積症の治療に使用される$\alpha\text{-Gal}$酵素である貨物の輸送を反映しています。頂端側、基底側、および細胞画分の放射性同位体含有量を3時間後と24時間後に測定し、本表に示すように、輸送に関連するさまざまな値に換算しました。貨物を追跡してナノキャリアの輸送量を算出することに加え、この治療用酵素の上皮輸送量は、細胞あたりに輸送されたAlpha-galの分子数またはピコグラムとして推定することができます。Caco-2単層を通じた抗ICAMナノキャリアの輸送メカニズムについても検討しました。合流したCaco-2単層におけるヨウ素標識抗ICAMナノキャリアの細胞横断輸送を、以下の阻害剤（EIPA、フィリピン、MDC、またはウォートマンニン）の存在下または非存在下で24時間後に評価しました。EIPAはマクロピノサイトーシスおよびカベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤です。フィリピン、MDC、およびウォートマンニンは、それぞれカベオラ介在性エンドサイトーシス、クリン介在性エンドサイトーシス、およびマクロピノサイトーシスの阻害剤です。このグラフに示されているように、EIPAはCACO-2細胞単層を介した iodine 1 25 anti IAM ナノキャリアの輸送を減少させました。一方で、Philippine MDCおよびWirt Meninは、対照条件と比較して輸送レベルを減少させませんでした。このことは、anti ICAM ナノキャリアが経細胞輸送にcaveolae介在性エンドサイトーシスを利用しているが、clathrin介在性エンドサイトーシスやマクロピノサイトーシスに関連するトランスサイトーシスは利用していないことを示唆しています。パラセルラー輸送を評価するため、Iodine 1 25 anti ICAM ナノキャリアのCaco-2細胞単層透過中のTEERを測定した。ナノキャリア不在時のTEER値をコントロールとして示し、破線は平均値のSEMを示す。5 mMの過酸化水素を、細胞間接合の開通に対するポジティブコントロールとして使用した。これは、TEER値が基底レベルまで低下したことから確認された。さらに、5 mMの過酸化水素、IgGナノキャリア、またはanti-ICAMナノキャリアの存在下または不在下で、細胞単層を通過するiodine 1 25 albuminの視在透過係数として測定されるパラセルラータンパク質漏出を測定し、算出した。これらのグラフに示すように、過酸化水素はiodine 1 25 albuminの基底外側室への漏出を著しく増強させ、ポジティブコントロールとして機能した。anti-ICAMナノキャリアによるインキュベーションは、輸送されないコントロールのIgGナノキャリアと同様に、48時間にわたってiodine 1 25 albuminのパラセルラー漏出を変化させなかった。これらの結果は細胞間輸送を排除するものであり、anti ICAMナノキャリアが経細胞輸送にICAM介在性エンドサイトーシスを利用することを示唆した先行研究の結果と一致しています。本手順を行う際は、Transwellモデルに適した1種類以上の適切な細胞株と、適切な孔径、材質、直径などを備えた透過性フィルターを選択すること、および本手順後のドラッグデリバリーシステムの効率的な定量化のためのラベル化技術を選択することが重要です。輸送された物質の局在を特定し、さらにその状態を確認するために、蛍光法や透過電子顕微鏡などの他の手法を用いることができます。ウェスタンブロッティングを用いてタンパク質の分解を測定できます。EISAを用いて輸送担体の標的能を決定でき、薬剤カーゴの活性は分光光度法やその他の適切な手法を用いて測定できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、3次元で増殖させたCaco-2細胞のインビトロ細胞培養モデルおよびマウス腸のex vivoモデルを使用して腸のセロトニントランスポーター（SERT）の機能および発現の調節を研究するための簡単な方法を記載します。これらの方法は、他の上皮輸送体の研究にも適用可能です。...

3Dで栽培ネイティブ腸とのCaco-2細胞において上皮輸送タンパク質の機能および発現を研究するための方法

我々は、ルシファーイエロー(LY)がヒト血液脳関門のインビトロモデルであるhCMEC/D3細胞単層の明らかな細胞透過性を決定する堅牢なマーカーであることを実証するために蛍光アッセイを提示する。このアッセイを用いて、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定した。...

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

中枢神経系腫瘍にターゲティングは大きな課題です。ここで我々 はマウスやヒトの細胞を用いた血液脳腫瘍関門の in vitro...

皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

このプロトコルは、ヒト血液脳関門(BBB) インビトロ...

ヒト血液脳関門をモデル化した三重培養細胞系

このプロトコルは、ヒト網膜微小血管内皮細胞がカベオラ媒介性細胞輸送プロセスにおいて細胞間で西洋ワサビペルオキシダーゼを輸送する能力を測定することにより、内部血液網膜バリア透過性を評価するモデルとしての in vitro 内皮細胞トランスサイトーシスアッセイを示しています。...

内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

フローサイトメトリーを使用して薬物キャリアと細胞間相互作用の絶対定量を行うためのワークフローが実証され、新しい薬物送達システムのより合理的な評価が可能になります。このワークフローは、あらゆるタイプの薬物キャリアに適用できます。...

in vitroでのドラッグデリバリーシステムと細胞間の相互作用の実験的定量:前臨床ナノメディシン評価のためのガイド

このレポートでは、血液脳関門モデルを構築するための μSiM...

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外...

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。...

3次元細胞培養のための自己申告足場

学ぶCaco-2細胞を用いた薬物送達システムの細胞障壁輸送評価法。標的ポリマーナノキャリアの経上皮電気抵抗測定と免疫染色によるバリア機能検証により、経口薬物送達の効率性を評価する。

携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法

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