携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法

この手順の全体的な目的は、薬物輸送システムまたは治療剤の輸送能を評価することです。これは、経口薬物輸送に関連する胃腸上皮モデルなどの細胞バリアを通過して行われます。まず、Transwellインサート上でCaco-2細胞を培養し、細胞の分化と細胞単層の形成を促すことでこれを達成します。

第2段階では、経上皮電気抵抗の測定、細胞接合部の免疫染色、および検出可能なトレーサー分子の受動的透過性の評価を行い、このモデルが透過性バリアを形成していることを検証します。次の段階では、薬物輸送システムを調製します。本例では、標的性ポリマーナノキャリアを使用しています。キャリアに薬物を封入してもしなくても構いませんが、非標的性キャリアや遊離薬物などのコントロールを含める必要があります。

これらの成分は、検出を可能にするために放射性同位体で標識されています。インキュベーション後、キャリアを細胞単層上のアピカルチャンバーに添加します。異なるタイムポイントにおいて、アピカルチャンバー、バゾラテラルチャンバー、および細胞単層からキャリアを回収し、標識成分の分解の有無を試験します。

最後に、輸送メカニズムを調査するために、細胞単層を通過するナノキャリアの輸送量を算出します。同様の実験を、細胞を横切るトランスサイトーシス（細胞透過輸送）の薬理学的阻害剤の存在下で、あるいは細胞間のパラセルラー輸送（細胞間隙輸送）のレポーターを用いて実施する必要があります。ここで述べる手法は、体内の細胞バリアを模した培養細胞単層における、薬剤および薬剤ナノキャリアの輸送速度とメカニズムを評価するために用いられる、確立された手法を応用したものです。

ここでは、標的化ポリマーナノ粒子の胃腸上皮モデルを介した輸送の検証に焦点を当てましたが、同様の手法を、これらの細胞単層や、血流と組織・器官の間のバリアを通常形成する血管内皮細胞などの異なる細胞単層を通過する、さまざまなドラッグデリバリーシステムの検討に適用することも可能です。例えば、血液脳関門の場合などが挙げられます。一般的に、この手法に不慣れな方は、特に細胞を介して少量が輸送される場合に、ドラッグデリバリーシステムを適切に追跡するためのラベル選択に苦労することがあります。

この点に関しては、研究において薬剤輸送システムの標識に放射性同位体を用いますが、もう一つの重要な懸念事項は、モデル細胞バリアの完全性を検証し、実験を通じて適切なコントロールを用いてこれを検証することです。この手順は、バイオセーフティレベル2の滅菌済み細胞培養フード内で行い、フードに入れるすべての材料はエタノールで滅菌する必要があります。統計的に有意な結果を得るため、ピンセットを用いて0.8 µmのポリエチレンテレフタレート製トランスウェルインサートを24ウェルプレートに配置します。

各実験条件につき、最低4回の繰り返し操作が必要です。あらかじめ調製した細胞培地で、ヒト上皮大腸腺癌細胞またはCaco-2細胞を希釈します。200から400 µLの細胞懸濁液を、トランスウェルの上部またはアピカルチャンバーに分注します。

1.5 × 10⁵ cells/cm²の密度で播種します。下層または基底側チャンバーに700〜900 µLの細胞培地を満たし、37 °C、5% CO₂、95%湿度の条件下で16〜21日間培養し、3〜4日ごとに上層および下層チャンバーの培地を交換します。

細胞単層上の圧力を維持するため、以下の順序で培地を交換します。まず下部チャンバーから培地を吸引し、次に上部チャンバーから培地を吸引します。上部チャンバーに200～400 µLの新鮮な培地を注入し、下部チャンバーに700～900 µLの新鮮な培地を注入して、TEERにより上皮透過性バリアを検証します。電圧計を抵抗設定にし、トランスウェルインサートが入ったウェルに電極を垂直に配置します。

短い電極を上部チャンバーに、長い電極を下部チャンバーのウェル底面に接触させて配置します。電圧計の読みが安定したら、それぞれの抵抗値をオーム（ohms）で記録します。各ウェルの測定を1〜2日ごとに繰り返し、値が最大値に達してプラトー（停滞状態）になるまで行います。これは透過性バリアが形成されたことを示しており、通常、細胞播種から2〜3週間かかります。

高層の細胞単層においてタイトジャンクションの存在を確認するために、まず細胞を固定し、両方のチャンバーから培地を吸引して、温めたDMEMで細胞を3回洗浄し、冷sの2%パラホルムアルデヒドで15分間インキュベートします。15分後、パラホルムアルデヒドを除去し、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、各チャンバーに1 µg/mLの抗オクルディンを添加します。

バリア形成の陰性対照として、リークの少ないウェルを使用します。室温で30分間インキュベートします。30分後、細胞を再びPBSで洗浄し、各ウェルに7.5 µg/mLの標識二次抗体を加え、室温・暗所で30分間インキュベートします。最後に、細胞をPBSで洗浄し、固定した単層が付着しているフィルターメンブレンを慎重に切り出し、スライドグラスにマウントして、落射照明、蛍光または共焦点顕微鏡を用いてイメージングを行います。

本手順は、既報のプロトコルに従い、標的抗体を iodine 1 25 で標識し、標識抗体の比活性を counts per minute per microgram で算出することから始まります。この例では、特異性を制御するために、標的抗体としてヒト細胞間接着分子-1に対するマウスモノクローナル抗体（anti ICAM one）を使用します。治療用カーゴの輸送を研究するために、iodine 1 25 で標識したマウス IgG を用いて、非標的コートナノキャリアを調製します。

カーゴはヨウ素125でも標識されています。この例では、カーゴとしてα-ガラクトシダーゼA（Alpha G）を使用しています。これは遺伝性リソソーム蓄積症であるファブリー病の治療に用いられる治療用酵素です。この手順において最も困難な点の一つは、輸送物質を十分に検出することです。

成功を確実にするためには、ナノキャリアの成分を高い比放射能で十分な量のアイソトープで標識する必要があります。次のステップは、標識したanti ICAMをナノキャリアの表面に結合させることです。本検討では、非特異的コントロールのモデルとして、$^{125}\text{I}$標識anti ICAMを直径100 nmのポリスチレンナノビーズと単に混合します。

125I標識IgGを使用し、またカーゴの輸送を追跡するには、抗ICAMおよび125I標識Alpha Gの組み合わせを使用します。表面吸着をさせるため、混合物を室温で1時間インキュベートします。1時間後、13,000 ×gで3分間遠心分離し、吸引ピペットを用いて上清中の非被覆体を除去した後、被覆ナノキャリアを含むペレットをPBS中の1%牛血清アルブミンに懸濁させます。続いて、低出力で超音波処理を行い、粒子凝集体の可能性を解消します。合流したCaco-2単層上のアッパーチャンバーに、高タイターの125I標識抗ICAMナノキャリアを添加します。タイターを測定後、非特異的対照および治療用対照についても同様の手順を繰り返します。

37 °Cで、1回または数回の任意の時間間隔でインキュベートします。インキュベーション後、再度透過度を測定します。これらの透過度測定は、ナノキャリアが透過障壁に及ぼす影響を評価するためのものです。

上室および下室から培地を回収します。上室を37 °CのDMEM 0.5 mLで洗浄し、下室を脱イオン水1 mLで洗浄します。細胞画分を測定するため、ガンマカウンターを用いて総放射性同位体量を測定し、これらの洗浄液を回収します。

カミソリを用いて縁に沿って切り出し、透過性フィルターを切り離します。細胞内容物を放出させるため、1% Triton X 100を含むガンマカウンターチューブ内で10分間インキュベートし、その後、輸送中または潜在的な分解によってナノキャリアから放出された iodine 1 25 を測定するため、細胞結合全放射能を測定します。まず、各サンプル 300 µLを、PBS中の 3% BSA 700 µLおよびトリクロロ酢酸（TCA） 200 µLと混合し、室温で15分間インキュベートします。

この15分間のインキュベーション中に、ガンマカウンターを用いてサンプルの全放射能を測定します。TCAサンプルを3000 GSで5分間遠心分離し、無傷のタンパク質を分解されたタンパク質または iodine 1 25 分画から分離します。遊離 iodine 1 25 分画の放射能を定量し、この値を遠心分離前に測定した全放射能から差し引きます。これにより、ラベル化タンパク質の量と、そこから脱離した放射性トレーサーの分画を算出できます。albumin パラセルラー漏出を用いてパラセルラー輸送を評価するため、既述の通り transwell インサート上に KCO two 単層を培養し、細胞単層上のアッパーチャンバー培地へ、漏出の基底レベルを示すネガティブコントロールとして iodine 1 25 ラベル化 albumin 単独、または iodine を添加します。

$^{125}\text{I}$標識アルブミンおよび非放射標識抗体。標的型ナノキャリアを37℃で規定の時間間隔でインキュベートする。この時間間隔は、nz.Transportの試験時に検討したものと一致させる必要がある。インキュベーション前、最中、および後に、前述の手順に従って涙液量を測定する。

細胞間接合の開口に関するポジティブコントロールとして、インキュベーション後にすべての分画を回収し、総ヨウ素1 25および遊離ヨウ素1 25を測定します。トランスウェルの上室および下室に、5 mMの過酸化水素を含む細胞培地を加えます。これを挿入し、37 °Cで30分間インキュベートします。

涙液量を測定し、選択した時間間隔で上部チャンバーに iodine 1 25 albumin を添加します。インキュベーション中のさまざまな時点で涙液量を測定し、過酸化水素による細胞間接合の開口に起因する涙液値の減衰を特定します。並行して行う実験では、コンフルエントな Caco two 単層を各阻害剤とともにインキュベートし、iodine 1 25 標的ナノキャリアの経細胞輸送またはトランスサイトーシスを評価します。

クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤である50 µMのMDC、クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤である1 µg/mLのフィリピン、マクロピノサイトーシスに関与するホスファチジルイノシトール3キナーゼの阻害剤である0.5 µMの Wortmannin、および20 µMのEIPA。

マクロピノサイトーシスおよび化学媒介エンドサイトーシスの阻害剤を用い、阻害剤および放射性標識物質を細胞とインキュベートする前、最中、および後にTEERを測定した。これは、Caco-2単層膜を標的ナノキャリアの経上皮輸送モデルとして検証するために、阻害剤が単層膜の透過性に及ぼす影響を確認するための追加的なコントロールとした。Caco-2細胞をトランスウェルインサート上で1.5 × 10⁵ cells/cm²の密度で培養し、単層膜の完全性を評価するために経上皮電気抵抗（TEER）を測定した。このグラフに示すように、単層膜は12日目にコンフルエントとなり、18日目まで単層膜の完全性が維持された。この結果は、14日目に高いTEER（380 Ω·cm²）を示した単層膜において、低いTEER（17 Ω·cm²）の場合と比較して、オクルディン陽性の密接接合（タイトジャンクション）が認められたことでさらに検証された。5日目に、Caco-2細胞単層膜を介したanti-ICAMナノキャリアの輸送を評価するため、トランスウェルインサート上で培養したコンフルエントなCaco-2単層膜を、アピカルチャンバーに添加した¹²⁵I標識anti-ICAMナノキャリアと共にインキュベートした。

基底側室内のIodine 1 25含量を指示された時点において測定し、上パネルに示すように、細胞あたりに輸送されたナノキャリア量を算出した。下パネルでは、輸送されたナノキャリアの割合を、基底側画分で検出されたキャリアの量を、基底側画分と細胞画分の合計量で除した比として算出した。この例で推定したIodine 1 25 anti-ICAMナノキャリアのこれらのパラメータを、非標的対照であるIodine 1 25 IgGナノキャリアのものと比較して輸送効率を実証し、その結果を上パネルに示した。

放射性ラベルがナノキャリアの貨物に組み込まれている場合の、$^{125}\text{I}$抗ICAMナノキャリアまたは$^{125}\text{I}$IgGナノキャリアの輸送速度を反映した見かけの透過係数も、下パネルに示した通り算出されました。記述されたパラメータは、本例ではファブリー病として知られる遺伝性ライソゾーム蓄積症の治療に使用される$\alpha\text{-Gal}$酵素である貨物の輸送を反映しています。頂端側、基底側、および細胞画分の放射性同位体含有量を3時間後と24時間後に測定し、本表に示すように、輸送に関連するさまざまな値に換算しました。

貨物を追跡してナノキャリアの輸送量を算出することに加え、この治療用酵素の上皮輸送量は、細胞あたりに輸送されたAlpha-galの分子数またはピコグラムとして推定することができます。Caco-2単層を通じた抗ICAMナノキャリアの輸送メカニズムについても検討しました。合流したCaco-2単層におけるヨウ素標識抗ICAMナノキャリアの細胞横断輸送を、以下の阻害剤（EIPA、フィリピン、MDC、またはウォートマンニン）の存在下または非存在下で24時間後に評価しました。EIPAはマクロピノサイトーシスおよびカベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤です。フィリピン、MDC、およびウォートマンニンは、それぞれカベオラ介在性エンドサイトーシス、クリン介在性エンドサイトーシス、およびマクロピノサイトーシスの阻害剤です。

このグラフに示されているように、EIPAはCACO-2細胞単層を介した iodine 1 25 anti IAM ナノキャリアの輸送を減少させました。一方で、Philippine MDCおよびWirt Meninは、対照条件と比較して輸送レベルを減少させませんでした。このことは、anti ICAM ナノキャリアが経細胞輸送にcaveolae介在性エンドサイトーシスを利用しているが、clathrin介在性エンドサイトーシスやマクロピノサイトーシスに関連するトランスサイトーシスは利用していないことを示唆しています。

パラセルラー輸送を評価するため、Iodine 1 25 anti ICAM ナノキャリアのCaco-2細胞単層透過中のTEERを測定した。ナノキャリア不在時のTEER値をコントロールとして示し、破線は平均値のSEMを示す。5 mMの過酸化水素を、細胞間接合の開通に対するポジティブコントロールとして使用した。これは、TEER値が基底レベルまで低下したことから確認された。

さらに、5 mMの過酸化水素、IgGナノキャリア、またはanti-ICAMナノキャリアの存在下または不在下で、細胞単層を通過するiodine 1 25 albuminの視在透過係数として測定されるパラセルラータンパク質漏出を測定し、算出した。これらのグラフに示すように、過酸化水素はiodine 1 25 albuminの基底外側室への漏出を著しく増強させ、ポジティブコントロールとして機能した。anti-ICAMナノキャリアによるインキュベーションは、輸送されないコントロールのIgGナノキャリアと同様に、48時間にわたってiodine 1 25 albuminのパラセルラー漏出を変化させなかった。

これらの結果は細胞間輸送を排除するものであり、anti ICAMナノキャリアが経細胞輸送にICAM介在性エンドサイトーシスを利用することを示唆した先行研究の結果と一致しています。本手順を行う際は、Transwellモデルに適した1種類以上の適切な細胞株と、適切な孔径、材質、直径などを備えた透過性フィルターを選択すること、および本手順後のドラッグデリバリーシステムの効率的な定量化のためのラベル化技術を選択することが重要です。輸送された物質の局在を特定し、さらにその状態を確認するために、蛍光法や透過電子顕微鏡などの他の手法を用いることができます。

ウェスタンブロッティングを用いてタンパク質の分解を測定できます。EISAを用いて輸送担体の標的能を決定でき、薬剤カーゴの活性は分光光度法やその他の適切な手法を用いて測定できます。