Name: 培養中の細胞のための生存率アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶ培養細胞の生存率アッセイ法。ATP測定と免疫染色を組み合わせ、代謝機能と構造的健全性を包括的に評価します。赤外線イメージングによる客観的な細胞適応性解析が可能です。

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我々は、ATPアッセイにおける試薬の量を節約するという考えのためJuliann Jaumotteを認める。私たちは、これらの研究のための財政支援を提供するためのメアリー·カルーソ、デブウィルソン、ジャッキーファラーの見事な行政支援のため、製薬マイラン学校に深く感謝しています。おかげでまたHunkele恐怖の病財団とパーキンソン病と運動障害初代神経研究の彼らの財政支援のための基金によるものである。

著者はいずれも開示する競合はありません。

我々は、すべての3つの生存能力アッセイにおける信号強度が線形でプレーティング密度と相関することを見出した。ただし、すべてのアッセイは、メッキ密度が2倍または1.5倍の変化にも同様に区別されます。 N2a細胞の場合は、赤外線のアッセイは、特に低メッキ密度で、ATPアッセイよりも感度が低い。赤外線アッセイは、ATPよりも感度が低いですが、彼らは、N-アセチルシステインの高度な保護の影響を明らかにすることで、DRAQ5 +サファイアアッセイおよびα-チューブリンアッセイはよく一致している。そこに両方の​​分析と赤外線信号の用量反応ロスがあったし、すべての3の生存曲線は、N-アセチルシステインを右にシフトした。 α-チューブリンおよびATPアッセイをDRAQ5 +サファイアアッセイ（Unnithan らの図4を参照してより塩化アンモニウムのような化合物に対してより感受性であると思われるので、このオーバーラップは常に、N2a細胞の処置のすべてのタイプの観察されない。8 ）。このようにして、生存率表現型解析ESは常に平等にすべての3つのアッセイでは表されません。 ATPアッセイは、α-チュー...

生物科学の中で最も一般的な生存率アッセイは、細胞数が含まれます。これは、2013年4月29日およ ​​び2013年4月30日に、キーワードのいずれかを「 インビトロ 」や「文化」とPubMedの中で登場し、トップ（最新の）200の出版物の分析によって証明されている。これらの刊行物の中でも、手動細胞数の計数を含む23.5％用いる細胞計数アッセイは、自動化された細胞数は、イメージングソフトウェアを使用してカウントし、トリパンブルー排除。生/死アッセイは、これらの刊行物の1％で使用した。 MTT（3 - （4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて、多くの刊行物の代謝生存についてのアッセイは11％であった。文学のこの調査では、細胞数アッセイと組み合わせてMTTなどのアッセイを使用して多くの刊行物はわずか3.5％であったことを示しています。それ自体ずつ生存率アッセイを使用する傾向にもかかわらず、細胞数との組み合わせで細胞機能を評価することは私の細胞を評価するための最良の選択と思われるntegrity。残りの細胞が機能または彼らはよく、1,2に存在しているにもかかわらず、健康的ではない可能性があるため、それ自体で細胞数が十分ではない。逆に、例えばATPなどの機能措置が増加または細胞の数の並列の変化の非存在下で低下することがある。細胞数から代謝読み出しの脱共役は、ATPおよびMTTアッセイは唯一の生存率アッセイとして使用してはならないことを示唆している。今回の報告では、細胞構造および代謝機能の両方を調査する3生存率アッセイは、それ自体でアッセイは余裕がある任意の1以上の細胞の完全性のより包括的なビューに記載されている。 我々のアッセイのうちの2つは、700および800nm​​のチャネルで蛍光を測定する赤外線撮像装置を必要とする。ノイズは、より高い信号対雑音比3につながる、赤外線波長が低い。我々は4.5ログダイナミックレンジと16のビット深度、translatinを持って使用オデッセイイメージャ赤外線の2 16または65,536色合いにグラム。これは、波長ごとに色の2 8または256階調を与える8ビットのカラー画像に対比することができる。したがって、16ビットのイメージングは​​、より微細な分解能を有する。これは、元の赤外線画像は、多くの場合、プレゼンテーションのための公表された報告では緑色（800 nm）を赤（700 nm）を疑似カラーしていることに留意すべきである。オデッセイのイメージャは、一般的に西部劇4-7ウエスタンブロット法のためにと、セル内の両方に使用されます。セル内のホルムアルデヒド固定した細胞上の西部劇は、対象となる任意のタンパク質に対する一次抗体を使用し、赤外蛍光二次抗体で順番にそれらにラベルを付ける。この技術は、リンエンドポイント6のために特に有用であることが知られている。私たちにはセル西部劇では、細胞骨格タンパク質α-チューブリンまたは800 nmのチャネル内の神経細胞の微小管関連タンパク質2（MAP2）のための固定した細胞を染色する。これらのタンパク質は、高い信号対雑音比を得るために十分豊富である。また、700で私たちのプレートを染色DRAQ5染色でサファイア染色で細胞質の核のためのnmのチャネル。細胞骨格タンパク質とDRAQ5 +サファイアの汚れの両方は、このように細胞構造を反映している。 第三の生存率アッセイは、代謝機能を測定し、呼ばれて「セルタイターグロ。「このルシフェラーゼベースのアッセイにおいて、発光値がATPレベルに比例している。 ATPアッセイは一般に8-12生存細胞を定量するために使用される。細胞当たりのATP出力が毒素処置の関数として変化する可能性があるため、アッセイの名の下に単語「力価」を含むことは幾分誤った名称であり、セル番号8に比例して、したがって必ずしもである。 ATPレベルはまた、13概日リズムによって、細胞分裂および14細胞分化15によって影響され得る。 ATPは代謝の堅牢な尺度であるので、それにもかかわらず、ここに示されているATPアッセイは実施が簡単で便利です。西部劇はそのためだけではいずれか1アッセイよりも細胞の完全性のより包括的な画像を生成するセル内の赤外線を補完するために、このアッセイを使用して。それ自体が数をセルでない場合は、生存率16〜21、。

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>高価な10mlの量を購入する代わりに、100mlの量で購入してアリコートします。再構成された未使用の試薬は、-20°Cで再凍結できます。C 少なくとも 21 週間</td></tr><tr><td>18% ホルマリン</td><td>サーモ シャンドン</td><td>9990244</td><td>この固定剤を購入すると、ホルムアルデヒド粉末の計量と溶液の沸騰を回避できます。蒸気への曝露は、それにより最小限に抑えられます</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S0389</td><td>ホルムアルデヒド溶液にこれを追加することは必須ではありませんが、固定細胞の外観を改善します</td></tr><tr><td>オデッセイ ブロック</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>この魚の美容液はまとめて購入でき、-20°Cで冷凍できます。C 長期使用用</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>10% Triton-X 100 のストック溶液を滅菌水に 4 °C で保管します。C</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>フィ</td><td>ッシャーS468</td><td>1つもPBS錠剤または10x PBS溶液を購入することができますが、それらはより高価です</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>フィ</td><td>ッシャーS373</td><td>上記を参照してください</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム(250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>アジ化ナトリウムは非常に有毒であるため、粉末を購入しないでください。使用済みのすべての抗体を1xアジ化ナトリウムに4°Cで保存します。C 破片で汚染されるまで</td></tr><tr><td>マウス抗アルファ-チューブリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>この抗体は高価ですが、大幅に希釈でき、特異性が高い</td></tr><tr><td>マウス抗MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>この抗体は高価ですが、特異性が高い(In-Cell Westernsの前提条件)</td></tr><tr><td>800 nm ヤギ抗マウスIgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>他社では、赤外線二次抗体も販売しています。高交差吸着抗体を購入し、IgGの濃度はソースによって異なる可能性があることに注意してください</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>この化合物は、LI-CORによって1 mMで販売</td></tr>されていました <tr><td></td><td>サファイア LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 マルチラベルカウンター</td><td></td></tr> オ<tr><td>デッセイイメージャー</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー/ミキサー</td><td>研究製品国際</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

培養中の細胞のための生存率アッセイ

Viability Assays for Cells in Culture

顕微鏡で手動細胞数は、細胞の生存能力を評価する敏感な手段ですが、時間がかかり、従って高価である。コンピュータ化された生存率アッセイは、設備の面で高価であるが、より速く、より客観的な手動の細胞数よりもすることができます。今回の報告は、3つのそのような生存率アッセイの使用が記載されている。これらのアッセイの二つは、赤外線であり、1つが発光性である。両方の赤外線アッセイは、16ビット·オデッセイイメージャに依存しています。つの赤外線アッセイは、細胞質ゾルのためのサファイア染色と組み合わせる核についてDRAQ5染色を使用し、700 nmのチャネルで可視化される。他の赤外線分析、インセルウェスタン、細胞骨格タンパク質（α-チューブリンまたは微小管結合タンパク質2）に対する抗体を使用し、800 nmのチャネルでそれらにラベルを付けます。第三の生存率アッセイは、ATPのために一般的に使用される発光アッセイであるが、我々はコストを節約するための推奨量の四分の一を使用しています。これらの測定は、すべての線状であり、CEの数と相関LLSメッキが、感度が異なる。 3つ全てのアッセイは、時間のかかる顕微鏡を回避し、それによりサンプリング誤差を低減し、ウェル全体をサンプリングする。最後に、アッセイの全ては、容易に短期間内で実行される実験の大きな数字を可能にする、実験の終了の1日以内に完了することができる。しかしながら、それらはすべて細胞数が治療後の信号強度に比例、時には特にセルラATPのために、満たされていないという仮定に留まるという仮定に依存する。細胞は、治療後に増加又はサイズが減少した場合さらに、これは細胞数に影響を与えることなく、信号強度に影響を与える可能性がある。我々は、手動カウントを含む、すべての生存率アッセイは、いくつか補足説明に苦しむと結論が、コンピュータ化された生存率アッセイは、初期投資の価値があること。一緒にすべての3つのアッセイを使用して、細胞の構造および機能の包括的なビューをもたらす。

これらの実験における律速因子は、ATPアッセイは、持続時間が比較的短いほど、赤外線染色である。赤外線アッセイのために、我々は、8つの96ウェルプレート4枚のプレートの各々の驚異的な二つのバッチ（ 図1参照）により1日以内に染色し、走査することができると予想している。この推定は、固定の20分を想定し、洗浄30分、洗浄の30分、続いて2時間一次抗体インキュベーションを遮断する30分の洗浄を30分間、続いて1時間、二次抗体インキュベーションは、30分間のDRAQ5は+サファイア30に続く洗浄の分、4プレート用スキャン時間の34分。さらに15分には4個々のプレートの千鳥ペッティングを考慮するために洗浄のための図1に織り込まれている。データ分析のための時間は、この推計には含まれていません。 ATPアッセイの測定値は、すべての赤外線プレートについて並行して発生する場合は、12プレートは1日にアッセイすることができる - 赤外線染色のための6sおよびATPレベルのため6。 回帰分析で満足のデータ（ 図3）</st...

治療用化合物は、多くの場合、最初の生存率アッセイとin vitroで調べられます。人間の観察者によってブラインド細胞数は、細胞数の小さな変化に非常に敏感であることができますが、機能を評価しないでください。コンピュータ化された生存率アッセイは、ここで説明するように、客観的に構造および機能の両方を評価することができる。

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

本手順の全体的な目的は、単一のアッセイでは得られない細胞の健全性に関するより包括的な視点を得るために、複数の生存率アッセイを実施することである。まず、プレートに播種した細胞のATPレベルを測定して代謝機能を評価する。次に、波長800 nmの赤外線抗体を用いて、α-tubulinやmicrotubule-associated protein 2などの細胞骨格タンパク質を免疫染色する。次に、核と細胞質を700 nmで染色するため、細胞をinfrared drac fiveおよびsapphireで標識します。最終ステップとして、赤外線イメージャーを用い、alpha tubulinまたはmap two、およびdrac fiveとsapphireを700 nmと800 nmの両波長でイメージングします。最終的に、これらの発光および赤外線アッセイにより、解剖学的構造と生理学的機能の両方に関する情報が得られます。これらの手法のMTT生存率アッセイなどの既存の方法に対する主な利点は、細胞の完全性の多角的な側面を迅速かつ高感度に測定できることです。これらの手法は、治療化合物が解剖学的構造や代謝機能を保護できるかなど、神経科学や薬理学の分野における重要な疑問への回答に役立ちます。付属のプロトコルに従い、96ウェルプレートにさまざまな細胞密度で100 µLまたは200 µLの培地を用いて細胞を播種し、再懸濁させる準備として、エッジ蒸発の影響を軽減するために周囲のウェルに200 µLの滅菌水を満たしてください。細胞を37°CのCO2緩衝インキュベーター内で一晩接着させます。翌日、各ウェルに50 µLの培地が残るように、100 µLの培地から50 µLを、または200 µLの培地から150 µLを除去します。次に、2列目から6列目の内側の各ウェルに、Cell Titer-Glo試薬を25 µLずつ添加します。7〜11列のB〜D行において1:2希釈を行うため、残りのウェルで1:1希釈となるよう、CellTiter-Glo試薬を50 µL加えます。7〜11列のE〜G行では、培地を除去せず、代わりにCellTiter-Glo試薬を100 µL加え、総量200 µLで1:1希釈とします。直ちにプレートを振盪機またはオービタルシェーカーに設置し、インキュベートしながらサンプルを混合するため10分間振盪します。次に、各ウェルから60 µLを白壁の96ウェルプレートに移します。白プレートは光を検出器方向へ上方に反射させるため、透明または黒のプレートよりもルミネッセンス値が高くなります。移送中に気泡が生じた場合は、プラスチック製転送ピペットのバルブから空気を送り込んで気泡を除去してください。試薬を添加してから12分以内に、プレートをルミノメーターに設置し、発光値を読み取ります。各群の3ウェルまたは6ウェルの発光値の平均を算出し、細胞数の関数としてプロットします。付随するテキストで定義されている通り、線形で比例的な結果が得られる範囲で最大限に希釈した試薬を使用してください。これにより、赤外線アッセイのコストを削減できます。付随するテキストのプロトコルに従い、細胞を回収し、異なる密度で再播種してください。温度勾配および端部での蒸発による影響を軽減するため、周囲のウェルに200 µLの滅菌水を満たします。CO2バッファーインキュベーター内で37 °Cで一晩静置して細胞を接着させ、その後、0.1 Mリン酸緩衝液に4%ホルムアルデヒドと4%スクロースを含む固定液などの固定剤を100 µL添加して細胞を固定します。プレートを室温で20分間インキュベートし、その後固定液を除去して、200 µLのPBSで細胞を3回洗浄します。次に、ブロッキング溶液をPBSで1対1に希釈し、細胞透過剤として0.3% Triton X 100を加えます。その後、各ウェルに気泡が入らないように注意しながら、ブロッキング溶液を35 µLずつ加えます。ブロッキング溶液を入れたプレートを室温で30〜60分間インキュベートします。このインキュベーションの間に、目的タンパク質の一次抗体を希釈します。例えば、手順の最適化試験では、ブロッキングバッファーと0.3% TRITTON X 100含有PBSを1:1で混合した液を用いて、抗α-tubulin一次抗体を10,000倍に希釈します。その他の抗体希釈例として、抗α-tubulin一次抗体をブロッキングバッファーと0.3% Triton X 100含有PBSの1:1混合液で5,000倍に希釈する場合もあります。次に、ここに示す濃度の抗体を、プレート上に固定した細胞に添加します。2列目の陰性コントロールウェルについては、二次抗体のみを曝露させるため、ブロッキング液のままにしておいてください。一次抗体を含む細胞を、室温で1～2時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。次に、一次抗体とのインキュベーション後、ブロッキングバッファーと0.3% Triton X 100含有PBSを1:1で混合した液で、800 nanometer抗マウスIgG二次抗体を1:1000または1:2000に希釈して調製します。各ウェルを200 µLのPBSで10分間ずつ3回洗浄し、その後、各ウェルに二次抗体を35 µL添加します。1/1000希釈液をプレートの上半分に、1/2000希釈液を下半分に加えてください。光を遮断し、室温で1時間、二次抗体とともに細胞をインキュベートします。その後、1ウェルあたり200 µLのPBSを用いて、10分間の洗浄を3回繰り返し、未結合の二次抗体を洗い流します。次に、DRAC fiveストック溶液を10,000倍に希釈して最終濃度を0.5 µMとし、sapphireストック溶液を1,000倍に希釈して、0.3% Triton X 100含有PBSで調製します。この混合液35 µLをプレートの左半分に加えますが、2列目のネガティブコントロールウェルには何も加えないでください。プレートの右半分には、1/20,000に希釈したdrac fiveおよび1/2,000に希釈したsapphireを35 µLずつ加えます。これらの溶液中で、室温かつ遮光条件下で30分間インキュベートします。その後、1ウェルあたり200 µLのPBSを用いて、1回10分間の洗浄を3回行います。まず、強度5、解像度169 µmの設定で、赤外線イメージャーを用いてプレートをスキャンします。画質設定は「中」または「低」で十分です。次に、フォーカスオフセットを2.5 millimeters、3.0 millimeters、3.5 millimeters、4.0 millimetersと変えてスキャンし、最高のS/N比（信号対雑音比）と最も鮮明な信号が得られる条件を確認します。フォーカスオフセットを最適化した後、ソフトウェアのincel western機能を用いて、プレートの画像上に適切なサイズのグリッドを配置し、データをMicrosoft Excelにエクスポートします。700ナノメートルおよび800ナノメートルの各チャンネルにおけるすべてのデータポイントから、ネガティブコントロールウェルの統合強度の平均値を差し引きます。次に、各ウェルグループの統合信号強度の平均を算出し、最適化後の細胞密度に対する散布図としてデータをプロットします。3つのアッセイすべてにおいて、信号強度は1ウェルあたりの細胞数と有意に相関していましたが、3つのアッセイはいずれも高い直線性を示したものの、感度は同等ではありませんでした。ラット初代神経細胞において、細胞数の減少に伴い発光出力が最も比例的に変化したことから、3つのアッセイの中でA TPアッセイが最高の感度を示しました。最適試薬濃度はそれぞれ異なり、アッセイ全体的な範囲では線形性が低下していました。しかしながら、本資料で示す100,000 cells未満の播種密度においては、両アッセイとも線形性と感度を維持していました。プロテアソーム阻害剤であるMG 1 32で処理した神経芽細胞腫細胞の用量反応曲線において、グルタチオン前駆体であるN-アセチルシステインの存在下または非存在下でMG 1 32を投与したところ、N-アセチルシステインによって3つの曲線すべてが右方にシフトしました。例えば、DRAC five plus sapphireで測定したIC 50は、N-アセチルシステイン非存在下では1.64 micromolarのMG 1 32であり、N-アセチルシステイン存在下では4.64 micromolarのMG 1 32でした。これは、α-tubulinアッセイで得られた値（それぞれ1.96 micromolarおよび6.35 micromolarのMG 1 32）と同様の結果でした。しかしながら、低濃度のMG 1 32においてATPレベルが上昇しており、これはホルミシスと呼ばれる現象です。これらのデータは、処理後のATPレベルが必ずしも細胞数に比例しないこと、およびN-Acetyl cysteineが代謝機能も保護し得ることを示しています。ルミネッセンスによるATPアッセイに習熟すれば30分以内に完了でき、赤外線染色は8時間以内に容易に完了させることができます。これらの手順を試みる際は、高解像度顕微鏡と同じ方法で細胞数を測定しているわけではないことに留意することが重要です。例えば、1つの注意点として、細胞数に相関する変化がない場合でも、処理によってalpha tubulinタンパク質レベルまたはTPレベルが変化する可能性があることが挙げられます。

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