培養胚のための方法

本手順の全体的な目的は、海鞘（ホヤ）の胚細胞を解離させ、in vitroで培養することです。まず、大量の成体を育成し、次に成体から卵を単離することでこれを達成します。

その後、卵をキチナーゼで処理して卵殻を溶解させます。最後に、細胞を手動で分散させ、培養のためにプレートに播種します。最終的に、免疫蛍光染色、顕微鏡観察、電気生理学、およびカルシウムイメージング技術を用いて、細胞特異的マーカーの発現を示す結果を得ることができます。

本手順のデモンストレーションは、ポストドクの研究室にて行います。少なくとも4枚のプレートでC. elegansを成体段階まで培養し、テキストのプロトコルに従って培地および溶液を調製してください。まず、事前に調製したピーナッツレクチンストック溶液のチューブを用意し、卵の分離を開始します。

オートクレーブ滅菌済みのカバーガラスを24ウェルプレートの各ウェルに配置し、各カバーガラスにピーナッツレクチンを 200 µL 加え、室温で1時間以上インキュベートします。次に、溶液を吸引し、滅菌水を用いてウェルを洗浄します。細胞の凝集を防ぐため、ピーナッツレクチンの痕跡を完全に除去してください。

次に、滅菌済みのオートクレーブ水を用いて、アガープレートから成体のGRを洗い流し、その懸濁液を2本の滅菌済み50 milliliterコニカルチューブに回収します。チューブを氷上に最大5分間置き、線虫を底に沈殿させます。転送ピペットで水を除去し、新しい滅菌済みオートクレーブ水に交換します。線虫を 200 G で10分間遠心分離します。

最後の洗浄後、線虫を新しい滅菌水に懸濁させ、滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、再び200 Gで10分間遠心分離します。線虫が完全にペレット化していない場合は、チューブを氷上に5分間置きます。線虫が完全に沈殿したら、水を除去し、5〜6 mLの溶解液を加えます。

次に、懸濁液を5～10分間緩やかに揺らし、2～3分ごとに懸濁液を1滴カバーガラスに載せ、実体顕微鏡下で溶解を確認します。虫の72～80%が溶解したら、9 mLの卵バッファーを加えて溶解反応を停止させます。ここから先の遠心分離操作の前には、ブンゼンバーナーに点火し、卵の再汚染を防ぐために点火したままにします。上清を慎重に取り除き、溶液が透明になるまで卵バッファーを用いてペレットを3～4回十分に洗浄します。続いて、卵を動物の死骸から分離するために最後の上清を取り除いた後、ペレットを2 mLの滅菌卵バッファーに懸濁させ、卵バッファーで調製した60% sucroseを2 mL加えます。

遠心分離を行う前に、溶液中の卵をよく混ぜ合わせます。200 Gで20分間遠心分離した後、チューブを慎重に遠心機から取り出します。卵は溶液の最上層に浮いています。

したがって、ピペッターと滅菌済みの1 mLチップを使用して、卵を新しい滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移します。ラミナーフローフード内で作業し、滅菌済みの卵バッファーを用いて卵を3回洗浄します。細菌汚染の混入を防ぐため、ペレット化した卵を2 mg/mLのkinase 1 mLに再懸濁し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。

卵殻の約80%が消化されるまで、酵素の活性に応じて、室温でチューブを10～30分間ロッキングします。卵を900 Gで3分間遠心分離します。上清を慎重に除いた後、L 15培地を3 mL加え、卵を直径6 cmのプレートに移し、18ゲージの針を装着した10 mL滅菌シリンジを用いて手動での解離を開始します。

解離の程度をモニタリングするため、懸濁液を1滴新しいペトリ皿に取り、顕微鏡下で観察します。細胞の約80%が解離するまでこの操作を繰り返します。細胞の塊、未消化の卵、および孵化した幼虫を除去するため、懸濁液を5 µmフィルターで緩やかにろ過し、さらに4〜5 mLのL 15培地をフィルターに通して細胞を回収し、細胞培養に供します。

ろ液を900 Gで3分間遠心分離した後、細胞を完全L 15培地で再懸濁し、1ウェルあたり1 mLずつ分注して、プレートを湿度を保った密閉チャンバーに入れ、室温20 °Cで保存します。単離した胚性エレガン細胞を分化させるには、基質への接着が必要です。分化プロセスは播種から約2〜3時間後に始まり、約24時間持続します。

in vitroでの形態学的特徴は、in vivoのものと著しく類似しています。例えば、ここに示されているように、LMおよびPLM触覚ニューロンは、in vivoと同様に、一方が他方よりも長い2本の神経突起のみを発達させます。このことは、elegan細胞の分化を促進する分子メカニズムの少なくとも一部は細胞自律的であり、したがって再現可能であることを示唆しています。

細胞特異的なin vitroタンパク質マーカーおよび翻訳後修飾も、in vitroで観察することが可能です。例えば、ここでは、海鞘の触覚ニューロンにおいてのみアセチル化されたαチューブリンが発現していることが示されており、in vitroにおける触覚ニューロンの突起が、アセチル化αチューブリンに対する抗体で染色されています。さらに、このパネルに見られるように、培養された触覚ニューロンは毒性変異チャネルであるMEC-4(D)を発現しており、これは実際にin vivoにおいて触覚ニューロンの死を誘発します。

MEC four DPE 4G FP株から調製されたGFP発現ニューロンは、培養初期には存在しますが、その後変性します。しかし、in vivoと同様に、ここで示すようにIDEおよびダントロレンでの処理により、細胞を死滅から救済することが可能です。パッチクランプ法を用いて、培養されたsea elgan細胞におけるカリウムイオン、非選択的イオン、およびドーパミントランスポーター依存性チャネルについて検討します。

細胞のサイズが小さいため、ガラスピペットは先端を細くし、入力抵抗の増加を相殺するために後端を広い円錐状にする必要があります。さらに、吸引によってホールセルアクセスを得ようとすると細胞を損傷させる可能性があるため、ピペット先端下の膜パッチに高電圧パルスを印加する方が成功率が高くなります。この図では、電位依存性カルシウムチャネルの役割を研究するために、ION 4を用いて膜を透過させ、カルシウムの有無におけるカルシウムイメージングのためにchameleon YC 2.12を発現させた触覚ニューロンのキャリブレーションを行っています。

さらに、接触ニューロンにおける平均遊離カルシウム濃度は200 nanomolarであることが判明しました。このビデオを視聴することで、in vitroでの分離および培養方法について十分に理解できるはずです。C. elegansの胚細胞について参照してください。