2.11: ウエスタンブロット法

ウェスタンブロッティングは、多くの研究者が抗体を用いて電気泳動分離サンプル中の特定のタンパク質の存在を同定するために利用している強力な技術です。

この手法には、エレクトロブロッティング、イムノブロッティング、検出という3つの主要な段階があり、質の高い結果を得るために不可欠です。これらの段階を試みる前に、ポリアクリルアミドゲル中で変性タンパク質をサイズごとに分離するSDS-PAGEを実施する必要があります。

エレクトロブロッティングは、ウェスタン「転写」としても知られていますか?そして、「サンドイッチ」を一緒に保持するための転送カセットが必要ですか?また、タンパク質をアクリルイミドゲルから薄い膜に転写するための装置も含みます。 エレクトロブロッティングサンドイッチは、ゲルと特殊なメンブレンを2枚の濾紙で挟んだものです。 転写中、電場を使用してタンパク質をゲル内を移動させ、荷電した疎水性の相互作用によりタンパク質を膜上に閉じ込めます。

イムノブロッティングは、抗体を使用して「プローブ」します。特定のタンパク質の膜。 抗体は、他のタンパク質に結合する2つのフラグメント(Fab領域とも呼ばれる)を含む大きなY字型タンパク質です。Fab領域は、抗体が結合する特定のエピトープ、またはタンパク質の特定の部分を定義します。

モノクローナル抗体は、単一のエピトープを認識する抗体であり、その特異性からイムノブロッティングに使用される抗体タイプとして好まれています。対照的に、ポリクローナル抗体は、同じ抗原上の多くのエピトープを標的とする一連の異なる抗体です。または抗体が特異性を持つタンパク質。 線状エピトープを認識するモノクローナル抗体は、エピトープが変性または直鎖状化されたタンパク質上に確実に見出せるため、好ましい。多くの抗体はコンフォメーションエピトープのみを認識するため、これは重要です。つまり、彼らは本来の3D状態のタンパク質のみを認識することを意味します。

抗体には、Fabフラグメントに加えて、抗体を産生した動物に特異的なFc領域が含まれています。 イムノブロッティングでは、この領域は主に二次抗体のエピトープとして利用されます。検出しようとしているタンパク質に結合した最初の抗体を認識する抗体。

観察可能なシグナルを産生するために、抗体はしばしば、そのFc領域を介して、アルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどのレポーター酵素に結合されます。 これらのレポーター酵素は、基質と反応して色の変化を引き起こしたり、光の変化を引き起こしたりすることでシグナルを生成します。

これらの変化は、デンシトメトリーを使用して定量化できます。 デンシトメトリーは、画像解析ソフトウェアを使用してタンパク質バンドの密度を測定し、各バンドの密度を計算するために使用される手法です。 その後、バンドは参照標準を使用して直接定量するか、コントロールサンプルを使用して内部で制御できます。

ウェスタン転写を成功させるには、まずゲルを転写バッファー中で15分間平衡化します。メンブレンは、製造元の指示に従って平衡化する必要があります。

次に、ゲル転写サンドイッチを転写バッファーで慎重に調製し、気泡がシステム内に閉じ込められるのを防ぎます。 サンドイッチに閉じ込められた泡は、小さなピペットで転がすことで押し出すことができます。小さな気泡でさえ、タンパク質の移動を中断し、この膜の下部に見られるように不完全な移動を引き起こす可能性があります。

組み立てたら、追加の移送バッファーを移送チャンバーに注ぎ、20〜30mAで2〜3時間運転します。トランスファーバッファーにはメタノールが含まれており、これによりタンパク質の膜への結合が促進されます。

移管が完了したら、カセットを分解し、Ponceau Sなどの非特異的なタンパク質染色剤を使用して移管の品質を確認できます。 これにより、タンパク質バンドの迅速かつ可逆的な検出が可能になります。

イムノブロッティングの最初のステップは、メンブレンの残りの部分をタンパク質の希薄溶液で覆うことです。 このステップはブロッキングと呼ばれ、メンブレンをブロックし、メンブレンへの抗体の非特異的結合を減らすために実行されます。通常、ブロッキング溶液は、ウシ血清アルブミンまたは緩衝生理食塩水に溶解した無脂肪粉乳のいずれかで構成されます。 このステップは通常、シェーカーで1時間から一晩かけて行われます。

次のステップは、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体でメンブレンをインキュベートすることです。 このステップは30分から一晩かかることがあり、穏やかに攪拌して実行する必要があります。

次に、メンブレンを十分にすすぎ、非特異的バックグラウンド染色を減らし、二次抗体をブロッキングバッファーでメンブレンに添加します。 短時間のインキュベーション後、メンブレンを再び徹底的にすすいでください。

二次抗体は、それらにつながれたレポーター酵素のおかげで検出可能です。 正しい基質を添加すると、比色または化学発光の変化を画像化し、デンシトメトリー技術を使用して測定できます。 さらに、タンパク質ラダーは貴重なサイズリファレンスを提供するため、各タンパク質の線形サイズを、ラダー内のサイズマーカーに対してゲル内をどれだけ移動したかに基づいて推定できます。 イムノブロッティングで検出したタンパク質のサイズを観察することは、抗体が正しいタンパク質を認識していること、およびそれがタンパク質のモノマーであるか、または観察されるタンパク質の複数のコピーであるかを確認するための良い方法です。

何千もの一次抗体が市販されており、サンプル中の特定のタンパク質の検出と定量が可能です。ここで研究者はHIF-1の抗体を使用していますか?細胞培養中のこの酸素応答性転写因子の量を測定し、低酸素症をスクリーニングします。また、β-アクチンの抗体をローディングコントロールとして使用しました。ご覧のとおり、通常の酸素条件で培養した細胞は、低酸素条件で培養した細胞よりもはるかに少ないHIF-1を生成しました。

2Dゲル電気泳動とイムノブロッティングの組み合わせにより、タンパク質複合体の存在に貴重な情報を提供できます。ここでは、サンプルを最初にタンパク質複合体のサイズで分析し、次に変性させて、複合体内の個々のタンパク質を個々のサイズで分離できるようにしました。 3つの異なるタンパク質に対する抗体は、これらのタンパク質の数が異なる3つのユニークな複合体を示し、各複合体は垂直線で配置されています。左端の列には、β-2とMCP-21、およびこれらのマーカーで示されていない別のタンパク質が含まれています。 中央の列は3つのタンパク質すべてを含む複合体を示し、右側の列はβ-2とMCP-21のみを含んでいました。

イムノブロッティングは、タンパク質間相互作用の可視化にも使用できます。 これは、最初にゲルからニトロセルロースメンブレンにタンパク質を移し、次にそのメンブレンを追加のタンパク質でプローブすることによって行われます。次に、イムノブロッティングを使用して、添加されたタンパク質がメンブレンに固定化されたタンパク質のいずれかと複合体を形成しているかどうかを検出します。

JoVEのイムノブロッティングに関するビデオをご覧になりました。これで、タンパク質をメンブレンに転写し、抗体でメンブレンをプローブし、シグナルを検出する方法を理解できたはずです。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!