ウエスタンブロット法

ウエスタンブロッティングは抗体を使って、電気泳動により分離したサンプル中の特異的タンパク質の存在を特定するための有力な手法です。

質の良い結果を出すために重要となる3つのステージがあります。 エレクトロブロッティング、イムノブロッティング、そして検出です。 これらの前段階として、タンパク質を変性させポリアクリルアミドゲルで分子量により分離するSDS-PAGEを行います。

エレクトロブロッティングは、転写とも呼ばれます。タンパク質をゲルからメンブレンに転写するために、転写装置で挟み込みます。エレクトロブロッティングではゲルとメンブレンを2枚の濾紙の間に挟みます。転写には電場を利用し、タンパク質をゲルから移動させ、荷電と疎水性相互作用によりメンブレンに転写していきます。

イムノブロッティングでは抗体を使って特異的タンパク質を見つけ出します。抗体は大きなY字型のタンパク質で、Fab領域と呼ばれる他のタンパク質に結合できる2つのフラグメントがあります。Fab領域は特異的エピトープであり、抗体が結合できる特定部

位です。

モノクローナル抗体とは、一つのエピトープだけを認識する抗体で、その特異性がイムノブロッティングに利用されます。 反対に、ポリクローナル抗体は抗原上にある多数のエピトープをターゲットとします。抗原とは抗体が結合するタンパク質のことです。 直鎖状エピトープを認識するモノクローナル抗体は、変性し直鎖状になったタンパク質の検出に適しています。多くの抗体は立体構造のエピトープしか認識できません。つまり元々の3D状態のタンパク質だけを認識するのです。

さらに抗体にはFab領域に加え、抗体作製した動物に特異的なFc領域があります。イムノブロッティングではこの領域が二次抗体のエピトープとなります。二次抗体を用いて標的タンパク質に結合した一次抗体を認識させます。

シグナルが観察できるよう、通常、抗体のFc領域にはアルカリホスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなどのレポーター酵素がついています。このレポーター酵素は基質に反応し、発色や発光に重要となります。

これらの結果は定量することができます。バンドの濃さを計測できるソフトウェアを用い、それぞれのバンドの濃淡を測定します。その後標準品又はコントロールを使って定量します。

ウエスタントランスファーを成功させるには、ゲルを転写バッファー中で15分間平衡化する必要があります。転写膜も説明書に従い平衡化します。

次に気泡が入らないように注意しながら転写バッファー中で転写の準備をします。もし気泡が入ってしまったら小さなピペットを使って転がしながら外に押し出します。どんなに小さな泡でも、この転写膜に見られるようにタンパク質の転写を不完全にしてしまう可能性があるので注意しましょう。

挟み込んだら、トランスファーチャンバーにバッファーを追加し、20から30mAの電流を2から3時間流します。転写バッファーはメタノールを含んでおり、タンパク質の膜への結合を高めます。

転写が完了したら装置を解体し、転写の状態をポンソー染色などの非特異的タンパク質染色法を利用して確認します。これによりタンパク質のバンドを素早く可逆的に検出できます。

イムノブロッティングの第一ステップはタンパク質の希釈溶液で転写されていない部分を覆うことです。これはブロッキングと呼ばれ、抗体がメンブレンに非特異的に結合するのを防ぎます。一般に、ブロッキング溶液にはBSA又はノンファットドライミルクを食塩緩衝溶液に溶解させたものを用います。ここでは通常1時間から一晩シェーカーにかけます。

次に、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加えメンブレンをインキュベートします。ここでは30分から一晩優しく撹拌します。

その後、非特異的なシグナルを防ぐためにメンブレンを十分に洗浄します。それから二次抗体を加えたブロッキング溶液でメンブレンを浸します。短時間のインキュベーション後、再び十分に洗浄します。

二次抗体はレポーター酵素により検出可能となります。適切な基質を加えることで、発色や化学発光させることができ、バンドの濃淡の測定ができるようになります。さらに、分子量マーカーと照らし合わせることで、目的のタンパク質の分子量サイズが確認できます。イムノブロッティングにより検出したタンパク質の大きさを確認することで、一次抗体が適正なタンパク質を認識しているか、そのタンパク質がモノマーか複数のコピーを持っているものかを確認することができます。

何千種類もの一次抗体が購入可能であり、それらによってサンプル中の特異的タンパク質の検出と定量が行えます。ここでは、HIF-1α抗体を使って、培養細胞の低酸素状態をスクリーニングしています。さらに、コントロールとしてベータアクチン抗体を使用しています。ご覧の通り、通常の酸素状態では低酸素状態に比べ非常に少量のHIF-1を作り出すことが分かります。

二次元ゲル電気泳動とイムノブロッティングを組み合わせることで、タンパク質の複合体を確認することができます。ここでは、まずサンプルを複合体のサイズにより泳動させ、その後変性させ個々のタンパク質の大きさにより分離しています。3種類の抗体により3つの特徴的な複合体が見られ、それぞれの複合体が違った数の線を作り出しているのが分かります。左のカラムにはbeta-2 と MCP-21が含まれており、それ以外のタンパク質は検出されていません。中央のカラムには3つのタンパク質全てが含まれており、右にはbeta-2 と MCP-21だけが含まれています。

イムノブロッティングによりタンパク質の相互作用も確認できます。ゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を転写させ、その後さらにタンパク質を加えることで標識できます。そしてイムノブロッティングにより、その加えたタンパク質とメンブレンに固定したタンパク質が複合体を形成しているか確認します。

ここまでJoVEイムノブロッティング編をご覧いただきました。タンパク質の転写方法、メンブレンの抗体反応とシグナルの検出法を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。