Name: 脛骨神経切断 - マウスにおける脱神経誘発性骨格筋萎縮のために標準化されたモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-03T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶマウスにおける脛骨神経切断による脱神経誘発性骨格筋萎縮モデルの標準化された手術プロトコル。C57Black6マウスを用いて、筋量減少を再現性高く評価する方法を解説する。

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この作品は、CIHR筋研究パートナーシップ（ - ; JAEBへ90959 JNM）からの補助金によって支えられて。

前にこのモデルを使用することに、研究者は彼らの機関の動物使用統治体からの外科的プロトコルの承認を受けている必要があります。モデルは、研究倫理委員会、ハミルトン·ヘルス·サイエンス社、マクマスター大学（AUP＃10-04-24）によって承認されており、動物のケアカナダ評議会の勧告に厳密に従って実施される。 1。マウス準備<ol><li>マウス重量を量る。 5イソフルラン％または2％ハロタンで麻酔を誘導する。使用される回路は、外科医を保護するために麻酔の掃気適切性を確保する必要があります。 2-3分後、動物の呼吸が遅くなります。まばたき反射が不在であることを確認し、手術麻酔を（マウスでも応答すなわちなし ）を確認するために足ですだれスペースをつまむ。手術中に角膜の乾燥を防ぐために、眼に眼用潤滑剤を適用する。 </li><li>坐骨からラテラル太ももや臀部を剃る膝にノッチ及びproviodineで消毒。剃毛は、手術野の適切な可視化を確実にするために、神経解剖と離断との干渉を最小限にするために切開毛のサイトは自由を維持します。優れたと大腿骨の後方にある坐骨ノッチは、触診によって識別することができます。 </li></ol> 2。手術手技<ol><li> 2％（ハロタン1％）に吸入イソフルランを軽減し、操作や解剖顕微鏡下でその側（上向きに手術のために意図された側）、上にマウスを置きます。 3.5X倍率が成人（20〜25 g）のマウスには十分であるため、別の方法として手術は外科ルーペを用いて行うことができる。 </li><li>滅菌手袋を着用。触診で坐骨ノッチを識別します。メスを使用して、坐骨ノッチから膝への横方向の大腿（約1cm）の皮膚を切開。 </li><li>優しく肌を広げた。大腿二頭筋を特定し、これは、横方向の大腿部の平らな表面的な筋肉です。すぐに皮膚の下。細かいハサミを使用して、筋線維に沿って大腿二頭筋を分割し、坐骨神経とその枝を公開するために、スプリングリトラクタと開いたまま。 </li><li>大腿二頭筋に直ちに深い坐骨神経を識別します。それは、その特徴的な光沢のある白い色で識別され、直径が約0.8mmですることができる。これは、膝窩のレベルで、脛骨腓骨と腓腹神経に分岐、坐骨ノッチから膝まで実行されます。 </li><li>優しく超微細鉗子と春microdissectingハサミで腓骨と腓腹神経の枝から脛骨を分離。脛骨神経は、最大の枝であり、通常の中心です。それは枝を分離しながら神経をつぶすしないことが重要です。超微細鉗子でただ外側adventicial層の上に神経を保持し、かつ神経たるみを（教えていない）維持、神経挫滅とトラクションの傷害を避けることができます。 </li><li>完全かつ持続的denervati用上で、慎重に膝血管を避け、遠できるだけはさみmicrodissectingと脛骨神経を切った。また、2〜4週間の予想を完全再支配との一時的な除神経のために、脛骨神経は単純に15秒の代わりに離断のための超微細鉗子で粉砕することができます。 （末梢神経損傷後の再成長と対象筋肉をreinnervateます。） </li><li>完全な除神経が必要な場合は、腓腹筋の異常な再神経支配を防止するために10-0ナイロンおよび再近似5-0 VICRYLと大腿二頭筋と大腿二頭筋の前面に切開脛骨神経の端部を縫合しヒラメ筋。 </li><li>実行中の5-0 VICRYL縫合糸で皮膚を閉じます。 </li></ol> 3。手術ケアを投稿<ol><li>吸入麻酔薬をオフにしますが、酸素の流れを維持します。皮下buprinorphine（または代替）鎮痛剤を投与する。 </li><li>ないクリーンなケージにマウスを移しません寝具麻酔から目覚めた。 ambulatingまでケージ内および直接観察下温暖毛布の上においてください。 </li><li>十分柔らかい寝具柔らかい底のケージ内の転送と家（ではない線）。 </li><li>手術の傷や褥瘡ヒール潰瘍や噛むの証拠の開発のための足の状態を毎日手術肢を点検。軽微なトラブルは、proviodineなどの局所抗生物質や防腐剤を使用して管理することができます。動物の安楽死を必要とするエンドポイントインジケータは減量、貧しい自己ケアのエビデンス（フリルファー）、および猫背姿勢です。また、主要な傷の中断または局所抗生物質で1〜2週間で治癒や痛みを持っているようには見えない潰瘍と動物を犠牲にすべきである。 </li></ol> 4。除神経腓腹筋とヒラメ筋の収穫<ol><li>希望術後時点で、CO 2過剰摂取でマウスと犠牲を量る。 </li><li>両方の内側側面を剃る手術および対コントロールの足とアルコールできれい。操作や解剖顕微鏡下にマウスを置き、あるいは拡大するため手術視野ルーペを使用しています。 </li><li>手術肢で、足首周り足首から膝にメスと円周方向と内側カーフスキンを切開。優しく筋肉オフと近位大腿部に向かって鉗子で皮膚を引っ張る。これは、脚のすべての筋肉を公開します。脚の後部側面に膝から足首まで実行され、皮膚の下にすぐにあるふくらはぎの筋肉である腓腹筋を識別。膝の内側側面に腓腹筋の近位、大腿二頭筋の遠位挿入を識別します。その遠位挿入で大腿二頭筋は薄く、フィルム状に表示され、腓腹筋の最も近位部分に重なる。はさみや平滑末端郭清を使用した、優しくガスから大腿二頭筋の遠位挿入を分離trocnemius筋肉。 </li><li>踵には、その遠位挿入では、腓腹筋はアキレス腱に先細り。白と筋骨たくましい現れアキレス腱を識別。ホールドまたは腓腹筋を鎮圧しないように注意しながら、ピンセットでアキレス腱を保持し、ハサミを使って踵挿入からアキレス腱を分割。 </li><li>まだ腱を保持、そっと膝を原点に向かって遠位挿入（ヒラメは別途収穫することができる）から、深いヒラメ（深い赤）から腓腹筋（淡赤色）を持ち上げます。 </li><li>はさみを使って内側と外側大腿chondylesから腓腹筋の起源を割って脚オフ腓腹筋を解剖。筋肉に非常に穏やかなトラクションは、このプロセスを容易にします。筋肉を粉砕しないように注意してください。 </li><li>ヒラメは今直ちに腓腹筋のサイトの下に、はっきりと見えるようになります。そのにアキレス腱への挿入からヒラメを持ち上げたり後部ふくらはぎにイギン。ヒラメが誤っ腓腹筋で発生した場合、優しく収穫標本から分離。腓腹筋（光赤）とヒラメ（暗赤色）は、それらの色の違いによる収穫標本で容易に識別残る。 </li><li>精密スケールで別々に筋肉を量る。 </li><li>液体窒素で冷却したイソペンタン中で10％ホルマリン、または凍結固定で組織学のために液体窒素中でスナップ凍結用の半分（抽出、その後のタンパク質および/ ​​またはRNAの場合）、ハーフ（ すなわち形態計測評価、免疫組織学）のいずれか固定、垂直方向に筋肉を分割、必要に応じて。 </li><li>制御腓腹筋とヒラメ筋を収穫するコントロールで上記のステップ4.3、未作動、側から繰り返します。 </li></ol>

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</ol>

利害の衝突は宣言されていません。

除神経誘発性骨格筋萎縮の脛骨神経切断モデルは、ラットで一般的に採用し、十分に検証されたモデルです。私たちは、捜査官は、遺伝子改変マウスの存在を活用し、筋肉量7,8の規制に重要なタンパク質が存在しない場合に、生体内での筋萎縮の過程を研究することができ、マウスで使用するため、このモデルを適応している。腓腹筋とヒラメ筋、このモデルでは除神経の両方が、このように、その後の分子解析のための優れた品質のmRNAと蛋白質を提供し、容易かつ迅速に最小限の処理に解剖することができます。同様に、原因の筋肉の大きさ、それらは付随組織と形態学的分析のための同じ動物から組織を提供し、分割することができます。場合後肢機能評価は、トラック分析逐次実行することができますを歩いて、必要とされる。足は、インク中に浸漬され、マウスが上に紙で囲いを歩いているボトム。版画の特性を確実に測定し、フットプリント特性が機能筋肉群の13,14を反映するので、神経筋障害、歩行の妥協の範囲を示すために得点することができます。もともとラット13で開発され、検証されているが、歩行追跡分析もマウス15<...

外傷性末梢神経損傷、疾患や薬理学的介入のために骨格筋の除神経、筋肉の自発的収縮機能の即時損失結果。筋肉が付随して萎縮し始め、タイムリーな、上質な再支配が1,2が発生した場合、この萎縮が可逆的である。再支配が存在しない場合には、筋線維の萎縮が進行し、筋肉における不可逆生物学的変化は、筋線維と筋線維の死で発生。ここでは、マウスの脛骨神経切断モデル、除神経誘発性骨格筋萎縮や線維症のモデルを示しています。このモデルは、腓腹筋とヒラメ筋のin vivoでの筋萎縮の根底にある生理学的、細胞および分子の生物学的メカニズムを研究する科学者が可能になります。歴史的にノックアウト、特にトランスジェニックマウスラインにこのモデルのラット、より最近のアプリケーションで主に使用されているが、研究者が自分の役割を評価することができますin vivoでの誘導、開発と保守、または代わりの解像度、筋萎縮と線維症への関心の特定のタンパク質（秒）。 脛骨神経は、げっ歯類の後肢における混合モータ感覚末梢神経であり、坐骨神経の三端子の枝の一つです。脛骨神経の横断は、腓腹筋、ヒラメ筋と足底の筋肉を（および後脛骨筋、指屈筋長母と屈筋hallicus長母を含め、足の3小深い屈筋）denervates、及びラット3,4でよく標準化され、検証モデルである。腓腹筋とヒラメ筋を容易にシリアル時点で切開することができる脛骨神経切断、固定され、処理された筋肉組織学および筋肉繊維形態計測の評価のために、又はフラッシュは、例えば研究するための筋RNAおよびタンパク質の抽出のために凍結し、ポスト筋萎縮を調節する細胞内シグナル伝達ネットワーク。 GAstrocnemius筋は混合繊維の種類の筋肉（I型とII型、主にII型が）で、ヒラメ筋、それによって評価5,6のために高速と低速の両方筋筋を提供する、タイプI線維の大部分で構成されています。脛骨神経切断モデルは、短期（日）7と長期（週か月まで）4,8両方で除神経誘発性筋萎縮の過程を研究するのに適しています。 坐骨神経切断モデル（一般的なげっ歯類に使用される除神経誘発性筋萎縮の第二モデル）とは対照的に、脛骨神経切断は、より魅力的なモデル作り、動物の少ない合併症を誘発する。脛骨神経の横断は、坐骨神経の腓骨と腓腹神経の枝はそのまま残り、一方坐骨神経の横断は、このように保存し、2を歩き回るために動物の能力を損なう、脚（ひざ下）と足のすべての筋肉をdenervates彼らのターゲットの筋肉と感覚領土。マウスは足底フレックスにできないか、足を反転しますが、簡単に歩き回るすることができ、重量が著しくモデルの罹患率を減少させる、両方の後肢に均等に負担する。歩行パターンを評価する歩行分析研究は、脛骨と坐骨神経傷害後のラットで行われ、そのフットプリントを示し、体重負荷の方が脛骨傷害9,10で保存されています。研究デザイン3を必要とする場合、また、脛骨神経切断モデルにおいて、腓骨神経は、後述時点で動員することができ、遅延された神経再生の供給源として転送される。これとは対照的に、坐骨神経離断モデルにおける遅延再支配は非常に大幅にモデルの技術的な難しさを増加させ、熟練した外科医にその使用を制限し、坐骨神経の赤字に神経移植の使用を必要とする。 しばらく脛骨神経切断モデルRそれが神経支配脛骨神経とふくらはぎの筋肉の両方の動物の手術における無菌手術技術と演算子の親しみを、equires外科医ではない、または高度に動物の手術の経験が個人は、容易にこのモデルをマスターできるように、操作のために容易にアクセスし、識別可能。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬と材料</td></tr><tr><td>10-0 ナイロン縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>2850G</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl 縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>J553G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>Spring microdissectionting はさみ</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>15021-15</td><td></td></tr><tr><td>超微細鉗子</td><td>Fine Surgicalツール</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>ノンロックマイクロニードルホルダー(ドライバー)</td><td>ファインサージカルツール</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>スプリングリトラクター</td><td>ファインサージカルツール</td><td>17000-02</td><td></td></tr></tbody></table>

脛骨神経切断 - マウスにおける脱神経誘発性骨格筋萎縮のために標準化されたモデル

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

脛骨神経切断モデルは、げっ歯類における除神経誘発性骨格筋萎縮の、良好な忍容性を検証し、再現可能なモデルです。独自に開発し、その大きなサイズに起因したラットで広く使用されていますが、マウスで脛骨神経は、無傷の坐骨神経の腓骨と腓腹神経の枝を残して、それによって維持し、それは簡単にクラッシュまたは離断のいずれかで操作することができる十分な大きさその標的筋肉。したがって、このモデルでは、坐骨神経切断モデル未満の罹患率と歩行の障害を誘発することの利点を提供し、また、研究者が遺伝子組み換えマウスでは筋萎縮の過程を規制する、生理的細胞および分子の生物学的メカニズムを研究することができます。脛骨神経は、腓腹筋、ヒラメ筋と足底の筋肉を供給しているので、その離断は、速筋のII型繊維および/または遅筋型から成る除神経骨格筋の研究を可能にし、私繊維。ここでは、C57Black6マウスにおける脛骨神経切断モデルを示しています。我々は、パラフィン包埋組織切片で筋量及びファイバ型特定の断面積を測定することによって、1,2において、代表的な筋肉のように、腓腹筋の萎縮を評価し、4週後の除神経は、速筋ミオシンための免疫染色。

<html>脛骨神経切断は、ふくらはぎの腓腹筋、ヒラメ筋と足底の筋肉をdenervates。ここでは、代表的な筋肉として、腓腹筋における萎縮の開発を評価する。腓腹筋は1,2、または4週間除神経2-3ヶ月齢C57Black 6マウス（ジャクソン研究所）から採取した。タイプII速筋の筋線維（ 図2）の断面積が行うように、筋肉の量は徐々に時間をかけて、（ 図1）減少する。腓腹筋は、混合繊維の種類の筋肉（IとタイプIIを入力）ですが、除神経は、私はII繊維11を入力するように型から繊維型スイッチを誘導、およびタイプの結果として、十分な数のI繊維は測定に使用できない場合がありますと堅牢な統計分析。 50657fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。除神経腓腹筋は、プログレッシブ萎縮を示しています。C57Black 6マウスは右脛骨神経の離断を受けた。腓腹筋が除神経（右）と対...

脛骨神経切断モデルは、骨格筋萎縮の、良好な忍容性を検証し、再現可能なモデルです。モデル外科用プロトコルはC57Black6マウスにおいて説明され、示されている。

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

このビデオの目的は、マウスにおける骨格筋萎縮の脛骨神経切断モデルを実演することです。これは、坐骨神経とその3つの分枝である脛骨神経、総腓骨神経、および深・浅腓骨神経を単離することによって達成されます。単離後、脛骨神経を切断します。脱神経後、創部を封鎖し、動物の状態を綿密に観察します。最終的に、脱神経後の筋量が漸次的に減少しているサンプルを回収します。骨格筋萎縮を誘発する脱神経モデルとして、脛骨神経切断モデルはラットで広く用いられ、十分に検証されています。また、このモデルは坐骨神経切断に伴うものよりも罹患率が大幅に低いという利点があります。我々は本モデルをマウスで利用できるよう適応させ、ここでその方法を実演します。これにより、研究者は遺伝子組み換えマウスを利用することができ、動物への病原性を最小限に抑えつつ、骨格筋量の調節に不可欠なタンパク質を欠損させた状態での筋萎縮プロセスを研究することが可能になります。まず、足指へのピンチ刺激により十分な麻酔状態であることを確認した後、マウスの体重を測定します。次いで、触診によって坐骨切痕を特定し、そこから膝まで、大腿部外側と臀部を除毛します。次に、アルコールとポビドンヨードを繰り返し塗布して患部を洗浄します。滅菌手袋を着用し、手術顕微鏡または解剖顕微鏡の下でマウスを側臥位に固定します。触診により坐骨切痕を確認します。坐骨切痕から膝にかけて、大腿外側の皮膚を切開します。皮膚をゆっくりと広げます。微小剪刀を用いて、皮膚の直下にある大腿外側の平坦な浅層筋である大腿二頭筋を確認します。大腿二頭筋を筋線維に沿って分割し、スプリングリトラクターを挿入します。坐骨神経とその分枝を露出させるため、大腿二頭筋の直下にある坐骨神経を特定します。坐骨神経は、特徴的な光沢のある白色で識別でき、直径は約0.8 mmです。坐骨神経は坐骨切痕から膝まで走行し、膝窩のレベルで脛骨神経、総腓骨神経、および腓腹神経に分かれます。超極細ピンセットとバネ式マイクロ解剖用鋏を用いて、脛骨神経を腓骨神経および腓腹神経の分枝から慎重に分離します。脛骨神経は最大の分枝であり、通常は中央に位置しています。この手順を成功させるには、坐骨神経とその分枝を慎重に扱うことが不可欠です。仙骨神経および会陰神経の分枝が損傷したり伸展したりしないよう注意してください。これらの分枝が損傷または伸展すると、その標的器官まで脱神経されることになります。超微細ピンセットで神経の外膜層のみを保持し、神経を弛緩させた状態で操作することで、一時的な除神経における神経圧迫や牽引損傷を避けることができます。2～4週間で完全な再生が見込まれるため、完全かつ持続的な除神経を行う場合は、超微細ピンセットで脛骨神経を15秒間圧迫します。その後、マイクロ解剖用剪刀を用いて、脛骨神経を可能な限り遠位で切断します。完全な除神経が必要な場合は、膝窩血管を慎重に避けて操作してください。切断した脛骨神経の末端を10 Tナイロンを用いて大腿二頭筋の前面に縫合し、腓腹筋およびヒラメ筋の異常再支配を防ぐため、5 T Vicrylで大腿二頭筋を再近似させます。除神経が完了したら、ランニング5-0 Vicryl縫合で皮膚を閉鎖します。準備が整い次第、吸入麻酔を停止しますが、酸素の供給は維持してください。鎮痛剤を単回投与した後、マウスを敷材のない清潔で暖かいケージに収容します。歩行が回復するまで、マウスを直接観察し続けてください。完全に回復したら、十分な柔らかい敷材を入れた清潔な底面が平らなケージにマウスを移します。手術した肢と足に、踵の褥瘡の発生や噛み跡がないか毎日確認してください。軽微な問題は、ポビドンヨードなどの外用抗生物質や消毒剤で管理できます。動物の安楽死を必要とするエンドポイント指標は、体重減少、セルフケア能力の低下の兆候、および背中の丸まり（hunching）です。さらに、創傷の裂開や潰瘍があり、1〜2週間の創傷処置を行っても治癒しない動物も安楽死させる必要があります。さらに、不当な苦痛がある動物については適切に処置します。術後の時点で、解析に必要な組織を採取します。安楽死させた後、手術側および対照側の両脚の内側を剃毛し、アルコールで清浄にします。解剖顕微鏡下で、手術側の肢の足首から膝にかけて、および足首を周方向にメスで切開し、内側のふくらはぎの皮膚を切開します。次に、筋肉から皮膚を剥離させ、大腿部に向かって近位にゆっくりと引き寄せます。脚のすべての筋肉を露出させるために、膝から足首まで脚の後面に沿って走行する下腿三頭筋（ふくらはぎの筋肉）を確認します。次に、下腿三頭筋より近位にある膝の内側で、大腿二頭筋の遠位停止部を探します。大腿二頭筋の遠位停止部は薄い膜状に見え、下腿三頭筋の最も近位部分を覆っています。ここをハサミと鈍的な剥離法を用いて dissection します。大腿二頭筋の遠位停止部を腓腹筋から慎重に剥離します。腓腹筋は踵骨への遠位停止部に向かって細くなり、アキレス腱へと移行します。白く腱のような外見のアキレス腱を確認してください。ピンセットでアキレス腱を保持します。腓腹筋を掴んだり潰したりしないよう注意しながら、アキレス腱を踵骨付着部から切断します。腱を保持したまま、はさみを用いて、淡赤色の腓腹筋を深層にある濃赤色のヒラメ筋から、遠位の付着部から膝の起始部に向かって、非常に緩やかな牽引をかけながら慎重に剥離します。操作を容易にするため、ハサミを用いて、腓腹筋の起始部を大腿骨の内側および外側顆から切り離し、脚から腓腹筋を剥離します。この際、筋肉を圧迫しないよう注意してください。腓腹筋の直下に、ヒラメ筋がはっきりと見えます。アキレス腱の停止部から下腿後面の起始部にかけて、ヒラメ筋を剥離させます。取り出した後、各筋肉を精密天秤で個別に計量します。次に、筋肉を垂直に2等分し、半分を液体窒素で急冷凍結用、もう半分を組織学的解析用に分けます。最後に、これらの手順を対照群の非処置側で繰り返し、対照群の腓腹筋およびヒラメ筋を採取します。除神経側および対側対照群の後肢から、1週、2週、または4週後に腓腹筋を採取し、比率として算出しました。除神経により、時間の経過とともに筋量の漸進的な減少が誘導されました。ここに示すように、免疫染色後に筋線維の断面積を測定しました。速筋のタイプ2線維は茶色に染色され、遅筋のタイプ1線維は白く染色されます。脱神経した筋肉において、収縮線維の断面積が漸次的に減少することが示されました。4週間にわたり。このビデオを視聴後、マウスにおける脛骨神経切断術を遂行できるようになります。これにより、脱神経による骨格筋萎縮の再現性が高く、堅牢で十分に検証されたモデルを得ることができます。

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Research

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Medicine

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