ナチュラル無細胞腸基質の産生のための脱細胞化の方法論

この手順の全体的な目標は、腸組織工学のための天然の無細胞足場を作成することです。これは、最初にカニューレを挿入し、ラット上腸間膜動脈またはSMAを採取し、血管アクセスとともに小腸を採取することによって達成されます。2番目のステップでは、管腔内破片が洗い流され、管腔内カニューレと血管カニューレが蠕動ポンプに接続されます。

次に、小腸に脱イオン水を加えて摂氏4度で24時間灌流します。最終ステップでは、小腸にデオキシナトリウム、コート、およびDNAを室温で灌流します。最終的に、小腸の完全な脱細胞化、およびその構造と構成要素は、それぞれ組織学と電子顕微鏡によって視覚化できます。

私たちは現在、腸不全という臨床問題に直面しており、子供と大人の両方に影響を与える壊滅的な状態です。親の栄養と従来の移植は完全な治療法を提供しません。次のビデオで示されているように、3次元血管新生腸足場の産生は、腸不全の治療にまで及びます。

この技術で注目すべきは、電子顕微鏡の結果から明らかなように、穏やかなデジタル化化学物質の使用により、腸のマイクロアーキテクチャが維持されることです。さらに、文明に従った階層的な血管ネットワークの維持により、宿主に再接続できる構造の播種が可能になります。血液供給 蠕動ポンプに 2 本のチューブを装着することから始め、次に蠕動ポンプのチューブに 70% エタノールを最大速度で 15 分間流し、続いて新たに調製した PBS AA をさらに 15 分間実行します。

ポンプを洗い流した後、70%エタノールで安楽死させた250〜350グラムのスプラドーリーラットの腹部をスプレーして拭きます。次に、オートクレーブ滅菌手術器具を使用して、腹部にXO恥骨開腹切開術を行い、明確な手術野を確保し、70%エタノールを噴霧したペーパータオルの上に動物の右側に小腸を内臓します。組織の脱水や細胞外マトリックスの変性を避けるために、P-B-S-A-Aで腸を継続的に濡らすように注意してください。

次に、大動脈から腸に向かって90度の角度で発生するSMAを特定します。SMAの周りに縫合糸を留置し、結び目を準備します。27ゲージのカニューレを使用して大動脈からSMAに入り、血管の壁を引き裂かないように針をすばやく引き抜きます。

次に、カニューレのプラスチックチューブをSMAに進め、Vicryl five oh縫合糸でチューブを固定し、10ミリリットルのP-B-S-A-Aを注入してカニューレ挿入を確認します。次に、ハサミを使用してSMAの近位および遠位の大動脈を切開し、カニューレを解放して大腸を解剖するときの糞便の漏れを防ぎ、回盲接合部の近位端に1つのシルクファイブOH縫合糸の結び目を配置し、S状結腸の遠位端に1つを配置します。次に、2つの結び目の間の回腸末端と結腸を切断し、大腸を取り除きます。

次に、Juno十二指腸接合部で小腸を切断し、腹部との結合組織接続から腸を解放します。PBS aaを含むシャーレに小腸を移します。次に、プラスチック製の後部ピペットを使用して腸の近位部分をカニューレに挿入し、縫合糸で所定の位置に固定します。

最後に、60ミリリットルの注射器のルアーロックに合うようにピペットをカットし、次に60ミリリットルのPBSAAの2回の洗浄で腸内腔を洗い流して、糞便や破片を取り除きます脱細胞化プロセスを開始する前に、腸内腔と血管カニューレ内に気泡が存在しないことを確認してください。次に、3ウェイストップコックを血管カニューレに接続し、ペトリ皿を容器に入れて、あふれた溶液を収集します。次に、マスターフレックスLS可変速ローラーポンプに脱イオン水を毎時0.6ミリリットルで流し始めます。

ティッシュを慎重に取り扱って、気泡が遠位端から出るようにします。カニューレからすべての気泡が取り除かれたら、装置を冷蔵室に移します。次に、最初の1時間に腸管腔と血管樹の両方に脱イオン水を24時間流して脱イオン化プロセスを1時間あたり0.6ミリリットルで流すことにより、脱細胞化プロセスを開始します。

装置を定期的にチェックして、すべての接続がしっかりと固定されていることを確認してください。漏れは最小限で、腸内に気泡は存在しません。24時間後、脱細胞化装置を室温に戻します。

腸の色は吸引フードの下で淡いピンクに変わっているはずです。脱イオン水300ミリリットルで4%溶液を作るのに十分なデオキシナトリウムコートの重量を量ります。渦を使用して、溶液が透明になるまで混合します。

次に、脱イオン溶液をデオキシナトリウムコレートに置き換えます。接続を確認します。気泡を取り除き、小腸を1時間あたり0.6ミリリットルで4時間灌流します。

デオキシナトリウム照合ステップの後、組織は透明になります。血管網の維持は、PBS AAをポンプに追加した後にも明らかになります。デオキシナトリウム、コーティング、DNAとの間の相互作用を避けるために、PBS AAで腸を30回洗浄します。

次に、新たに調製したDNAを、室温で1時間あたり0.6ミリリットルの速度で組織に灌流します。3時間後、足場を組織培養フードに移し、浄化槽技術を使用してプレートを交換します。蠕動ポンプのチューブを再滅菌します エタノールを通します。

最後にもう一度、P-B-S-A-Aで腸を30分間洗浄し、脱細胞化溶液の残留物がすべて除去されていることを確認します。最後に、足場をUV架橋剤に移し、2回の滅菌サイクルを実行します。次に、足場をP-B-S-A-Aに保管します。

ソリューションを 3 日ごとに交換します。脱細胞化が成功すると、足場は天然の腸と同様の巨視的な外観を持つはずですが、半透明の壁があります。マクロアーキテクチャの保存は、維管束樹の開存性によっても明らかになるはずです。

染料がSMAカニューレを通して注入されると、染料は足場全体に均等に分布し、毛細血管の木に到達します。足場には核物質や細胞質物質が含まれていなければならず、これは評価可能なものです。DNA定量キットと簡単な組織学的解析を使用して、ヘマチンおよびエオイン染色は、この画像で示されているように、小腸の層を維持しながら核物質および細胞質物質が存在しないことを示すはずです。

特に、管腔側の絨毛とクリップスの維持は、走査型電子顕微鏡法の後に明らかになるはずです。また、コラーゲン、エラスチン、グリコアミン糖鎖などの細胞外マトリックス成分のさらなる保存も期待できます。例えば、Massen Tri CHRO 染色では、足場内の無傷の結合組織を実証することができます。

このビデオを見た後、自然な細胞腸の足場を作成する方法をよく理解しているはずです。