Name: 抗体染色中 C.虫「フリーズクラッキング」使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶC. elegansのフリーズクラッキング法による抗体染色技術。化学処理を最小限に抑えたタンパク質局在解析法で、蛍光顕微鏡による半 intact 線虫の効果的な染色を実現します。

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資金は、NSF CCLI番号0633618とオハイオ大学によって提供されました。いくつかの株は、線虫の遺伝学センターから提供された。大学院生Reetobrata Basuさんは、ビデオに表示されます。

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
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</ol>

著者は、彼女が競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

凍結割れプロトコルは、Cの抗体染色のためのいくつかの方法の一つである虫。これは、ワームを染色するための比較的簡単な方法を提供していますが、最適な結果を得るための具体的な試薬と実践を必要としません。 （ 図1に概要）の重要なステップは、1）ステップ1と線虫の2）マニュアルの圧縮（ステップ2および3を参照のこと）迅速な固定をする（ステップ3）を参照してください（準備をスライドさせます。まず、スライドに線虫の付着を最大化するためには、高分子量（長いポリマー）ポリリジンのではなく、商業的に準備されたスライドに頼るとスライドを用意することをお勧めします。凍結割れスライド全体の線虫の角皮に付着するように設計されている間コマーシャルスライドを、細胞が付着できるようにするために、ポリリジンでコーティングされている。第二に、凍結前スライド間のワームを正しく圧縮するための手順は非常に重要です。それは、正しい量を使用して一緒にスライドを押すように着実に手と練習が必要個々のワームはその形態を破壊することなく、両方のスライドを接触するように圧力。多すぎても少なすぎても、圧縮のいずれかが定着時の...

タンパク質の細胞と細胞内局在を決定するために、科学者たちは、伝統的には特定のタンパク質1を認識するように選択された抗体を有する組織のラベルが付いています。 Cなどのいくつかのモデル生物でのエレガンス 、抗体染色は、多くの場合、より迅速に結果が得られた分子遺伝学的技術、により置換されている。これらは、プロモーターと関心と緑色蛍光タンパク質の遺伝子のコード領域の間の遺伝子の融合からなる構築物で形質転換する生物を含む。しかし、分子技術は、真のプロモーターと高コピー数（C. elegansの通常の技術） の2,3での構築物の発現の変化を知ることで問題を含むアーティファクトの数、対象となります。したがって、抗体を用いた染色は、生体内でのタンパク質の機能を研究する多くの科学者のための目標である。 抗体を用いて組織を染色することは、困難な場合がありますので、tibodiesは、特定の立体構造1にそれらの抗原を認識することができる。例えば、抗体は、特定の方法で修正されただけの変性または完全な抗原を認識することができるし、 その場で抗原を認識しない場合があります。線虫における抗体染色の問題は、線虫のクチクラは、組織への抗体のアクセスをブロックし、比較的不透過性のバリアを形成するという事実によって悪化する。 Cの抗体染色のために使用される、いくつかの異なる方法があります。 （私たちの以前の研究4に概説されている） 虫 。無傷で染色する「ワームを、「法は凍結し、比較的硬い固定液（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）で解凍するために開発された、凍結融解サイクルは、固定液5の急速な浸透を可能にするためにキューティクルをクラックするのに役立ちます。固定後、キューティクルは、抗体の浸透を可能にするために透過処理した;方法は、薬剤、コラゲナーゼ、またはその両方を低減5-7で処理することを含んでいた。これらのTreatmentsは、形態を保ったが、多くの場合、抗体認識を減少または破壊された。代替方法は、抗体の浸透を可能にするために解剖8が含まれています。 「凍結割れを「抗体染色9月10日を可能にするために半無傷のワームの内部へのアクセスを得るための一つの方法です。コラゲナーゼおよび還元処置を避けながら、凍結割れが固定の様々な条件で行うことができる。線虫は、2接着剤スライドの間に配置された凍結した後、スライドを分離し、下部のスライド上の線虫のほとんどは、トップスライド上のキューティクルの多くを残している。下部スライドは固定剤に配置することができ、付着した線虫を有するスライド全体を、抗体染色手順を介して転送される。この方法は、2つの主要な困難を提示しません。まず、真剣にそれらを変形させることなく、線虫を分割するのに必要な圧力の正確な量を適用することは困難である。第二に、ワームの多くはSではないでしょういずれかのスライドにチェックを入れて、固定液やリンスに失われます。しかし、適切なスライドと実践では、この方法は急速に固定剤および抗体は、多種多様で使用することができる合理的な形態を有する線虫を生じる。 この方法は、実験の目的に応じてわずかに変化させることができる。単一線虫の染色（ 例えば 、単一の形質転換体は、抗体染色を変化させたか否かを決定するために）所望される場合、最大の密着性と摺動する（しかし、より高いバックグラウンド染色）は、（下記参照）、このような余分なポリリジンを有する実験室で調製されたスライドを使用することができる。線虫がこれら注視後にポリリジンにもっと悪い付着するので、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド固定のため、高い密着性スライド（実験室用意ポリリジンスライド）が、使用されるべきである。野生型線虫は、メタノールおよび/またはアセトンで固定されている場合は、下側の接着性と摺動し、低いバックグラウンド染色を用いるべきである（市販またはlaboratoryに準備スライド）。抗体および固定剤の種々の研究室で使用されている場合、必要​​になるまで、スライドの選択は、前もって調製し、保存することができる。 線虫の組織へのアクセスが獲得された後、抗体染色手順は、（より長いインキュベーション組織の特性よりもむしろ細胞1,11で）標準的な方法に従う。

<table><tbody><tr><td>poly-L-リジンスライド(ESCOブランド)</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-545-78</td><td>シグマブランドのスライドも適しています</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン臭化水素酸</td><td>シグマ</td><td>P1524</td><td>重要:ポリリジンのブランドと高分子量ポリリジンクリティカル</td></tr><tr><td>シングルつや消しエッジスライドフィ</td><td></td><td>ッシャー48312-002</td><td>他のブランドはア</td></tr><tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>に適していますS2002-25G</td><td>TOXICは、手袋とマスクを着用して粉末を計量し、10%の在庫を作ります。他の</td></tr>ブランドは適している <tr><td>5スライドメーラー</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>71549-01</td> パラホルムアルデヒドVW MK262159 <td>Rの染色に適した小型スライドホルダーの多くの異なるブランドの1つであり、</td></tr> ストック溶液<tr><td>coplin染色</td><td>ジャーVWR</td><td>47751-792</td> 他の<td>ブランドは適切</td></tr>です<tr><td></td><td></td><td></td><td>重要:通常のホルマリン溶液(37%ホルムアルデヒド)は適していません。1)クリサトラリンパラホルムアルデヒドをリン酸緩衝液に溶解し、冷凍した小さなアリコートに保存します。または、2)電子顕微鏡グレードのパラホルムアルデヒドをアリコートで購入します。有毒-手袋を着用してください。余分なダウンシンクは水で処分します。</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液、水中25%</td><td>シグマ</td><td>G 5882</td><td>重要:アンプルに電子顕微鏡グレードのグルタルアルデヒドを購入します。有毒-手袋を着用してください。余分なダウンシンクは水で処分します。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>他のブランドが適切です</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>フィッシャー</td><td>ICN820451</td><td>他のブランドはロ</td></tr><tr><td>バ血清、凍結乾燥ジャ</td><td>クソン免疫研究</td><td>017-000-121</td><td>他のブランドはCy3</td></tr>ロ<tr><td>バ抗マウスIgGマルチラベリング</td><td>に適しています ジャクソン免疫研究</td><td>715-165-150</td><td>この会社は、高品質のマルチラベル(アフィニティー枯渇)抗体に推奨されます。適切な色素と抗原(一次抗体の産生に用いる動物)を選択します。</td></tr><tr><td>n-プロピルガレート</td><td>フィッシャー</td><td>ICN10274750</td><td>他のブランドは、</td></tr><tr><td>DAPI、4'、6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>D 9542</td><td>有毒に適しています。手袋を着用し、小さなアリコートに分配し、露出を最小限に抑えるためにフィーズ</td></tr>します <tr><td>Whatman #1 15 cm直径フィルター</td><td>フィッシャー09805G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ #1 1/2 長方形 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 厚さは光学的に最高です</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフォルダー</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>他のブランドが適しています</td></tr></tbody></table>

抗体染色中<em&gt; c.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

C.を染色する抗体を用いた虫は 、比較的不透過性のキューティクルは、化学的または機械的な方法でバイパスする必要があります。 「凍結割れを「物理的に二つのスライド間の接着性の線虫を圧縮し、それらを凍結し、そして離れてスライドを引っ張ることにより線虫のクチクラをプルするために使用される一つの方法である。凍結割れは、化学処理をせずに、組織へのアクセスを獲得するための簡単​​かつ迅速な方法を提供し、様々な固定剤と共に使用することができる。しかしながら、標本の多くの損失をもたらし、必要な圧縮は、機械的にサンプルを歪める。実際には、良好な形態を有するサンプルの回収を最大化するために必要とされる。凍結割れは、特定の固定条件、​​サンプルの回収、または低非特異的染色のために最適ではなく、すべてのパラメータの一度にすることができます。非常に難しいの固定条件を必要とし、化学的にキューティクルを透過性にするために必要な化学処理を容認する抗体について、treatmen溶液中のインタクトな線虫のtが好ましい場合がある。抗体が必要な場合は軽量化の修正や最適な固定条件が不明である場合には、凍結割れが急速に抗体をアッセイすると、目的の抗原に特異的な細胞内および細胞内局在情報を得ることができる非常に便利な方法を提供します。

ワームが適切に圧縮ひび割れ、軽く固定した場合、事実上、全体のワームは、抗体染色がアクセスすることができます（ 図2を参照）。 DAPI染色によって示されるように、核の位置は、ワームの部分がワームをホルムアルデヒドなどの硬い固定液に供された場合の不自然波状の出現によって示されるように、ワームの形態は（歪む無傷であるかを示す図3A〜Dの筋肉）。別の一般的な問題は、特定の組織の不均一な固定又は浸透である。この例は、筋肉がDNA染色を含む他の染色の存在は、（本体の少なくとも一部が存在したことを示しているという事実にもかかわらず、唯一のウォームの一部に染色され、図3E-Hに示されているすなわち 、凍結割れ）の間に除去されない。全体の配電のように、部分的な染色の結果として生じるパターンは、容易に、実際に同定することができる染色上の任意の単一のワームが不均一な染色を示している場合であっても決定することができる。 凍結割れ任意定着条件を用いて遭遇する共通の問題は、最終的な図（ <...

「凍結割れ、「線虫C.の内部組織を露出させるための方法をタンパク質の局在化のための抗体に虫が 、実証されている。

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

この手順の全体的な目的は、C. elegansの抗体染色を行うことです。そのために、線虫を洗浄してスライドグラス上に広げ、2枚の接着スライドの間で慎重に圧縮し、その後ドライアイスで凍結させます。次に、スライドを分離して線虫の体を破裂させ、直ちに固定液に浸します。その後、標準的な抗体染色法を用いて線虫を染色し、蛍光顕微鏡で解析することで、半完結状態の線虫への抗体染色の成功が確認されます。完結した線虫の固定などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、試料への化学的処理を最小限に抑えられる点にあります。一般的に、スライドと線虫の調製にはある程度の習熟を要するため、この手法を初めて行う場合は困難が予想されます。本手順は、私と私の研究室の大学院生であるRTO Basuで実施します。染色のための線虫プレートを準備するには、まず金属の平板をドライアイスの上に置いて冷却し、蒸留水を用いてガラスピペットで洗浄します。細菌と共に60 mmのNGMプレート1枚で培養した線虫を、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。線虫は同期させていても、あるいは混合年齢であっても構いませんが、回収が困難な死骸が多いプレートや、自家蛍光が増加する飢餓状態の線虫の使用は避けてください。これらの操作には、同様にガラスピペットを使用します。蒸留水で線虫を3〜4回洗浄し、細菌を取り除きます。次に、主に成虫を回収するため、ベンチの上に3〜5分間静置します。線虫がチューブの底に沈殿した後、チューブから水の大半を取り除き、線虫の体積の約2倍の量を残しますが、全量は少なくとも 25 µL としてください。ポリリシンコートスライドの曇りガラス面に消えないインクでラベルを書き、ドライアイスの容器の隣のベンチトップにラベル面を上にして置きます。これが下側のスライドになります。同様の枚数の、ポリリシン処理されていない清潔なスライドを用意してください。スライドグラスを準備します。次に、水に懸濁した線虫約 25 µL を底部接着スライドにピペットで滴下し、ピペットチップの側面を用いて、スライドの中央に線虫を広げます。30秒から2分間静置して定着させます。 wormsの端はスライドに接触すると付着します。この手順で最も困難なのは、次のいくつかのステップを行う際にwormsが過度に歪まないようにすることです。最善の方法は、忍耐強く取り組み、あらゆる準備を整え、手が震えないようカフェインを摂りすぎないことです。片手で下のスライドグラスを持ち、すりガラス部分以外が重なるように上のスライドグラスを重ねます。液体によってスライドグラスがわずかに離れた状態となり、線虫がある程度の可動性を維持できるようにします。スライドグラス同士が滑ると線虫がねじれてしまうため、注意してください。次に、両手の親指と人差し指を使用して、上のスライドを慎重に真下に押し付けます。適正な圧力をかけると、最大サイズの雌雄同体（hermaphrodites）が数匹、スライドの端で破裂します。ほとんどの成虫と幼虫は各スライドに接触しますが、そのままの状態に留まります。直ちに、スライドがずれないように注意しながら、ドライアイス上の金属片の上に置きます。1分以内にスライドは凍結したように見えますが、完全に凍結させるため、そのまま5分間保持します。これでスライドの固定準備が整いました。すぐに固定を行わない場合は、ラベルを貼ったボックスに入れ、-80 °Cで数日間保存してください。スライドは作製後1週間程度以内に使用する必要があります。長期保存後のスライドは使用しないでください。個々の線虫についても、前述した方法と同様にスライド上で調製することが可能です。平らな金属片をドライアイスの上に置き、冷却させます。次に、ワームピックを使用して個々の線虫をNGMプレート上の水滴に移し、細菌を除去します。自家蛍光を抑えるため、線虫には十分な餌を与えておいてください。必要に応じて、線虫から細菌が完全に取り除かれるまで、新しい水滴への移送を繰り返してください。次に、前述と同様に上部および下部のスライドを準備します。その後、顕微鏡で観察しながら、下部スライドのポリリシン処理された領域に5～10 µLの水滴を落とします。ワームピックを使用して、最大20匹のワームをその水滴に移動させます。虫が沈み、粘着性のスライド表面に触れるようにします。その後、前と同様に上のスライドを載せますが、スライドがすぐにずれないように注意しながら、圧縮はしないでください。スライドをドライアイス上の金属の上に置きます。ドライアイス上で5〜30分間保持し、直ちに固定処理に移行します。これらのスライドは後で使用するために保存することはできません。線虫を軽く固定する場合、まず固定液を入れた染色瓶を氷上に置き、10分間冷却してください。必要な溶液は、100%メタノール、100%アセトン、およびリン酸緩衝生理食塩水です。ドライアイスから底面と上面のスライドを1組取り出し、素早くねじって離し、直ちに底面のスライドを氷冷メタノールに2分間浸し、上面のスライドは廃棄します。次に、スライドをメタノールから氷冷アセトンに移し、4分間浸します。スライドに多数の線虫がいる場合、適切に作製されたスライドであっても、その多くは固定液中で脱落します。単一の線虫を載せたスライドが正しく作製されていれば、線虫は付着したままになります。最後に、固定液を洗い流すため、PBSを入れたジャーにスライドを浸します。これでスライドの準備が整いましたので、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを用いてハードフィクセーションを行うための染色に進みます。まず、試薬グレードのホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド溶液をPBSで希釈し、最終濃度を0.5から4%にします。分注した溶液は-20から-30℃で保存し、必要に応じて解凍して使用してください。ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは非常に毒性が強いため、必ず手袋を着用し、ドラフトチャンバー内で作業してください。ドライアイスから下片と上片のスライドガラスを1組取り出し、速やかにねじるようにして分離させます。線虫が入っている下片のスライドを蓋付きの平皿に置き、上片のスライドはすぐに廃棄します。スライド上の線虫がいる領域の中央に、固定液を 200 µL ピペッティングします。固定液は線虫とともに一時的に部分凍結しますが、その後融解してスライドのより広い範囲を覆います。線虫が直ちに、かつ慎重に固定液で完全に覆われていない場合は、マイクロピペットを用いて固定液を追加してください。固定液がスライドの端から溢れ出ないように注意してください。湿らせた折りたたみのリントフリーワイプをディッシュに加え、加湿状態を維持してください。ワイプがスライドに触れないようにしてください。次に、ディッシュに蓋をして、固定完了後、室温で10分間から一晩放置します。その後、ピペットを使用して、固定液と緩んだ線虫を慎重に1.5 milliliterチューブに移します。次に、スライドをPBSが入った染色瓶に浸します。虫が含まれているチューブを高速度で30秒間遠心分離し、ペレット化させます。虫をPBSで2回洗浄します。その後、スライド上の虫と並行して染色を行います。抗体染色のプロトコルは、スライド上のあらゆる組織に適用される標準的なプロトコルと同様であり、詳細は添付文書に記載されています。染色後、スライドをPBSに移し、封入準備が整うまで4°Cで最大12時間保持します。スライドを封入するには、PBSからスライドを取り出します。糸くずの出ないワイプを使用して背面を乾燥させ、その後、速やかにペーパータオル上に短時間置きます。スライド上の線虫の上に、封入剤を約20 µL滴下し、封入剤とPBSがほぼ同量になるようにします。スライドをゆっくりと傾けて、2つの溶液を混合します。封入剤は毒性があるため注意してください。フロステッド端を保持します。スライドを傾け、溶液をフロステッド端の近くに集めます。次に、気泡の混入を最小限に抑えるため、24 by 60 mmのカバーガラスの一端を溶液の上に置きます。気泡が入ると退色が進み、観察の妨げになります。カバーガラスをゆっくりと下ろします。気泡が生じた場合は、カバーガラスの端をゆっくりと持ち上げます。その後、虫体の上を滑らせないように注意しながら、再びゆっくりと下ろします。気泡を取り除くために必要であれば、PBSを追加してください。糸くずの出ないワイプを使用して、カバーガラスとスライドガラスの端を軽く押さえ、端の水分を慎重に拭き取ります。カバーガラスの周囲全体にスライドガラスの端が見えており、濡れすぎていない状態にする必要があります。カバーガラスを封印するため、端にネイルポリッシュを2〜3層塗布します。スライドが十分に密封され乾燥したら、カバーガラスとスライドの背面を清掃し、スライドホルダーのウェルに配置します。密封したスライドは、4 °Cで数日間、または長期保存の場合は-20 °Cで数週間保存可能です。DNAのDAPI染色やほとんどの緑色蛍光染料は退色するため、必要に応じて、特に油浸レンズを使用した後は、マニキュアでカバーガラスを再度密封してください。以下の代表的な画像は、細胞生物学実習コースの学部生による最初の一連の抗体染色で作成されたスライドを用いて収集したものです。この画像は、適切に圧縮され、クラッシュされ、メタノール・アセトンで軽く固定された、2匹の成体雌雄同体の頭部の例を示しています。これらは複数の抗体および染料でラベル付けされています。この方法では、ほぼ虫体全体に抗体が到達可能です。ここでの染色の結果、DPI染色で示される核の位置から、虫体のどの部分が損なわれていないかがわかります。ホルムアルデヒドのようなより強力な固定剤を使用すると、虫体の形態が歪む可能性があります。これは、赤色で示された筋肉が波打ったように見えることから確認できます。より硬い固定液を使用することに伴うもう一つの一般的な問題は、特定の組織における固定や浸透の不均一性です。ここでは、赤色で示された筋肉が虫の一部にしか染色されていないことから、その状況が確認できます。ここでは、青色で示されているDNAを含む他の染色の存在が、体の少なくとも一部が存在していたことを示しています。このような部分的な染色のパターンは、習熟することで容易に識別できるようになり、個々の虫にムラのある染色が見られたとしても、染色分布の全体像を判断することが可能です。ここでは、どのような固定条件を用いたフリーズクラッキングにおいても遭遇しやすい一般的な問題点を示しています。最も一般的な問題は、2枚のスライド間の相対的な動きによってサンプルにねじれが生じることです。圧縮時に、染色された組織の形態から、虫体の咽頭の直後でねじれが発生していることがわかります。また、この画像は、スライドにコーティングされたポリリシンに抗体が吸着することによる、バックグラウンド染色の問題も示しています。これは共焦点顕微鏡を使用することで回避できます。習熟しても、多くの個別の虫が失われたり、ここで示したような問題の一部が発生したりすることに注意してください。習得すれば、調製と固定は1時間で、染色は1日で完了させることができます。この手順に従い、任意の抗体および組織に対して染色の最適化を行うため、さまざまな固定法を実施することができます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、電子顕微鏡写真で蛍光標識タンパク質をローカライズする方法について説明します。蛍光は、第一超薄切片に光活性化ローカライゼーション顕微鏡を使ってローカライズされます。これらの画像は、同じ断面の電子顕微鏡写真に整列されます。...

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以下のプロトコルは、プロテオスタシスの変化の評価として、ワーム培養、蛍光イメージング、およびポリグルタミン凝集体を定量するための自動画像処理のためのハイスループットワークフローの開発と最適化について説明しています。...

Caenorhabditis elegansにおける凝集定量の自動化

これは、 C.エレガンス 生殖腺解離とそれに続く凍結亀裂に一般的に使用される方法であり、抗体染色 による...

C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

超解像顕微鏡は、減数分裂におけるシナプトン複合体内の成分の構成に関する詳細な洞察を提供することができます。ここでは、 カエノラブディティス・エレガンス ・シナプトン複合体の個々のタンパク質を分解するためのプロトコルを示します。...

カエノラブディティス・エレガンス生殖系列内のシナプトン複合体の超解像顕微鏡

学ぶC. elegansのフリーズクラッキング法による抗体染色技術。化学処理を最小限に抑えたタンパク質局在解析法で、蛍光顕微鏡による半 intact 線虫の効果的な染色を実現します。

抗体染色中

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