Name: 抗体染色中 C.虫「フリーズクラッキング」使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶC. elegansのフリーズクラッキング法による抗体染色技術。化学処理を最小限に抑えたタンパク質局在解析法で、蛍光顕微鏡による半 intact 線虫の効果的な染色を実現します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

資金は、NSF CCLI番号0633618とオハイオ大学によって提供されました。いくつかの株は、線虫の遺伝学センターから提供された。大学院生Reetobrata Basuさんは、ビデオに表示されます。

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

著者は、彼女が競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

凍結割れプロトコルは、Cの抗体染色のためのいくつかの方法の一つである虫。これは、ワームを染色するための比較的簡単な方法を提供していますが、最適な結果を得るための具体的な試薬と実践を必要としません。 （ 図1に概要）の重要なステップは、1）ステップ1と線虫の2）マニュアルの圧縮（ステップ2および3を参照のこと）迅速な固定をする（ステップ3）を参照してください（準備をスライドさせます。まず、スライドに線虫の付着を最大化するためには、高分子量（長いポリマー）ポリリジンのではなく、商業的に準備されたスライドに頼るとスライドを用意することをお勧めします。凍結割れスライド全体の線虫の角皮に付着するように設計されている間コマーシャルスライドを、細胞が付着できるようにするために、ポリリジンでコーティングされている。第二に、凍結前スライド間のワームを正しく圧縮するための手順は非常に重要です。それは、正しい量を使用して一緒にスライドを押すように着実に手と練習が必要個々のワームはその形態を破壊することなく、両方のスライドを接触するように圧力。多すぎても少なすぎても、圧縮のいずれかが定着時の...

タンパク質の細胞と細胞内局在を決定するために、科学者たちは、伝統的には特定のタンパク質1を認識するように選択された抗体を有する組織のラベルが付いています。 Cなどのいくつかのモデル生物でのエレガンス 、抗体染色は、多くの場合、より迅速に結果が得られた分子遺伝学的技術、により置換されている。これらは、プロモーターと関心と緑色蛍光タンパク質の遺伝子のコード領域の間の遺伝子の融合からなる構築物で形質転換する生物を含む。しかし、分子技術は、真のプロモーターと高コピー数（C. elegansの通常の技術） の2,3での構築物の発現の変化を知ることで問題を含むアーティファクトの数、対象となります。したがって、抗体を用いた染色は、生体内でのタンパク質の機能を研究する多くの科学者のための目標である。 抗体を用いて組織を染色することは、困難な場合がありますので、tibodiesは、特定の立体構造1にそれらの抗原を認識することができる。例えば、抗体は、特定の方法で修正されただけの変性または完全な抗原を認識することができるし、 その場で抗原を認識しない場合があります。線虫における抗体染色の問題は、線虫のクチクラは、組織への抗体のアクセスをブロックし、比較的不透過性のバリアを形成するという事実によって悪化する。 Cの抗体染色のために使用される、いくつかの異なる方法があります。 （私たちの以前の研究4に概説されている） 虫 。無傷で染色する「ワームを、「法は凍結し、比較的硬い固定液（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）で解凍するために開発された、凍結融解サイクルは、固定液5の急速な浸透を可能にするためにキューティクルをクラックするのに役立ちます。固定後、キューティクルは、抗体の浸透を可能にするために透過処理した;方法は、薬剤、コラゲナーゼ、またはその両方を低減5-7で処理することを含んでいた。これらのTreatmentsは、形態を保ったが、多くの場合、抗体認識を減少または破壊された。代替方法は、抗体の浸透を可能にするために解剖8が含まれています。 「凍結割れを「抗体染色9月10日を可能にするために半無傷のワームの内部へのアクセスを得るための一つの方法です。コラゲナーゼおよび還元処置を避けながら、凍結割れが固定の様々な条件で行うことができる。線虫は、2接着剤スライドの間に配置された凍結した後、スライドを分離し、下部のスライド上の線虫のほとんどは、トップスライド上のキューティクルの多くを残している。下部スライドは固定剤に配置することができ、付着した線虫を有するスライド全体を、抗体染色手順を介して転送される。この方法は、2つの主要な困難を提示しません。まず、真剣にそれらを変形させることなく、線虫を分割するのに必要な圧力の正確な量を適用することは困難である。第二に、ワームの多くはSではないでしょういずれかのスライドにチェックを入れて、固定液やリンスに失われます。しかし、適切なスライドと実践では、この方法は急速に固定剤および抗体は、多種多様で使用することができる合理的な形態を有する線虫を生じる。 この方法は、実験の目的に応じてわずかに変化させることができる。単一線虫の染色（ 例えば 、単一の形質転換体は、抗体染色を変化させたか否かを決定するために）所望される場合、最大の密着性と摺動する（しかし、より高いバックグラウンド染色）は、（下記参照）、このような余分なポリリジンを有する実験室で調製されたスライドを使用することができる。線虫がこれら注視後にポリリジンにもっと悪い付着するので、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド固定のため、高い密着性スライド（実験室用意ポリリジンスライド）が、使用されるべきである。野生型線虫は、メタノールおよび/またはアセトンで固定されている場合は、下側の接着性と摺動し、低いバックグラウンド染色を用いるべきである（市販またはlaboratoryに準備スライド）。抗体および固定剤の種々の研究室で使用されている場合、必要​​になるまで、スライドの選択は、前もって調製し、保存することができる。 線虫の組織へのアクセスが獲得された後、抗体染色手順は、（より長いインキュベーション組織の特性よりもむしろ細胞1,11で）標準的な方法に従う。

<table><tbody><tr><td>poly-L-リジンスライド(ESCOブランド)</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-545-78</td><td>シグマブランドのスライドも適しています</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン臭化水素酸</td><td>シグマ</td><td>P1524</td><td>重要:ポリリジンのブランドと高分子量ポリリジンクリティカル</td></tr><tr><td>シングルつや消しエッジスライドフィ</td><td></td><td>ッシャー48312-002</td><td>他のブランドはア</td></tr><tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>に適していますS2002-25G</td><td>TOXICは、手袋とマスクを着用して粉末を計量し、10%の在庫を作ります。他の</td></tr>ブランドは適している <tr><td>5スライドメーラー</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>71549-01</td> パラホルムアルデヒドVW MK262159 <td>Rの染色に適した小型スライドホルダーの多くの異なるブランドの1つであり、</td></tr> ストック溶液<tr><td>coplin染色</td><td>ジャーVWR</td><td>47751-792</td> 他の<td>ブランドは適切</td></tr>です<tr><td></td><td></td><td></td><td>重要:通常のホルマリン溶液(37%ホルムアルデヒド)は適していません。1)クリサトラリンパラホルムアルデヒドをリン酸緩衝液に溶解し、冷凍した小さなアリコートに保存します。または、2)電子顕微鏡グレードのパラホルムアルデヒドをアリコートで購入します。有毒-手袋を着用してください。余分なダウンシンクは水で処分します。</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液、水中25%</td><td>シグマ</td><td>G 5882</td><td>重要:アンプルに電子顕微鏡グレードのグルタルアルデヒドを購入します。有毒-手袋を着用してください。余分なダウンシンクは水で処分します。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>他のブランドが適切です</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>フィッシャー</td><td>ICN820451</td><td>他のブランドはロ</td></tr><tr><td>バ血清、凍結乾燥ジャ</td><td>クソン免疫研究</td><td>017-000-121</td><td>他のブランドはCy3</td></tr>ロ<tr><td>バ抗マウスIgGマルチラベリング</td><td>に適しています ジャクソン免疫研究</td><td>715-165-150</td><td>この会社は、高品質のマルチラベル(アフィニティー枯渇)抗体に推奨されます。適切な色素と抗原(一次抗体の産生に用いる動物)を選択します。</td></tr><tr><td>n-プロピルガレート</td><td>フィッシャー</td><td>ICN10274750</td><td>他のブランドは、</td></tr><tr><td>DAPI、4'、6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>D 9542</td><td>有毒に適しています。手袋を着用し、小さなアリコートに分配し、露出を最小限に抑えるためにフィーズ</td></tr>します <tr><td>Whatman #1 15 cm直径フィルター</td><td>フィッシャー09805G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ #1 1/2 長方形 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 厚さは光学的に最高です</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフォルダー</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>他のブランドが適しています</td></tr></tbody></table>

抗体染色中<em&gt; c.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

C.を染色する抗体を用いた虫は 、比較的不透過性のキューティクルは、化学的または機械的な方法でバイパスする必要があります。 「凍結割れを「物理的に二つのスライド間の接着性の線虫を圧縮し、それらを凍結し、そして離れてスライドを引っ張ることにより線虫のクチクラをプルするために使用される一つの方法である。凍結割れは、化学処理をせずに、組織へのアクセスを獲得するための簡単​​かつ迅速な方法を提供し、様々な固定剤と共に使用することができる。しかしながら、標本の多くの損失をもたらし、必要な圧縮は、機械的にサンプルを歪める。実際には、良好な形態を有するサンプルの回収を最大化するために必要とされる。凍結割れは、特定の固定条件、​​サンプルの回収、または低非特異的染色のために最適ではなく、すべてのパラメータの一度にすることができます。非常に難しいの固定条件を必要とし、化学的にキューティクルを透過性にするために必要な化学処理を容認する抗体について、treatmen溶液中のインタクトな線虫のtが好ましい場合がある。抗体が必要な場合は軽量化の修正や最適な固定条件が不明である場合には、凍結割れが急速に抗体をアッセイすると、目的の抗原に特異的な細胞内および細胞内局在情報を得ることができる非常に便利な方法を提供します。

ワームが適切に圧縮ひび割れ、軽く固定した場合、事実上、全体のワームは、抗体染色がアクセスすることができます（ 図2を参照）。 DAPI染色によって示されるように、核の位置は、ワームの部分がワームをホルムアルデヒドなどの硬い固定液に供された場合の不自然波状の出現によって示されるように、ワームの形態は（歪む無傷であるかを示す図3A〜Dの筋肉）。別の一般的な問題は、特定の組織の不均一な固定又は浸透である。この例は、筋肉がDNA染色を含む他の染色の存在は、（本体の少なくとも一部が存在したことを示しているという事実にもかかわらず、唯一のウォームの一部に染色され、図3E-Hに示されているすなわち 、凍結割れ）の間に除去されない。全体の配電のように、部分的な染色の結果として生じるパターンは、容易に、実際に同定することができる染色上の任意の単一のワームが不均一な染色を示している場合であっても決定することができる。 凍結割れ任意定着条件を用いて遭遇する共通の問題は、最終的な図（ <...

「凍結割れ、「線虫C.の内部組織を露出させるための方法をタンパク質の局在化のための抗体に虫が 、実証されている。

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

この手順の全体的な目的は、C. elegansの抗体染色を行うことです。そのために、線虫を洗浄してスライドグラス上に広げ、2枚の接着スライドの間で慎重に圧縮し、その後ドライアイスで凍結させます。次に、スライドを分離して線虫の体を破裂させ、直ちに固定液に浸します。その後、標準的な抗体染色法を用いて線虫を染色し、蛍光顕微鏡で解析することで、半完結状態の線虫への抗体染色の成功が確認されます。完結した線虫の固定などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、試料への化学的処理を最小限に抑えられる点にあります。一般的に、スライドと線虫の調製にはある程度の習熟を要するため、この手法を初めて行う場合は困難が予想されます。本手順は、私と私の研究室の大学院生であるRTO Basuで実施します。染色のための線虫プレートを準備するには、まず金属の平板をドライアイスの上に置いて冷却し、蒸留水を用いてガラスピペットで洗浄します。細菌と共に60 mmのNGMプレート1枚で培養した線虫を、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。線虫は同期させていても、あるいは混合年齢であっても構いませんが、回収が困難な死骸が多いプレートや、自家蛍光が増加する飢餓状態の線虫の使用は避けてください。これらの操作には、同様にガラスピペットを使用します。蒸留水で線虫を3〜4回洗浄し、細菌を取り除きます。次に、主に成虫を回収するため、ベンチの上に3〜5分間静置します。線虫がチューブの底に沈殿した後、チューブから水の大半を取り除き、線虫の体積の約2倍の量を残しますが、全量は少なくとも 25 µL としてください。ポリリシンコートスライドの曇りガラス面に消えないインクでラベルを書き、ドライアイスの容器の隣のベンチトップにラベル面を上にして置きます。これが下側のスライドになります。同様の枚数の、ポリリシン処理されていない清潔なスライドを用意してください。スライドグラスを準備します。次に、水に懸濁した線虫約 25 µL を底部接着スライドにピペットで滴下し、ピペットチップの側面を用いて、スライドの中央に線虫を広げます。30秒から2分間静置して定着させます。 wormsの端はスライドに接触すると付着します。この手順で最も困難なのは、次のいくつかのステップを行う際にwormsが過度に歪まないようにすることです。最善の方法は、忍耐強く取り組み、あらゆる準備を整え、手が震えないようカフェインを摂りすぎないことです。片手で下のスライドグラスを持ち、すりガラス部分以外が重なるように上のスライドグラスを重ねます。液体によってスライドグラスがわずかに離れた状態となり、線虫がある程度の可動性を維持できるようにします。スライドグラス同士が滑ると線虫がねじれてしまうため、注意してください。次に、両手の親指と人差し指を使用して、上のスライドを

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、電子顕微鏡写真で蛍光標識タンパク質をローカライズする方法について説明します。蛍光は、第一超薄切片に光活性化ローカライゼーション顕微鏡を使ってローカライズされます。これらの画像は、同じ断面の電子顕微鏡写真に整列されます。...

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する...

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

この動画では、キューティクルを破壊することでC.エレガンスの組織を抗体染色に利用できるようにする方法であるフリーズクラッキングについて説明しています。...

線虫の凍結亀裂:染色のために内部の線虫組織を露出させる方法

私たちは、反復配列の観察と定量化のために、線虫Caenorhabditis elegansの生殖腺と胚における蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)の簡潔な手順を報告します。...

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</emPNAプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

我々は、解剖CのアクティブなERKの空間的および時間的局在化のための免疫蛍光イメージングベースの方法を提示しますエレガンス生殖腺。ここで説明するプロトコルは、Cの任意のシグナルまたは構造タンパク質の可視化のために適合させることができますエレガンス生殖腺は、適切な抗体試薬は入手可能です提供しました。...

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

透明な線虫の腸、「体内組織商工会議所「多細胞 tubulogenesis の中に apicobasal の膜と内腔の生合成単一セルおよび細胞内レベルでの勉強のためとして使用できます。このプロトコルでは、分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ、機能喪失遺伝的/RNAi...

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP...

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

以下のプロトコルは、プロテオスタシスの変化の評価として、ワーム培養、蛍光イメージング、およびポリグルタミン凝集体を定量するための自動画像処理のためのハイスループットワークフローの開発と最適化について説明しています。...

Caenorhabditis elegansにおける凝集定量の自動化

これは、 C.エレガンス 生殖腺解離とそれに続く凍結亀裂に一般的に使用される方法であり、抗体染色 による...

C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

超解像顕微鏡は、減数分裂におけるシナプトン複合体内の成分の構成に関する詳細な洞察を提供することができます。ここでは、 カエノラブディティス・エレガンス ・シナプトン複合体の個々のタンパク質を分解するためのプロトコルを示します。...

カエノラブディティス・エレガンス生殖系列内のシナプトン複合体の超解像顕微鏡

学ぶC. elegansのフリーズクラッキング法による抗体染色技術。化学処理を最小限に抑えたタンパク質局在解析法で、蛍光顕微鏡による半 intact 線虫の効果的な染色を実現します。

抗体染色中

さらに動画を探す