抗体染色中 C.虫「フリーズクラッキング」使用

この手順の全体的な目標は、C eleganceで抗体染色を行うことです。これを行うには、線虫をすすぎ、スライド上に広げ、2つの接着スライド間で慎重に圧縮し、ドライアイスで凍結します。次に、スライドを分離して線虫を割って開き、すぐに固定液に入れます。

次いで、線虫を標準的な抗体染色技術を用いて染色し、蛍光顕微鏡法による分析により、半無傷の線虫の抗体染色が成功したことが明らかになる。この技術が無傷の線虫の固定などの既存の方法よりも優れている主な点は、サンプルの化学処理を最小限に抑えることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、スライドや線虫の準備がデモンストレーションにやや難しいため、苦労するでしょう。

手順は私自身とRTOです Basu、私の研究室の大学院生 染色用の線虫のプレートを準備するには、まず平らな金属片をドライアイスの上に置いて、蒸留水とガラスピペットリンスを使用して冷却します。1つの60 mm NGMプレートで増殖した線虫を、バクテリアとともに1.5 mLのマイクロフュージチューブに入れます。ワームは同期年齢または混合年齢にすることができますが、同じガラスピペットを使用して自家蛍光を増加させる、割れにくいダワーズや飢餓状態のワームを多く含むプレートの使用は避けてください。

ワームを蒸留水で3〜4回すすぎ、バクテリアを取り除きます。次に、主に大人を集めるために、彼らをベンチに3〜5分間座らせます。ワームがチューブの底に落ち着いたら、チューブからほとんどの水を取り除き、ワームの約2倍の水量を残しますが、総量は少なくとも25マイクロリットルです。

ポリリジンスライドのつや消し面に消えないインクでラベルを付け、ドライアイスラベル面を上にして、スライドを容器の隣のベンチトップに置きます。これは、下部のスライドとして機能します。同数のクリーンな非ポリリジンを処理してもらいます。

トップスライドが利用可能です。次に、水中の約25マイクロリットルのワームを底部接着スライドにピペットで移動し、ピペットチップの側面を使用して、スライドの中央にワームを広げます。30秒から2分落ち着かせます。

ワームの端は、スライドに接触するとくっつきます。この手順の最も難しい側面は、次のいくつかの手順を実行するときにワームが歪みすぎないようにすることです。これを行う最善の方法は、忍耐強く、すべての準備ができており、カフェインを飲みすぎないように

下部のスライドを片手で持ち、上部のスライドをその上に置いて、つや消しの部分を除くすべての部分が重なるようにします。液体はスライドをわずかに離して保持し、ワームがある程度の可動性を持つようにする必要があります。スライドが互いに滑り落ちると、ワームがねじれます。

次に、各手の親指と人差し指を使用して、上部のスライドを慎重にまっすぐ下に押します適切な量の圧力で、スライドの端で最大の雌雄同体のいくつかが破裂します。ほとんどの成虫と幼虫は各スライドに接触しますが、スライドが滑らないようにすぐに慎重に無傷のままで、ドライアイスの上の金属片の上に置きます。1分以内にスライドがフリーズしたように見えますが、完全にフリーズするように5分間そのままにしてください。

これで、スライドを固定する準備が整いました。続行しない場合は、すぐにスライドをマイナス80°Cのラベル付きボックスに数日間保管してください。作ってから1週間ほどで使用してください。

長期保管後はスライドを使用しないでください。個々の線虫は、前に示したのと同様の方法でスライド上に調製することもできる。平らな金属片をドライアイスの上に置いて冷やします。

次に、ワームピックを使用して、個々の線虫をNGMプレート上の水滴に移し、細菌から解放します。線虫は、自家蛍光を減らすために十分に給餌されるべきです。可能であれば、ワームにバクテリアがなくなるまで、必要に応じて新しい水の場所への移動を繰り返します。

次に、先ほどと同様に上下のスライドを準備します。次に、顕微鏡で観察しながら、ボトムスライドのポリリジン処理領域に5〜10マイクロリットルの水滴を置きます。ワームピックを使用して、最大20個のワームを水滴に移します。

ワームは、粘着性のあるスライド表面に触れるために沈む必要があります。次に、前と同じように上部のスライドを置きますが、スライドがすぐに滑らないようにしながら圧縮しないでください。ドライアイスの上の金属の上にスライドを置きます。

ドライアイスで5〜30分間保持し、すぐに固定に進みます。これらのスライドは、後で使用するために保存することはできません。ワームを軽く固定するには、まず固定液の入った染色瓶を氷の上に置いて10分間冷やします。

必要な溶液は、100%メタノール、100%アセトン、およびリン酸緩衝生理食塩水です。ドライアイスからボトムスライドとトップスライドのペアを取り、すばやくねじってバラバラにし、すぐにボトムスライドを氷冷メタノールに2分間浸し、トップスライドを廃棄します。次に、スライドをメタノールから氷冷アセトンに4分間移します。

スライドにワームがたくさんあった場合、よく準備されたスライドでも、そのほとんどが固定剤で落ちます。シングルワームスライドが適切に準備されていれば、ワームは付着したままであるはずです。最後に、固定剤を洗い流すために、スライドをPBSで瓶に浸します。

これで、スライドを染色する準備ができ、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを使用してハードフィックスを行うことができます。まず、PBS中の試薬グレードのホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド溶液を最終濃度0.5〜4%に希釈します。アリコートはマイナス20度からマイナス30度で保存し、必要に応じて解凍できます。ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは常に非常に有毒であるため、手袋を着用し、ドラフトで作業する必要があることを忘れないでください。

ドライアイスからボトムスライドとトップスライドのペアを取り、すぐにすばやくねじります。ふた付きの平らな皿にワームが入った下部のスライドを置き、すぐに上部のスライドをスライドの領域の中央に200マイクロリットルの固定液をピペットで捨てます。ワームの場合、固定液は所定の位置で部分的に凍結し、その後溶融してスライドのより広い領域を覆います。

ワームがすぐに慎重に固定剤で完全に覆われていない場合は、マイクロピペットを使用して固定剤を追加してください。固定剤がスライドの端を流れないようにしてください。折りたたんだ濡れた糸くずの出ないワイプを皿に追加して、加湿を保ちます。

ワイプがスライドに触れないようにしてください。次に、皿に蓋をして、固定が完了した後、室温で10分間から一晩放置し、ピペットを使用して、緩いワームで固定剤を1.5ミリリットルのチューブに慎重に移します。次に、スライドをPBSを含む染色ジャーに浸します。

ワームの入ったチューブを高速で30秒間回転させて、ワームをペレット化します。ワームをPBSで2回すすいでください。次に、スライド上のワームと並行してそれらを染色します。

抗体染色プロトコルは、スライド上の任意の組織に対する標準的なプロトコルと同様に、添付の文書で詳細に説明されています。染色後、スライドをPBSに移し、マウントの準備ができるまで摂氏4度で最大12時間そこに留まらせます。スライドを取り付けるには、PBS からスライドを取り外します。

糸くずの出ないワイプで裏面を乾かし、ペーパータオルの上にすばやく置きます。約20マイクロリットルの封入剤をワームの上に置いて、培地とPBSの部分がほぼ等しくなるようにします。スライド上。

スライドをゆっくりと傾けて、2つの溶液を混合します。注意:封入剤は有毒です。つや消しの端を保持します。

溶液がフロスティングの近くに集まるようにスライドを傾けます。次に、24 x 60 mmのカバースリップの一方の端を溶液に置き、漂白を増やして表示を乱す気泡を最小限に抑えます。カバースリップをそっと下げます。

気泡が発生する場合は、カバースリップの端をゆっくりと持ち上げます。次に、ワームを横切らずに、ワームを下げ直します。必要に応じてPBSを追加して、気泡をなくします。

糸くずの出ないワイプを使用して、カバースリップの端を圧縮し、慎重にスライドさせて端を乾かします。スライドの端は、カバースリップの端全体に見える必要があり、濡れすぎないようにする必要があります。カバースリップを密封し、端に2〜3層のマニキュアを塗ります。

スライドがしっかりと密閉されて乾いたら、カバースリップとスライドの裏側を清掃し、スライドホルダーウェルに入れます。密封されたスライドは、摂氏4度で数日、または摂氏マイナス20度で数週間、長期間保持できます。DNAの汚れやほとんどの緑色の染料は、特に油浸レンズを使用した後、必要に応じてマニキュアでカバースリップを再シールします。

以下の代表的な画像は、細胞生物学研究室のコースで学部生が初めて抗体染色を試みたときに作成されたスライドを使用して収集されました。この画像は、メタノールアセトンで適切に圧縮され、ひび割れ、軽く固定された2つの成体の雌雄同体の頭の例を示しています。それらは複数の抗体と色素で標識されました。

この場合、事実上、線虫全体が抗体にアクセスできます。ここで染色すると、DPI染色で示される核の位置は、線虫のどの部分が無傷であるかを示します。線虫がホルムアルデヒドなどのより硬い固定剤にさらされると、線虫の形態が歪むことがあります。

これは、これらの画像では、赤で示されている筋肉の波状の外観として見ることができます。より硬い固定剤の使用に関連する別の一般的な問題は、特定の組織の不均一な固定または浸透です。これは、赤で示された筋肉が線虫の一部でのみ染色されている場合に見られます。

ここで、青色で示されているDNAを含む他の染色の存在は、体の少なくとも一部が存在していたことを示しています。結果として生じる部分染色のパターンは、練習で容易に特定できるため、1匹の寄生虫が不均一な染色を示した場合でも、染色の全体的な分布を決定できます。ここでは、任意の固定条件を使用した凍結亀裂で発生する一般的な問題を示します。

最も一般的な問題は、2つのスライドの相対運動によるサンプルのねじれです。ここでの圧縮中、染色された組織の形態は、線虫の体が咽頭のすぐ後方にねじれていることを示しています。この画像は、スライドをコーティングしたポリリジンに抗体が付着することによるバックグラウンド染色の問題も示しています。

これは、共焦点顕微鏡を使用することで回避できます。練習しても、多くの個々のワームが失われたり、ここに示されている問題の一部が見られることに注意してください。一度習得すれば、調製と固定は1時間で完了し、染色は1日で完了します。

この手順に続いて、任意の抗体および組織の染色を最適化するために、さまざまな固定方法を実施することができます。