ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化
2013年9月12日
自然免疫応答は、病原体感染に対する生物を保護します。自然免疫応答の重要な構成要素は、食細胞の呼吸バーストは、侵入する微生物を殺す活性酸素種を生成します。我々は、先天性免疫応答が化学的に誘発されたときに生成される活性酸素種を定量化する呼吸バーストアッセイを記載している。
この手順の全体的な目標は、蛍光を使用して呼吸バースト応答を定量化することです。まず、ゼブラフィッシュの胚を96ウェルプレートのウェルにロードします。次に、蛍光基質を添加し、化学薬品で呼吸バーストを活性化します。
次に、蛍光計を使用して相対蛍光を定量化します。最終的に、蛍光は呼吸バースト電位を示すために使用されます。この方法は、実験的操作が全体的な自然免疫の健康にどのように影響するかを研究するために使用できます。
ここでは、ゼブラフィッシュの胚の呼吸バーストに関する洞察を提供するためにこれを使用しますが、成体のゼブラフィッシュ、腎臓細胞、他の魚種の細胞調製物などの他のシステムにも適用できます。卵水中の摂氏28度の深いシャーレで胚を目的の発生段階まで成長させます。死んだ胚を毎日取り除きます。
古い卵の水を慎重にデカントし、毎日新しい卵の水を補充します。実験当日は、ホイルで包んだ1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブにフルオレセインの作動液を還元します。また、PMA最終濃度1ミリリットルあたり20マイクログラムの作業溶液を準備します。
次に、添付のテキストで説明されているように、15ミリリットルの円錐管に各投与溶液の5ミリリットルを作ります。投与溶液を氷上に置いたまま、まずマイクロプレートリーダーの電源を入れ、光源を温めて蛍光を測定します。励起波長と発光波長、光学位置感度を詳述するプログラムを設定し、5秒間の振とうステップも含めます。
リードの前に、コーティングされた胚で皿の実験用品を手配します。黒色の96ウェルマイクロプレートにP 200ピペッターを挟み、フルオレセインを含む試薬を氷のバケツに入れます。マルチチャンネルP 200ピペッター、2つの滅菌リザーバー、アルミホイル、ハサミ。
次に、胚または腎臓が開口部に収まるようにピペットの先端をカットします。P 200ピペッターを100マイクロリットルに設定し、1つの胚と卵水を必要な数の黒い96ウェルマイクロプレートのウェルに移します。次に、マルチチャンネルP 200ピペッターを備えた滅菌25ミリリットルのリザーバーに投与溶液を注ぎます。
100マイクロリットルのH 2D CFDA投与溶液を96の1列に加えます。ウェルマイクロプレートは、コントロール胚サンプルの半分と実験的に操作された胚サンプルの半分について繰り返します。PMA含有投与溶液を新しい滅菌25ミリリットルリザーバーに注ぎます。
次に、この投与溶液を96ウェルマイクロプレートの残りのカラムに分注します。マイクロプレートをアルミホイルで覆い、シェーカーに約20秒間置きます。150 RPMで、マイクロプレートが読み取られていないときは、マイクロプレートを摂氏28度でインキュベートします。
PMAを添加した後、マイクロプレートを読み取ります。必要な時間間隔で数分ごとに測定を続けるか、ホイルで包まれたマイクロプレートを摂氏28度で固定時点までインキュベートします。次に、井戸から胚を回収し、施設の動物の世話と使用プロトコルに従って胚を安楽死させます。
また、マイクロプレートやその他の使い捨て材料は、バイオハザード廃棄物ペインターで廃棄してください。蛍光を比較する時点を決定します。個々の PMA 誘導対照群のインフルエンザ蛍光値から、平均非誘導対照群の蛍光値を差し引きます。
PMAの有無にかかわらず、実験グループについてこれを繰り返します。次に、これらの正規化された蛍光値をカラム、コントロールとPMAグループ、および実験とPMAグループに保存します。次に、コントロールとPMAグループ、および実験とPMAグループの正規化された蛍光値の平均と標準偏差を計算します。
対応のないT検定を使用して正規化された蛍光値を比較し、統計的有意性を判定します。次に、コントロールとPMAグループの平均と実験とPMAグループの平均をグラフ化し、適切な標準偏差を反映したエラーバーを使用して、グラフと図の凡例に有意水準を記録します。この実験では、AB背景の野生型ゼブラフィッシュ胚の受精後48時間と72時間での呼吸バースト応答を比較します。
生蛍光は、PMA誘導群におけるPMAの添加の4時間後に測定された。生の蛍光値は、72 HPF 集団で高かった。計算された平均で示されるように、蛍光値は、蛍光のバックグラウンドレベルの変動性を考慮して正規化されています。
この呼吸バーストアッセイの結果、72 HPF ゼブラフィッシュの胚は、PMA による導入後に 48 HPF の胚よりも有意に多くの活性酸素種を産生できるため、より強力な呼吸バースト応答を発現できることが明らかになりました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚の呼吸バースト電位を定量化するために蛍光を使用する方法についてよく理解できるはずです。PMAパウダーの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでくださいので、PMAパウダーの計量中はフェイスマスクを着用するなどの注意を払ってください。
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概要
本記事では、自然免疫応答中に産生される活性酸素種を定量する呼吸バーストアッセイについて解説します。この手法では、化学物質によって活性化されたゼブラフィッシュ胚における呼吸バーストを、蛍光を用いて測定します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 自然免疫
- 食細胞機能
- 活性酸素種
背景
- 自然免疫応答は、病原体に対する防御において極めて重要です。
- 食細胞は活性酸素種を生成し、微生物を殺菌します。
- レスピラトリーバーストを定量することで、免疫状態に関する知見を得ることができます。
- このアッセイは、さまざまな実験的操作に適応させることが可能です。
研究目的
- 呼吸バースト反応を定量化するための手法を開発すること。
- 化学物質が自然免疫機能に及ぼす影響を評価すること。
- ゼブラフィッシュモデルにおける免疫健康状態を研究するためのツールを提供すること。
使用した手法
- ゼブラフィッシュ胚を96ウェルプレートに分注する。
- ウェルに蛍光基質を添加する。
- 化学剤を用いて呼吸バーストを活性化させる。
- フルオリメーターを用いて蛍光強度を定量する。
主な結果
- 本アッセイにより、呼吸バースト能を定量的に評価することが可能です。
- 蛍光レベルは自然免疫応答と相関します。
- この手法を用いることで、免疫状態の評価が行えます。
- 本アッセイを用いて、実験的な処置による影響を評価できます。
結論
- レスピラトリーバーストアッセイは、自然免疫を研究するための有用なツールです。
- 蛍光定量により、免疫応答に関する知見が得られます。
- この手法は、研究における免疫状態の理解を深めることができます。
よくある質問
産業上の重要性
呼吸バースト反応を定量化することで、ゼブラフィッシュモデルにおける自然免疫状態の機能的な読み出しが可能となり、免疫調節化合物の早期段階での評価が行えます。本アッセイは、遺伝学的または薬理学的な操作を、病原体防御における主要なエフェクターメカニズムである活性酸素種の産生の測定可能な変化に結びつけることで、ターゲットのバリデーションを支援します。この手法は、発生段階やサンプルタイプを問わず適応可能であるため、前臨床投資を行う前に免疫調節リード化合物のリスクを低減させる上で有用性が高まります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：実験的な操作に応答した食細胞活性化の機能的出力を測定することにより、治療仮説を検証します。
- 運用的価値：遺伝的条件または治療条件における呼吸バースト能を定量的に比較することで、生物学的なリスク低減を可能にします。
- 予測的価値：アッセイの読み取り値と自然免疫能を相関させることでポートフォリオの選別をサポートし、免疫調節候補物質の継続・中止（go/no-go）の決定に寄与します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングに適した、標準化された定量的な蛍光出力を生成します。
- 再現性： 正規化された蛍光値と統計的比較（対応のないt検定）を用いることで、実験間の信頼性の高い比較を保証します。
- 拡張性： 96ウェルプレート形式に対応しており、多条件での試験や、免疫プロファイリングワークフローにおけるクロスプラットフォームでの再利用を容易にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：感染および炎症に関連する自然免疫応答をモデル化し、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性をサポートします。
- 前臨床段階の継続性：創薬段階での知見を、個体または組織標本における機能的な免疫学的検証へとつなげます。
- リスク調整後の進展：呼吸バースト活性を有意に調節する化合物を特定することで、リード最適化に関する意思決定に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲットバリデーションからリード化合物特定に至る創薬のコンティニュアムに適合し、ターゲットエンゲージメントや表現型スクリーニングを補完する機能的な免疫プロファイリングデータを提供します。
- 発見生物学：遺伝子ノックダウン、過剰発現、または薬剤処理を、自然免疫エフェクター機能の測定可能な変化に結びつけることで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：再現性のある定量的な出力を提供し、食細胞の活性化に対する化合物の影響を信頼性高く比較することを可能にします。
- 分析：標準化された蛍光値および統計出力（平均値、標準偏差、t検定結果）を生成し、実験条件の客観的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：成体ゼブラフィッシュの腎臓や種間細胞調製物での活用を通じて、初期の免疫学的知見を前臨床的な関連性へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：免疫調節、感染モデル、または炎症経路を研究する複数のプロジェクトに適用可能な、モジュール式の免疫健康状態読み出し機能として機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：免疫調節作用に関するメカニズム的な曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：基質のインキュベーション、誘導、および測定プロトコルを明確に定義し、標準化と再現性を確保する。
- 戦略的価値：機能的な免疫健康状態のリードアウトに基づいて、免疫調節リード候補の早期リスク低減を可能にし、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：自然免疫能の指標となる呼吸バースト能を有意に変化させる化合物を特定することで、リスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- ゼブラフィッシュ胚の取り扱い、蛍光測定、および標準化データの統計解析に関する専門知識が必要です。
- 蛍光検出機能を備えたマイクロプレートリーダーへのアクセスと、適切な光源のウォームアップが必要です。
- 胚のステージ判定、投与タイミング、およびバックグラウンド除去プロトコルのチーム間での標準化が不可欠です。
- 出典に記載されている通り、本手法を成体組織や他の魚種に適用する場合は、適合させるための検討が必要です。
- PMAの有害性などの実用上の制限があり、取り扱いおよび秤量時の安全対策が求められます。
