ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

この手順の全体的な目的は、蛍光を用いて呼吸バースト反応を定量化することです。まず、ゼブラフィッシュ胚を96ウェルプレートの各ウェルに導入します。次に、蛍光基質を添加し、化学剤を用いて呼吸バーストを活性化させます。

次に、フルオリメーターを用いて相対蛍光量を定量します。最終的に、この蛍光を用いて呼吸バースト能を示します。この手法は、実験的な操作が自然免疫全体の健康状態にどのように影響するかを研究するために利用できます。

ここでは、ゼブラフィッシュ胚の呼吸バーストに関する知見を得るためにこの手法を用いますが、成体ゼブラフィッシュ、腎細胞、および他の魚種から調製した細胞などの他の系にも適用可能です。胚を卵水が入った深いペトリ皿に入れ、28 °Cで目的の発育段階まで育成します。死滅した胚は毎日取り除いてください。

古い卵水を注意深くデカンテーションして除去し、毎日新しい卵水で補充してください。実験当日は、アルミホイルで遮光した1.7 milliliterマイクロ遠心チューブで、希釈したフルオレセイン作業溶液を作成します。また、最終濃度が20 micrograms per milliliterとなるPMA作業溶液も準備してください。

次に、付属のテキストに記載されている通り、15 mLコニカルチューブを用いて各投与溶液を5 mLずつ調製します。投与溶液を氷上に保持し、まずマイクロプレートリーダーの電源を入れ、蛍光測定のために光源をウォームアップさせます。励起波長と蛍光波長、光学系のポジション感度を詳細に設定したプログラムを作成し、5秒間の振盪ステップも含めてください。

実験を開始する前に、コーティング済み胚を入れたディッシュなどの実験用消耗品を準備します。黒色の96ウェルマイクロプレート、P 200ピペッターおよびチップ、そしてフルオレセイン含有試薬を入れた氷バケツを用意します。また、マルチチャンネルP 200ピペッター、滅菌済みリザーバー2個、アルミホイル、およびハサミを準備します。

次に、胚または腎臓が開口部を通過できるようにピペットチップを切断します。P 200 ピペッターを 100 µL に設定し、卵水とともに胚を 1 個ずつ、黒色の 96 ウェルマイクロプレートの必要な数のウェルに分注します。次に、マルチチャンネル P 200 ピペッターを用いて、投与溶液を滅菌済みの 25 mL リザーバーに注ぎ入れます。

H 2D CFDA投与溶液100 µLを96ウェルマイクロプレートの1列に加えます。これを、対照群の胚サンプルの半分および実験的操作を施した胚サンプルの半分に対して繰り返します。PMAを含む投与溶液を、新しい滅菌済みの25 mLリザーバーに注ぎます。

次に、この投与溶液を96ウェルマイクロプレートの残りの列に分注します。マイクロプレートをアルミホイルで覆い、シェーカーに載せて約20秒間振盪させます。測定時以外は、マイクロプレートを150 RPMで28 °Cにてインキュベートしてください。

PMAを添加した後、マイクロプレートを読み取ります。希望の時間間隔で数分ごとに測定を継続するか、アルミホイルで包んだマイクロプレートを28 °Cで一定の時間までインキュベートします。次に、ウェルから胚を回収し、施設内の動物ケアおよび使用プロトコルに従って胚を安楽死させます。

また、マイクロプレートおよびその他の使い捨て材料は、バイオハザード廃棄物容器に廃棄してください。蛍光を比較したいタイムポイントを決定します。個々のPMA誘導コントロール群の蛍光値から、非誘導コントロール群の平均蛍光値を差し引きます。

PMA添加ありおよび添加なしの実験群についても同様の操作を繰り返します。次に、これらの標準化された蛍光値を、「コントロール＋PMA群」および「実験群＋PMA群」の列に保存します。続いて、コントロール＋PMA群と実験群＋PMA群の標準化蛍光値について、平均値と標準偏差を算出します。

非対応T検定を用いて標準化された蛍光値を比較し、統計的有意性を判定します。次に、コントロール＋PMA群と実験群＋PMA群の平均値を、適切な標準偏差を示すエラーバーと共にグラフ化してください。有意水準をグラフ内および図の説明文に記載します。本実験では、受精後48時間および72時間のAB系統の野生型ゼブラフィッシュ胚における呼吸バースト反応を比較します。

PMA誘導群では、PMA添加の4時間後に生の蛍光強度を測定しました。生の蛍光値は、72 HPFの集団においてより高い値を示しました。算出された平均蛍光値で示されているように、蛍光のバックグラウンドレベルの変動を考慮して正規化が行われています。

このレスピラトリーバーストアッセイの結果から、72 HPFのゼブラフィッシュ胚は、PMAによる誘導後、48 HPFの胚よりも有意に多くの活性酸素種を産生し、より強力なレスピラトリーバースト応答を示すことが明らかになりました。このビデオを視聴することで、蛍光を用いてゼブラフィッシュ胚のレスピラトリーバースト能を定量化する方法を十分に理解できるはずです。PMA粉末の取り扱いは極めて危険であるため、PMA粉末の秤量時にはフェイスマスクを着用するなど、十分な予防策を講じてください。