複数の腫瘍マーカーのターゲットとするためのポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー：個別化医療の機会？

全体的な目標は、個人の疾患、特にがんの遺伝的構成に基づいた個別化医療を合成するための汎用プロトコルが利用可能なナノスケールプラットフォームを構築することである。まず、微生物のfrum polycephalumからポリマロン酸（PMLA）を製造し精製する。精製したPMLAの側鎖にあるカルボキシ基を化学的に活性化させ、活性化基の置換によって小さな官能基とリンカーであるMEAを結合させ、未使用の活性化基は加水分解によりカルボキシ基に戻す。

次に、スペーサーであるMEAおよびキャップのスルフィドヒドロ基を介して、抗体とアンチセンス分子を添加します。反応完了後、PDPを用いて未使用のスペーサーを確認し、リードの組成と機能をテストします。ナノドラッグの結果は、攻撃的なヒトがんを担有するマウスなどの動物モデルから得られます。

HER2陽性の乳がんは、治療の有効性だけでなく、治療に望ましくない副作用が伴わないかどうかも判断することができます。開環重合のような既存の合成法に対するバイオ生産の主な利点は、バイオポリマーが完全な光学純度を保持し、副産物による汚染がないことです。このPolyPhenナノドラッグファミリーは、特定のターゲットに基づいたあらゆる細胞型を標的とすることができ、タンパク質発現を調節することが可能です。

一般的に、PHEナノ薬物によるがん治療は、原発性脳腫瘍および乳がんを含むいくつかの動物モデルにおいて非常に効率的です。我々は最初、この手法を用いてグリオブラストーマ特異的なラミンのisof形態の合成を阻害するというアイデアを得て、その後、HER2およびトリプルネガティブ乳がんタンパク質の標的化と抑制によって腫瘍の増殖を防ぐことを証明しました。この技術の応用範囲は、光学および磁気共鳴イメージングを用いたがんの診断にまで及びます。

ポリナノドラッグは、がん治療のための薬物送達に関する知見を提供します。また、感染症、疼痛緩和、神経疾患などの他の病理学的状態にも適用可能です。らせん状のオーガーから種原虫培養物を育成した後、100 millilitersの基礎培地を接種し、25 degrees Celsiusで培養します。

恒温インキュベーターを用いて、遮光条件下で重力充填されたマイクロプラズマ培地を作製します。10リットルのバイオリアクター容器内での芽胞形成を避けるため、8リットルの基礎培地に80グラムの炭酸カルシウムを溶解させ、その後、充填したマイクロプラズマ培地を設置済みの反応容器に移し、バイオプロセスを75時間に設定します。温度は25 °C、ろ過空気の流量は10 L/min、セグメント攪拌による攪拌速度は150 RPMとします。

培養液のpHが4.8に達したら、培養を停止してポリマレイン酸の生成量を測定します。次に、培養液を17 °Cまで冷却し、細胞を重力で沈降させた後、リアクターから培養上清を除去します。pHを7.5に調整します。

次に、5 °Cで20 mM tris hydrochloride pH 7.5で平衡化した1.5 LのDEAEセルロースカラムの下端から上端に向かって上清をポンプで注入します。その後、0.3 M sodium chlorideを含む洗浄バッファーをカラム量3倍分、下端から上端へと通液し、0.7 M sodium chlorideを用いてPMLAを溶出させます。溶出されたPMLA分画を0.1 M calcium chlorideに調整し、氷冷80% ethanolを加えてPMLAカルシウムを沈殿させます。続いて、Sephadex G 25と水を用いてPMLAカルシウムを分画します。

最後に、各画分をアンバーライトカラムに通し、ポリマロン酸を介して流出液を直ちに液体窒素で凍結させ、凍結乾燥した後に-20 °Cで保存します。PMLAのカルボキシル基を活性化するには、1 mmolのPMLA-Hを1 mLの無水アセトンに混ぜ、さらに1 mmolずつのN-ヒドロキシコイミダゾールとシクロヘキシルカルボジイミドを2 mLのジメチルホルムアミドに混ぜます。20 °Cで3時間撹拌した後、0.05 mmolのメチルペグアミンを1 mLのDMFに溶かして加え、続いて0.05 mmolのトリエチルアミンを加えます。

次に、0.4 millimolesのleucine ethyl esterを滴下し、1時間後に薄層クロマトグラフィーで負の反応を確認し、反応が完結したかを確認します。同様に、0.1 millimolesのtwo me capto、one ethylamine、および0.5 millimolesのTEAを加えます。残存するNHS esterは、リン酸緩衝生理食塩水による自発的な加水分解によって除去します。

PD 10カラムを用いて脱塩し、凍結乾燥して白色粉末を得ます。このプレコンジュゲートは-20°Cで乾燥状態で保存してください。次に、pH 5.5の150 mM 塩化ナトリウムおよび100 mM リン酸ナトリウム溶液 4.5 mLに、抗体 30 mgを加えます。5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideを用いてジスルフィド結合を還元し、PD 10カラムを用いて精製します。

次に、IDE PEG IDEを、pH 6.3に調整した上記のバッファー2 mLに溶解させます。還元した抗体を加え、20 °Cで1時間撹拌します。30 kDa分画のAVEVA spin 20を用いて2.5 mLまで濃縮し、その後cidex G 75で精製します。

次に、SEC HPLCを用いて生成物を検証します。280 nmにおける吸光度を測定し、他の波長において不純物がないことを確認してください。続いて、pH 6.3のバッファー5 mL中で、プレコンジュゲート50 mgと抗体結合PEG IDE 200 MLEsを混合します。

スルフィドロールの濃度を2 mMに調整し、20 °Cで3時間インキュベートします。98%の収率で可溶化させるため、3'アミノアンチセンスオリゴヌクレオチドを1体積のSPDPと反応させ、メタノールを用いてCidex LH-20でAON-PDPを精製し、次にメタノールを蒸発させ、生成物を水に溶解して凍結乾燥します。次に、活性化させたAON 800 nMを、MEA SHに前共役させた抗体PEGとともに一晩インキュベートします。ジスルフィド交換反応が終了したら、蛍光色素ブロックを組み込み、過剰なスルフィドロールをPDPで処理し、Cidex G-75で精製します。

最終的なポリマレイン酸ベースのナノドラッグは-20°Cで保存してください。製造中のポリマレイン酸含有量を推定するには、以下の手順で操作します。320 µLのサンプルに、10%塩酸ヒドロキシルアミン160 µLおよび10%水酸化ナトリウム160 µLを加えます。10〜15分後、5%塩化第二鉄溶液160 µLを混ぜ合わせ、540 nmで濃紫色の形成を確認します。次に、密閉アンプルを用いて2 M塩酸中で110°Cで一晩ナノドラッグを加水分解し、逆相クロマトグラフィーによりマレイン酸を測定します。

マレイン酸標準品をスパイクしたサンプルを使用します。次に、100 millimolar のジチエトールを用いてナノドラッグを切断し、定量逆相HPLCにより morph antisense oligonucleotides を morpho a ON 標準品に対して測定します。切断したナノドラッグを用いて、タンパク質アッセイキットにより抗体量を測定し、Malik PEG 含量を定量します。

まず、チオシアン酸アンモニウムで反応させ、次にクロロホルムで抽出し、510 nmでの吸光度を測定します。1ウェルあたり5 µLのナノ薬剤と、プレートコーティング抗原として1ウェルあたり0.5 µgのHER2を用い、ELISAによって抗体活性および共ライゲーションを試験します。最後に、マレイン酸に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体の達成率を算出します。

薬物設計で意図したパーセンテージと比較します。このナノ薬物に対する二峰性戦略的アプローチでは、Herceptinを用いてHER2シグナル伝達経路を抑制し、HER2特異的なsiRNAを用いてHER2受容体の転写を遮断します。抗体は腫瘍血管の内皮TFRを介したトランスサイトーシスを促進します。ナノコンジュゲートプラットフォームであるポリマレイン酸（PMLA）は、培養マイクロプラスマによって製造され、精製されました。PMLAのカルボキシ基を活性化させることで、プレコンジュゲート骨格の合成が促進されました。

最後に、リードナノ接合体についてです。Eli SAアッセイにより、ナノ薬物の合成過程を通じて活性モノクローナル抗体が保持されていることが実証されました。両方の抗体を同一のポリマープラットフォーム上に構築することで、蛍光共焦点顕微鏡を用いてナノ薬物の細胞内取り込みを追跡しました。

0時間後と3時間後の重ね合わせ画像を、標識されたエンドソームと共に解析しました。共局在に関するピアソンの相関係数は、ナノドラッグがエンドソームから細胞質へと放出され、細胞質内でグルタチオン依存的なジスルフィド結合の切断によりナノドラッグからONが解離したことを示しています。in vitroにおいて、リードナノドラッグはHER2過剰発現細胞株において最も効果的に増殖を有意に抑制しました。

HER2過剰発現ヒト乳がん細胞株BT 474を移植したマウスを用いたin vivo実験において、Herceptin含有リードナノ薬物により95%以上の増殖抑制が認められました。また、HER2特異的な抗体を用いたex vivo Western blottingにより、HER2の合成とリン酸化の両方が抑制されていることが示されました。さらに、PARPの切断（cleavage）がアポトーシスを示していました。薬物治療に対する腫瘍の退縮は、腫瘍の縮小および組織学的検査による腫瘍細胞の減少によって実証されました。

これにより、生体適合性ナノプラットフォームを用いて、副作用のない効果的な個別化治療を実現する方法、および制御された組成と検証済みの機能活性を持つナノドラッグを作製する方法について、十分な理解が得られたはずです。習得後、これらのセンサーは高い再現性で実施可能です。ポリアクリル酸ナノプラットフォームを用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配送技術は、個別化遺伝子解析によって同定された特定の腫瘍分子マーカーを標的とする腫瘍治療を追求する、個別化ナノ医療分野の研究者に道を開くものです。薬理学的に活性のある薬剤や細胞は、極めて危険である可能性があります。

本手順の実施中は、マスクと手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。