Name: 複数の腫瘍マーカーのターゲットとするためのポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー：個別化医療の機会？ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 学ぶポリリンゴ酸ベースのナノドラッグ合成法。Physarum polycephalumからPMLAを生産し、抗体とアンチセンス分子を導入してHer2陽性乳がんを標的とする個別化医療プラットフォームを構築する革新的ナノ医療アプローチです。

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NIH R01 CA123495、U01 CA151815、R01 CA136841による財政的支援、シダーズ・シダーズ・メディカル・センターの脳神経外科部門およびArrogene Technology Inc.からの助成金に大いに感謝します。

全ての実験は、生体内で行われ、動物実験委員会のプロトコルに完全に従っている外科的および非外科的手順を含む公式の動物の規制に準拠しています。 ポリリンゴ酸の1。バイオプロダクション<ol><li>寒天上の小球から種培養を成長させ、培養器、基礎培養液8,9を述べた熱は25℃を使用した100ミリリットルの培地にマラリア原虫を転送します。 </li><li>胞子形成を避けるために、光を排除したマイクロマラリア原虫重力満載の500ミリリットルの量を生産する。 </li><li> 10 Lバイオリアクター容器内に8リットルの基礎培地に懸濁し80グラムの炭酸カルシウムを準備します。マウントされた反応容器に500ミリリットルパックマイクロマラリア原虫を転送し、25℃で、濾過された空気とセグメントスターラーで150 rpmで攪拌​​を10リットル/分の流量で75時間にわたってバイオプロセスを可能にします。 </li><li>培養液をPMLAの生産の終了を示すpHが4.8である場合に終了とtによってPMLA含量を測定彼/鉄（III）アッセイをヒドロキ。 </li><li> 17℃に培養液を冷却し、細胞が重力によって沈降させる。 </li><li> ℃で4に冷却し、2MのNaOHを使用し、pH7.5に調整してください。 （5℃で20mMトリス塩酸（pH7.5）で平衡化した粗粒DEAEなど）を先頭に、方向底部にDEAE-セルロース1.5 Lを充填したカラムに上清を送り出す。 </li><li>上から下への方向を変更した後、0.3MのNaClを含む緩衝液3列で洗浄し、0.7 MのNaClの存在下でPMLAを溶出。 </li><li> 0.1Mの塩化カルシウムに調整し、80％の氷冷エタノールでPMLA -カルシウムを沈殿させる。 300 kDaの、50 - - 80のPMLA - カルシウムにデックスG25上分画80kDaの、そして10から50 kDaの、バッファー、塩がない状態で水を使用しています。 </li><li>アンバーライトIR 120H +カラムに各画分を渡し、すぐにフロースルーポリリンゴ酸、液体窒素中で凍結乾燥のために凍結する。 </li><li>乾燥アセトンに溶解する。濾過後、溶媒を除去マイナス20℃の乾燥空気流中、凍結乾燥および保存</li></ol> 2。ポリリンゴ酸ベースのナノ薬物の合成<ol><li>無水アセトン1ミリリットルと2ミリリットルのジメチルホルムアミド（DMF）中の1ミリモル、N-ヒドロキシスクシンと1ミリモルジシクロヘキシルカルボジイミド中のPMLA-Hの116（1ミリモルマリル単位）を混合することにより、PMLA（P）のカルボキシル基を活性化。 3時間20℃で撹拌する。 0.05ミリモルのトリエチルアミン（TEA）に続いて1ミリリットルのDMFにおけるMPEG 5000-NH 2（マリル単位0.05モル％）の0.05ミリモルを追加します。 </li><li> 、賢明DMF 0.4ミリモルロイシンエチルエステル（LOEt）（マリル単位の40モル％）、0.1ミリモルの2 - チオール-1 - エチルアミン（2-MEA）（マリル単位の10モル％）および0.5ミリモルTEAに溶解降下を追加するすべてのDMFに溶解した。各添加後、1時間を許可し、否定的なニンヒドリン反応（薄層クロマトグラフィー、TLC）により反応の完了を確認してください。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（30分間、pH6.8）中で自発的な加水分解によって残りのNHS-エステルを除去しない。 PD上で脱塩-10列、凍結乾燥により白色粉末として「preconjugate」を得る。マイナス20℃で保存し、乾燥</li><li> 100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH5.5で4.5mlの30 mgの抗体（mAbでのIgG2a-κ）を溶解する。 </li><li> 5mMのトリス（2 - カルボキシエチル）、20℃で30分間ホスフィン塩酸塩とジスルフィド結合を還元し、PD-10カラムで精製する。 </li><li>同緩衝液2mlにMAL-PEG 3400-MALを溶解し、10ミリリットルの最終容量で減少モノクローナル抗体を追加し、4℃で一晩撹拌するビバスピン20除外30 kDの上で2.5ミリリットルに濃縮し、セファデックスG75上浄化する。 SEC-HPLC上で製品を確認して、測光法280 nmの波長で量を測定する。 </li><li> MAL-PEG-MAL-モノクローナル抗体を接続するには「preconjugate「P / PEG 5000（5％）/ LOEt（40％）/モノクローナル抗体（0.2％）/ 2-MEA（10％）を得たチオール。上記緩衝液pH5.5中で（P / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA）50 mgの200ナノモルモノクローナル抗体-PEG 3400-MALの5ミリリットルを混合することによってこれを行うsulfhyの濃度を調整2 mMまでDRYLと3時間（98％）を得、20℃でインキュベートする。 </li><li> DMF / PBS（pH7.2）中、3&#39;-H 2 N-AONを可溶化し、ニンヒドリン試験（（1:1 v / v）のDMF /メタノール中でN-スクシンイミジル-3 - （2 -ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）と反応）、次いで水および凍結乾燥で、メタノール中のセファデックスLH20にわたってAON-PDPを精製する。 </li><li>ジスルフィド交換反応が終了するまで一晩上記で調製したMAL-PEG 3400-MAL-モノクローナル抗体-preconjugateで5.5 pH緩衝800ナノモルのアクティブ化のAONをインキュベートする。 </li><li> 680-マレイミドポリマー-2-MEA-SHとチオエーテル構成する蛍光アレクサフルーアが組み込まれています。 3 - ピリジルジチオ - プロピオネート（PDP）と過剰スルフヒドリルをブロックし、セファデックスG75上で浄化する。 4℃で保存するかは、使用するまで-80℃で凍結した。 </li></ol> 3。アッセイおよびプロパティ<ol><li> SEC-HPLC分析によって4℃、37℃、純度と安定性PBS中および血清中のテストを実行します。 molecとしてポリスチレンスルホン酸を使用して、ウラル量標準。ナノサイズ分布とゼータ電位を測定する。商用システムを使用してください。 </li><li> 320μlのサンプルに10％の160μlの（w / v）の塩化ヒドロキシルアンモニウムと10％の160μlのNaOH水溶液（w / vの）を追加する。 10-15分後、（w / v）の鉄（III）Clで3〜12％において5％の160μlの混合（v / v）のHClおよびヒドロキサ/ Feが540を読み取る（III）。 PMLAは1 mg / mlのPMLAは2.5 540に対応していると仮定して計算します。 </li><li> 110℃で2 M HCl中で一晩ナノ薬物を加水分解し、サンプルを参照して、逆相クロマトグラフィーでの分析リンゴ酸はリンゴ酸標準でスパイクした。 100 mMジチオスレイトールとナノ薬剤を切断し、モルホリノAON標準に対する定量的な逆相HPLCによるモルホリノAONを測定します。 </li><li>切断せずにナノ薬物を取り、タンパク質アッセイキットを用いて抗体を測定する。アンモニウムferrothiocyanateとの反応を可能にすることにより、ペグを定量化し、クロロホルムで抽出し、510 nmの波長の10の吸光度を読む</SUP&gt;。 </li><li>よく抗体活動とcolligationをテストごとのナノ薬物を5μL（1月10日100μgのモノクローナル抗体）を用いたELISAを実行します。プレートコーティングされた抗原およびペルオキシダーゼ結合二次抗体として、それぞれ、0.5μgの/ウェルトランスフェリン受容体とHER2を使用してください。 </li><li> （例を表1と表2を参照）、リンゴ酸（100％）に関してのAON、MPEGやモノクローナル抗体で達成％を計算し、設計者が意図％と比較します。 </li></ol> 4。in vitro試験 <ol><li> 3 [イエロー試薬を低減するために、それらの活性によって経時的に生存細胞培養癌細胞及びナノ尺度で薬物をインキュベートする - （4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-5 - （3 - カルボキシメトキシフェニル）-2 - （4 - スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム、内塩]（MTS）の青色染料にし、光度計で相対吸光度を読む。キットの供給者が指示に従ってください。 </li><li>ウェスタンブロッティングのためのin vitroまたはex vivoでの細胞抽出物を準備します。氷のように冷たい抽出Bを使用SDSおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルが含まれていuffer。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を減少させることによって別々のタンパク質。 </li><li>サンプル抽出物中の目的のタンパク質のウェスタンブロッティングを行います。アルカリホスファターゼに結合させた二次抗体を使用してください。 </li><li>蛍光標識を用いて細胞取り込みおよびナノ薬剤ポリマープラットフォーム、AONおよびエンドソームの共局在を実証するために、共焦点顕微鏡を使用する。蛍光標識としてのAONはにナノ複合体プラットフォームにアレクサフルーア680を取り付け、リサミン。標識分子の分布を可視化するために顕微鏡5Xスペクトルスキャナ、生癌細胞を使用</li><li>染色エンドソームスチレッド蛍光色素を有する膜とは、エンドソームの共局在やリリースを示しています。 </li></ol> 5。in vivo試験 <ol><li>ヒトHER2陽性乳癌のマウスモデルを準備します（ヌードマウスタック：クロム：（MCR） - Foxnnm）。ペレットをリリース0.72 mgの17β-エストラジオールを挿入します（90日リリース）Subcutaneously各マウスの首の。 </li><li>その後、皮下に右脇腹に1×10 7のBT-474腫瘍細胞を注入し、腫瘍が成長してみましょう。 </li><li>腫瘍が尾静脈に2.5ミリグラムを含有する150μlのナノ複合体を注入することによってサイズ120 mm 3であるときに治療を開始/ AONおよび/ ​​または4.5mgの各抗体/ kgの範囲であり得る。治療のために、1週間に2回、完全に6回注入する。 </li><li>二度の弱いノギスで腫瘍の大きさを測定し、式（長さ×奥行×幅）×（π/ 6）を使用して、ボリュームを計算します。 2週間最後の注射後に頸椎脱臼に続いケタミンとデクスメデトミジンの溶液で鎮静した後に動物を安楽死させる。 </li><li>形態学的評価のために、H＆Eで腫瘍やシミ部分を分離します。 </li><li>動物のスケールでの薬剤の分布を評価するため、蛍光画像化システムを使用する。 24および48時間後にアレクサフルーア680ラベルナノ薬物および画像を注入する。 </li><li>動物を安楽死させるとフッ素を検出孤立して灌流した腫瘍や臓器にescence。 </li></ol>

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著者ジュリアY. Ljubimova、キース·L·ブラック、EggehardホラーはArrogeneテクノロジー株式会社の株主である

生分解性天然ポリマーからのナノ薬物の製造のための実験的経路は、個別化医療の合成に使用することが提示される。説明は、ナノ薬物を合成するための汎用的なプラットフォームですポリリンゴ酸の制御された生産および精製から始まります。再現可能な技術を用いて、ポリマーは、高分子量でおよび医薬の合成に適した極端な純度で得られる。合成は、効率的にHER2陽性乳癌を治療するために示されているナノ薬物に記載されている。説明は、癌の治療のための他のほとんどのナノ薬物の合成に変換することができる。標的化は、例えば、HER2タンパク質または効率的に内在化される任意の他の腫瘍マーカーとして腫瘍特異的抗原に結合する、例えばハーセプチンなどの抗体を含む。ナノ薬物を効率よくトレ下で癌の増殖を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび化学療法剤の選択を提供しatment。この例では、HER2-コーディングmRNAとHER2と特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのアニーリングに結合ハーセプチンは、HER2シグナル伝達とHER2陽性乳癌の深刻な減少の持続的阻止をもたらした。我々は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる腫瘍標的化および遺伝子発現の阻害の基礎となる原理に基づいて最新のは、いくつかの他のナノ薬物および正常ヒト神経膠芽腫阻害し、前臨床およびトリプルネガティブ乳がん11,14-18を合成した。 合成作業はモジホコリカビ （「粘菌」科の種）の培養上清よりポリリンゴ酸、高度に精製されたナノ薬物プラットフォームの準備を開始します。調製物は、多数の抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび活性薬物送達および腫瘍増殖阻害で機能する他の分子の結合を可能にする原則として、ポリマーの高い分子量を強調する。 Followi制御された培養および精製ngの、予測可能な収率でポリマーの再現性の品質が製造されている。ポリマーは、任意の時間のための便利な条件下で保存されている。 ポリマーのペンダントカルボキシレートの化学的活性始まるPMLAナノ複合体の合成は、いくつかの合成工程で行われる。ステップ間では、合成中間体は、必要に応じて任意の量の調製を可能にする保留にすることができるので、スケーリングをアップで使用することができる。合成の進行をTLCおよびsec​​-HPLCに続いて、ナノ薬剤の組成および活性の両方がグループ固有の定量的な化学的アッセイ、ELISA、および種々の物理的測定によって制御される。我々の経験は、これらの合成は、優れた収率と純度でスムーズかつ再現進行されてきたということです。 PEで必要に応じて、抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を選択することにより、ナノ薬剤の任意の変異体を良好に合成され、薬をrsonalized。 ヒトHER2陽性乳癌の治療成功の様式は、マウス癌モデルの製造、ナノ薬、イメージング、腫瘍増殖の分析の適用のための有効な代表例である。 インビトロでの生存試験の結果は、細胞株および動物実験で使用されるリーディング薬を選択する上で有用である。 インビボゼノジェンイメージングは、ナノ薬物が実際に腫瘍に送達されることを検証する。ウエスタンブロッティングの結果は、特定のタンパク質のレベルは、がん治療中の予測方法で答えたかどうかを明らかにする。腫瘍の大きさの測定が阻害、不況や回帰について、 すなわち 、治療の成功について通知します。上記の例では予測可能性、再現性と顕著な毒性がないの高い度合いを示す他のポリリンゴ酸系ナノ薬剤との我々の経験を反映している。複数のTの毒性と有効性に関する最近の結果トリプルネガティブ乳がん治療のためargetedポリリンゴ酸抱合体は、この概念18の強力なサポートである。腫瘍間質へ向かう血管外への浸潤による内皮バリアー、エンドソームの取り込みによる腫瘍細胞膜、およびロイシンエチルエステルまたはトリロイシングループの作用によりエンドソーム膜破壊：主な特徴は、私たちのナノ薬剤がバイオ障壁を浸透することができるということです。血管外漏出とエンドソームの取り込みを確実にナノ薬に​​添付特異的抗体によって達成される。抗マウストランスフェリン受容体抗体は、受容体は、ほとんどの腫瘍血管に過剰発現しているためか、トランスサイトーシスにより、腫瘍への効率的な流入を仲介する。異なる抗体は、レシピエントの腫瘍細胞にナノ薬物を導くのと同じナノコンジュゲート分子機能に取り付けられている。両方の抗体の存在は、トランスサイトーシス用とエンドソーム取り込みのための他の一方は、最適な機能に必須である。 Mの定量分析ALIC酸および抗体は、高度にナノ薬剤の最適な組成を制御するために推奨されます。最後に、オールインワンの共有結合ナノ薬物は、レシピエントの腫瘍細胞への宿主の血管系を通って途中で化学的に結合形で薬物を送達することに留意すべきである。これらは標的部位でのナノコンジュプラットフォームから切断により遊離の薬剤として再構成されるまで、化学結合は、非アクティブ最も薬（プロドラッグ）をレンダリングします。再活性化モダリティが配信と有害な副作用を呼び起こすために、最小限のチャンス時の安全性の高いを提供するので、これは重要です。汎用性、有効性と安全性が良いオーダーメイド医療に欠かせない属性です。

癌のゲノムは（ バイオテクノロジーとがんゲノムアトラスのためのナショナルセンターを ）解明されてきたポストゲノム時代では、がんの今後の治療は、多くの場合、同じ腫瘍1-4内の腫瘍の遺伝的多様性を占めることになる。バイオインフォマティクスと、高速ではない高価なDNA配列決定は、個人的なレベル2,4,5に悪性の遺伝子/変異の取得を可能にする。遺伝子が同定されたら、患者は、悪性の6遺伝子の発現を改変またはサイレンシングする個人化された薬で治療される。癌細胞を標的とし、これらの細胞に薬剤を送達する必要性は、多官能性送達システムを必要とする。明らかに、ナノ薬物は、この要件を満たすことができる7。 発見ナノ粒子のサージング波では、癌細胞に化学療法薬、タンパク質および/または遺伝子的に活性な物質のペイロードをもたらすために好適であることが分かっている。しかし、副作用が広告であることが残っている服を着て。生分解性の欠如に関連し、それらの一つは、疾患を誘発する可能性と健康な組織および器官における材料の堆積を引き起こすことがある。堆積を最小限にするために、我々は、非毒性であり、微生物起源とH 2 OとCO 2から8個 、生分解性であり、非免疫原性ポリリンゴ酸を導入した。私たちは、ナノ薬剤のオールインワンの共有結合の種類を合成するためにポリマーを使用しています。このようなテモゾロミド、ドキソルビシン、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび溢出、組織ターゲティング、エンドソーム溶解配信サービスを提供する官能基として化学的に結合化学療法剤が含まれています。それらは、標的腫瘍細胞に到着したときの薬物は本質的に、それによってそれらの完全な薬学的活性を再生する、ナノプラットフォームから切断される。 我々は、ポリマーナノプラットフォームの微生物生産する方法であって、その精製、および癌のためのトラスツズマブ（ハーセプチン）を含むナノ薬物の化学合成を記載ターゲティングおよびHER2過剰産生を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。ヌードマウスに異種ヒトのHer2陽性乳癌にナノ薬物を適用することにおいて、我々は、癌治療の高い有効性を示す。ポリリンゴ酸ナノ薬物のためにここに導入腫瘍標的化および遺伝子サイレンシングの原理は、他​​の癌症例の治療に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプト-1-エチルアミン(システアミン; 2MEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30078-25G</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>90-Day release 17&beta;-estradiol pellet&nbsp;</td><td>アメリカの</td><td></td><td></td>革新的な研究</tr><tr><td>アレクサ フルーア 680 C2 マレイミド</td><td>Invitrogen</td><td>A20344</td><td></td></tr><tr><td>アンバーライト IR 120H</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>6428</td><td></td></tr><tr><td>アンチフォーム Y-30 エマルジョン</td><td>シガム・アルドリッチ</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>アンチラミニン-411 鎖 モノクロー</td>ゼット <td>サンタクルーズ</td><td>SC-59980</td><td></td></tr><tr><td>アンチpAkt モノクローナル抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9271S</td><td></td></tr><tr><td>抗PARB mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>556494</td><td></td></tr><tr><td>抗von Willebrand因子抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>Bacto, Dickinson/Sparks, MD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>β-actin</td><td>Cell Signalling</td><td>3700</td><td></td></tr><tr><td>BT-474&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-20</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>Alfa Aesar</td><td>36337</td><td></td></tr><tr><td>細胞増殖アッセイキット</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>PR-G3580</td><td></td></tr><tr><td>Centriplus 100&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>4414</td><td></td></tr><tr><td>ジシクロヘキシルカルボジミド</td><td>フルーカ</td><td>36650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>カーディナルヘルス</td><td>S7439-4</td><td></td></tr><tr><td>ガラルジン (MMP阻害剤)&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-994</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>細胞シグナル伝達&nbsp;</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-3</td><td></td></tr><tr><td>豚由来のヘミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>ハーセプチン</td><td>Genentech</td><td>15534</td><td></td></tr><tr><td>ハーセプチン (ウェスタンブロッティング)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2165S</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a-κ マウス悪性腫</td><td>Sigma</td><td>M77695X5m</td><td></td></tr><tr><td>免疫スターAP基板パック</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>Immun-StarTM AP 基板パック&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>LAL試薬水&nbsp;</td><td>Lonza,</td><td>MD W50-1000</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-411 mAbs</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leucine ethyl ester (LOEt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61850-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests</td><td>Cambrex BioScience</td><td>N384</td><td></td></tr><tr><td>Lissamin-Morpholino AON</td><td>Gene Tools</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>L-リンゴ酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>リンゴ酸デヒドロゲナーゼ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2634</td><td></td></tr><tr><td>Mal-PEG-Mal</td><td>Laysan</td><td>mal-PEG-mal-3400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>牛乳、無脂肪粉末&nbsp;</td><td>プロテオミクス</td><td>M203-10G</td><td></td></tr><tr><td>モルフォリノオリゴヌクレオチド&nbsp;</td><td>GeneTools</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>mPEG5000</td><td>Lysan</td><td>mPEG-NH2-5000</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスクシニムド (NHS)&nbsp;</td><td>ACROS Organics</td><td>15727100</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Merck</td><td>1.06762.0100</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース メンブレン フィルター ペーパー サンドイッチ</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース メンブレン フィルター ペーパー サンドイッチ, 0.45 & micro;m&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Novex &reg;Tris-Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>ヌードマウス [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]&nbsp;</td><td>Taconic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 10x</td><td>Gibco</td><td>10010-49</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 1x</td><td>Gibco</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851</td><td></td></tr><tr><td>Physarum polycephalum M3CVII</td><td>ATCC</td><td>204388</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA protein assay&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Roche</td><td>1.18362E+11</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質検出器 ELISA キット</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0031</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0050</td><td></td></tr><tr><td>セファデックス-LH20&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0090</td><td></td></tr><tr><td>SKBR-3&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SPDP</td><td>タンパク質化学&nbsp;</td><td>C1116</td><td></td></tr><tr><td>Streamline-DEAE</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0994</td><td></td></tr><tr><td>Styryl Red FM 1-43&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>T-3163</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>TLC, シリカコーティングアルミシート</td><td>Merck, Darmstadt, DE</td><td>60F254</td><td></td></tr><tr><td>Trileucine (LLL)</td><td>Bachem</td><td>H-3915</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>X114</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン&reg;20&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>ビバスピン 20&nbsp;</td><td>VWR</td><td>14005-302</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ベクターラボラトリーズ、カリフォルニア州</td><td></td><td></td>バーリンゲーム</tr><tr><td>デクスメデトミジン</td><td>ファイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アチパメゾール</td><td>ファイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルプロフェン</td><td>ファイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>フォスター アンド スミス、ウィスコンシン州</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

複数の腫瘍マーカーのターゲットとするためのポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー：個別化医療の機会？

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

分子プロファイリングのばらつきにより、同じ治療に対して異なる反応を示すことがよくあります。この多様性を説明するために、悪性腫瘍関連遺伝子をサイレンシングするための個別化医療が開発されています。ナノ医薬品は、腫瘍を標的とし、遺伝子のサイレンシングのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達することにより、これらのニーズに適合します。治療薬は繰り返し投与されることが多いため、毒性がなく、免疫応答が無視できることが望ましいです。ここで紹介する例では、生分解性で毒性がなく免疫原性のないプラットフォームであるポリマリン酸から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと腫瘍標的分子の制御された化学ライゲーションにより、ナノメディシンを合成しています。この合成と治療は、実験マウスモデルを使用してヒトHer2陽性乳がんに例示されています。この症例は、他の腫瘍の合成と治療に向けて変換できます。

ポリリンゴ酸に基づくナノ薬剤の例は、がんに適用可能な個別化医療の合理的な設計に向けて提示されている。これは、ヌードマウスでのHer2陽性ヒト乳癌を治療するために、ナノ薬物の合成を記載する。

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

全体的な目標は、個人の疾患、特にがんの遺伝的構成に基づいた個別化医療を合成するための汎用プロトコルが利用可能なナノスケールプラットフォームを構築することである。まず、微生物のfrum polycephalumからポリマロン酸（PMLA）を製造し精製する。精製したPMLAの側鎖にあるカルボキシ基を化学的に活性化させ、活性化基の置換によって小さな官能基とリンカーであるMEAを結合させ、未使用の活性化基は加水分解によりカルボキシ基に戻す。次に、スペーサーであるMEAおよびキャップのスルフィドヒドロ基を介して、抗体とアンチセンス分子を添加します。反応完了後、PDPを用いて未使用のスペーサーを確認し、リードの組成と機能をテストします。ナノドラッグの結果は、攻撃的なヒトがんを担有するマウスなどの動物モデルから得られます。HER2陽性の乳がんは、治療の有効性だけでなく、治療に望ましくない副作用が伴わないかどうかも判断することができます。開環重合のような既存の合成法に対するバイオ生産の主な利点は、バイオポリマーが完全な光学純度を保持し、副産物による汚染がないことです。このPolyPhenナノドラッグファミリーは、特定のターゲットに基づいたあらゆる細胞型を標的とすることができ、タンパク質発現を調節することが可能です。一般的に、PHEナノ薬物によるがん治療は、原発性脳腫瘍および乳がんを含むいくつかの動物モデルにおいて非常に効率的です。我々は最初、この手法を用いてグリオブラストーマ特異的なラミンのisof形態の合成を阻害するというアイデアを得て、その後、HER2およびトリプルネガティブ乳がんタンパク質の標的化と抑制によって腫瘍の増殖を防ぐことを証明しました。この技術の応用範囲は、光学および磁気共鳴イメージングを用いたがんの診断にまで及びます。ポリナノドラッグは、がん治療のための薬物送達に関する知見を提供します。また、感染症、疼痛緩和、神経疾患などの他の病理学的状態にも適用可能です。らせん状のオーガーから種原虫培養物を育成した後、100 millilitersの基礎培地を接種し、25 degrees Celsiusで培養します。恒温インキュベーターを用いて、遮光条件下で重力充填されたマイクロプラズマ培地を作製します。10リットルのバイオリアクター容器内での芽胞形成を避けるため、8リットルの基礎培地に80グラムの炭酸カルシウムを溶解させ、その後、充填したマイクロプラズマ培地を設置済みの反応容器に移し、バイオプロセスを75時間に設定します。温度は25 °C、ろ過空気の流量は10 L/min、セグメント攪拌による攪拌速度は150 RPMとします。培養液のpHが4.8に達したら、培養を停止してポリマレイン酸の生成量を測定します。次に、培養液を17 °Cまで冷却し、細胞を重力で沈降させた後、リアクターから培養上清を除去します。pHを7.5に調整します。次に、5 °Cで20 mM tris hydrochloride pH 7.5で平衡化した1.5 LのDEAEセルロースカラムの下端から上端に向かって上清をポンプで注入します。その後、0.3 M sodium chlorideを含む洗浄バッファーをカラム量3倍分、下端から上端へと通液し、0.7 M sodium chlorideを用いてPMLAを溶出させます。溶出されたPMLA分画を0.1 M calcium chlorideに調整し、氷冷80% ethanolを加えてPMLAカルシウムを沈殿させます。続いて、Sephadex G 25と水を用いてPMLAカルシウムを分画します。最後に、各画分をアンバーライトカラムに通し、ポリマロン酸を介して流出液を直ちに液体窒素で凍結させ、凍結乾燥した後に-20 °Cで保存します。PMLAのカルボキシル基を活性化するには、1 mmolのPMLA-Hを1 mLの無水アセトンに混ぜ、さらに1 mmolずつのN-ヒドロキシコイミダゾールとシクロヘキシルカルボジイミドを2 mLのジメチルホルムアミドに混ぜます。20 °Cで3時間撹拌した後、0.05 mmolのメチルペグアミンを1 mLのDMFに溶かして加え、続いて0.05 mmolのトリエチルアミンを加えます。次に、0.4 millimolesのleucine ethyl esterを滴下し、1時間後に薄層クロマトグラフィーで負の反応を確認し、反応が完結したかを確認します。同様に、0.1 millimolesのtwo me capto、one ethylamine、および0.5 millimolesのTEAを加えます。残存するNHS esterは、リン酸緩衝生理食塩水による自発的な加水分解によって除去します。PD 10カラムを用いて脱塩し、凍結乾燥して白色粉末を得ます。このプレコンジュゲートは-20°Cで乾燥状態で保存してください。次に、pH 5.5の150 mM 塩化ナトリウムおよび100 mM リン酸ナトリウム溶液 4.5 mLに、抗体 30 mgを加えます。5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideを用いてジスルフィド結合を還元し、PD 10カラムを用いて精製します。次に、IDE PEG IDEを、pH 6.3に調整した上記のバッファー2 mLに溶解させます。還元した抗体を加え、20 °Cで1時間撹拌します。30 kDa分画のAVEVA spin 20を用いて2.5 mLまで濃縮し、その後cidex G 75で精製します。次に、SEC HPLCを用いて生成物を検証します。280 nmにおける吸光度を測定し、他の波長において不純物がないことを確認してください。続いて、pH 6.3のバッファー5 mL中で、プレコンジュゲート50 mgと抗体結合PEG IDE 200 MLEsを混合します。スルフィドロールの濃度を2 mMに調整し、20 °Cで3時間インキュベートします。98%の収率で可溶化させるため、3'アミノアンチセンスオリゴヌクレオチドを1体積のSPDPと反応させ、メタノールを用いてCidex LH-20でAON-PDPを精製し、次にメタノールを蒸発させ、生成物を水に溶解して凍結乾燥します。次に、活性化させたAON 800 nMを、MEA SHに前共役させた抗体PEGとともに一晩インキュベートします。ジスルフィド交換反応が終了したら、蛍光色素ブロックを組み込み、過剰なスルフィドロールをPDPで処理し、Cidex G-75で精製します。最終的なポリマレイン酸ベースのナノドラッグは-20°Cで保存してください。製造中のポリマレイン酸含有量を推定するには、以下の手順で操作します。320 µLのサンプルに、10%塩酸ヒドロキシルアミン160 µLおよび10%水酸化ナトリウム160 µLを加えます。10〜15分後、5%塩化第二鉄溶液160 µLを混ぜ合わせ、540 nmで濃紫色の形成を確認します。次に、密閉アンプルを用いて2 M塩酸中で110°Cで一晩ナノドラッグを加水分解し、逆相クロマトグラフィーによりマレイン酸を測定します。マレイン酸標準品をスパイクしたサンプルを使用します。次に、100 millimolar のジチエトールを用いてナノドラッグを切断し、定量逆相HPLCにより morph antisense oligonucleotides を morpho a ON 標準品に対して測定します。切断したナノドラッグを用いて、タンパク質アッセイキットにより抗体量を測定し、Malik PEG 含量を定量します。まず、チオシアン酸アンモニウムで反応させ、次にクロロホルムで抽出し、510 nmでの吸光度を測定します。1ウェルあたり5 µLのナノ薬剤と、プレートコーティング抗原として1ウェルあたり0.5 µgのHER2を用い、ELISAによって抗体活性および共ライゲーションを試験します。最後に、マレイン酸に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体の達成率を算出します。薬物設計で意図したパーセンテージと比較します。このナノ薬物に対する二峰性戦略的アプローチでは、Herceptinを用いてHER2シグナル伝達経路を抑制し、HER2特異的なsiRNAを用いてHER2受容体の転写を遮断します。抗体は腫瘍血管の内皮TFRを介したトランスサイトーシスを促進します。ナノコンジュゲートプラットフォームであるポリマレイン酸（PMLA）は、培養マイクロプラスマによって製造され、精製されました。PMLAのカルボキシ基を活性化させることで、プレコンジュゲート骨格の合成が促進されました。最後に、リードナノ接合体についてです。Eli SAアッセイにより、ナノ薬物の合成過程を通じて活性モノクローナル抗体が保持されていることが実証されました。両方の抗体を同一のポリマープラットフォーム上に構築することで、蛍光共焦点顕微鏡を用いてナノ薬物の細胞内取り込みを追跡しました。0時間後と3時間後の重ね合わせ画像を、標識されたエンドソームと共に解析しました。共局在に関するピアソンの相関係数は、ナノドラッグがエンドソームから細胞質へと放出され、細胞質内でグルタチオン依存的なジスルフィド結合の切断によりナノドラッグからONが解離したことを示しています。in vitroにおいて、リードナノドラッグはHER2過剰発現細胞株において最も効果的に増殖を有意に抑制しました。HER2過剰発現ヒト乳がん細胞株BT 474を移植したマウスを用いたin vivo実験において、Herceptin含有リードナノ薬物により95%以上の増殖抑制が認められました。また、HER2特異的な抗体を用いたex vivo Western blottingにより、HER2の合成とリン酸化の両方が抑制されていることが示されました。さらに、PARPの切断（cleavage）がアポトーシスを示していました。薬物治療に対する腫瘍の退縮は、腫瘍の縮小および組織学的検査による腫瘍細胞の減少によって実証されました。これにより、生体適合性ナノプラットフォームを用いて、副作用のない効果的な個別化治療を実現する方法、および制御された組成と検証済みの機能活性を持つナノドラッグを作製する方法について、十分な理解が得られたはずです。習得後、これらのセンサーは高い再現性で実施可能です。ポリアクリル酸ナノプラットフォームを用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配送技術は、個別化遺伝子解析によって同定された特定の腫瘍分子マーカーを標的とする腫瘍治療を追求する、個別化ナノ医療分野の研究者に道を開くものです。薬理学的に活性のある薬剤や細胞は、極めて危険である可能性があります。本手順の実施中は、マスクと手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

マウス前立腺癌モデルにおける腫瘍間質内の凝固した血漿タンパク質に特異的な小ペプチド標的化MRI造影剤を用いてMR癌の分子イメージングを実証した。...

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

ここでは、強力な磁気モーメントと強い近赤外（NIR）吸光度磁気プラズモニックナノ粒子の合成のためのプロトコルを記述します。このプロトコルはまた、分子特異的な標的化を必要とするさまざまな生物医学アプリケーションのためのFc部分を介してナノ粒子への抗体結合が含まれています。...

Immunotargeted磁気プラズモニックナノクラスターの合成

このプロトコルの目標は、両親媒性ブロック共重合体で構成されるミセル薬物送達システムにおける物理的に閉じ込められた難水溶性薬物の調製と特性評価を記述することです。...

調製とキャラクタリゼーション個々のとマルチ薬ロード物理的に捕捉さ高分子ミセル

本研究では、可逆添加断片化鎖伝達(RAFT)法を介したメチオニン機能性生体適合性共重合体(mBG)の調製を提示する。得られたmBGとそのトランスフェクション効率のプラスミドDNA複合能も調べられた。RAFT法は、特殊な官能基を含むモノマーを重合するために非常に有益である。...

標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin...

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

この研究では、特定の細胞を標的とする抗体を用いて磁性ナノ材料を生体機能化するためのプロトコルを提供します。その一例として、鉄ナノワイヤを用いてがん細胞を標的としています。...

磁性ナノ材料の生体機能化

抗がんアプタマー開発に必要なステップは、標的への結合をテストすることです。この結合を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを実証し、ネガティブコントロールのアプタマーとその特定のタンパク質に対して陽性または陰性の癌細胞を含めることの重要性を強調しています。...

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。...

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

この記事は、GC-MSによる検出のために、糖鎖をそれらの構成結合特異的単糖類に化学的に分解することにより、未分画生体流体中の糖鎖のプール組成プロファイルを分析するように設計された新しいボトムアップグライコミクス技術の強化形を提示します。潜在的なアプリケーションには、がんやその他の糖鎖影響性疾患の早期発見が含まれます。...

糖鎖ノード分析：グライコミクスへのボトムアップアプローチ

安定性の高い木質繊維ベースの毛状ナノ粒子と機能性セルロースベースの生体高分子を調製するための合成スキームが詳細に説明されています。...

高安定、機能毛深いナノ粒子と木材繊維からバイオポリマー：持続可能なナノテクノロジーに向けて

学ぶポリリンゴ酸ベースのナノドラッグ合成法。Physarum polycephalumからPMLAを生産し、抗体とアンチセンス分子を導入してHer2陽性乳がんを標的とする個別化医療プラットフォームを構築する革新的ナノ医療アプローチです。

複数の腫瘍マーカーのターゲットとするためのポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー：個別化医療の機会？

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