Name: RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: 学ぶ 蛍光マイクロプレートアッセイを用いてRBL-2H3マスト細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの阻害効果を評価する方法。有機溶剤を使用せずにベータヘキソサミニダーゼの遊離を定量化し、アレルギー応答への影響を解明します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LMWとRHKは生物医学科学と工学（GSBSE）のUMaine大学院によってサポートされています; RHKもメイン農業＆森林試験場によってサポートされていました。追加資金は、一般医科学研究所（NIH P20-GM103423）、メイン州農業＆フォレスト実験ステーション（グラント番号ME08004-10、JAG）、メインADVANCEライジングタイドセンター（NSFグラント＃1008498）大学によって提供されました、とPhRMAの基礎（JAG）から薬理/毒性の研究スターターグラント。私たちは、博士に感謝します。抗原およびセルのデイビッドHolowkaとバーバラベアード。我々は、機器と注文のヘルプのためのひなハシミ、アレハンドロベレス、とアンドリューAbovianに感謝しています。これは、メイン州農業＆森林試験場公開番号3311です。

我々は、開示することは何もありません。

2004年に、Naal ら は、脱顆粒1の高スループット試験のため、肥満細胞バイオセンサーを開発した。それは私達が私達のTCS研究のために適応され、このビデオで詳述していることを堅牢アッセイである。前にNaal ら 1アッセイ、マスト細胞の脱顆粒が日常β-ヘキソサミニダーゼ59-61によって評価が、これらの初期の方法は、一つのサンプルを一度に読み込みされた蛍光光度計を利用した。されていた重要なのは、Naal ら 。マイクロプレートリーダーおよびサンプルは蛍光光度計の1つずつを読んでされた以前の方法を利用してそれらのよりハイスループットな方法との間の直接的な一致を確立した。要するに、Naal ら 1が大幅同様にワークフローにいくつかの変更を組み込むことにより、ハイスループットマイクロプラットフォームにそれを適応させることでスピード、パワー、シンプルさ、および検定の信頼性を向上させた。ここでは、ここでさらに、具体的には、様々なテストの化学物質の研究のために、このアッセイを適応している、ユビキタス薬TC...

マスト細胞は喘息、アレルギー、寄生虫防衛および発癌13-16で重要なメディエーターとして機能性の高い造粒免疫エフェクター細胞である。彼らは、脱顆粒するために活性化されるまで、彼らは無事に質顆粒にアレルギー性および炎症性メディエーターを保管ほぼすべての血管組織15に存在します。脱顆粒は、そのようなヒスタミン、トリプターゼ、およびロイコトリエン15と薬理学的に活性なメディエーターの放出をもたらす膜結合顆粒のエキソサイトーシスである。寄生虫に対する防御だけでなく、アレルギー性喘息、および発がん応答15を開始することをマウントする上で重要であるI型過敏性反応の開始でこのプロセスは結果。 肥満細胞および好塩基球は、FcεRIを受容体、免疫グロブリンE（IgE抗体）17のための高親和性受容体を発現する。アレルゲンまたは抗原への曝露は、複数のIgE結合したFcεRIを受容体17の凝集を引き起こし、それがこのsであるチロシンリン酸化事象のカスケード、ホスホリパーゼC、内部貯蔵からのカルシウムの流出、およびセル18へのカルシウムの流入の活性化：脱顆粒プロセスを開始したIgEに結合したFcレセプターの&quot;架橋&quot; O-と呼ばれる。このカルシウム流入は、脱顆粒のために必要であり、さらに、顆粒のエキソサイトーシス15を起こす前に、膜と顆粒の融合を通知します。実験的に、カルシウムイオノフォアを直接本質的にすべてのシグナル伝達は、上流または下流のものとして毒物による経路標的の同定を可能にする、カルシウム流入工程20の前にステップ迂回細胞膜19を横切って往復カルシウムを使用することができカルシウム20に信号を送る 。 脱顆粒は、ヒスタミン6一緒に顆粒から直線的に放出される細胞上清の中にβ-ヘキソサミニダーゼの放出を監視することにより、迅速かつ効果的に測定された、しかし、私ができるシンプルな酵素 - 基質反応およびアッセイ蛍光生成物をするマイクロプレートリーダーを用いて検出するのははるかに簡単。このマイクロプレートアッセイ、プロトコル·セクションに詳述したように、最初にNaal らによって開発された堅牢な方法に基づいている。1で4 -メチル-N-アセチル-β-D-グルコ蛍光基質の切断を定量化β-ヘキソサミニダーゼ。私たちは、トリクロサンはここに強調​​して、薬や毒物の影響をテストするためのアッセイ法を変更しました。この方法は確実に脱顆粒を定量化する、例えば、フローサイトメトリーベースの検出方法21に安価な代替品であり、抗アレルギー薬の多種多様なハイスループットスクリーニングにうまく自分自身を貸すする可能性があるだけでなく、免疫毒性またはアレルギー物質。この最後の点は、21 世紀 、2007年の国立研究協議会報告書&quot;毒性試験の観点から特に重要である：ビジョンとストラトEGY &quot;（ <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a>マウスのような伝統的な実験動物の高価な使用を減らすために、細胞培養を利用した高スループット毒性試験の開発のための提唱）。 Naal らによって開発された1、私達2によって変更された脱顆粒プロトコルは、相同なヒト粘膜肥満細胞または好塩基球3-5に広く受け入れられているモデルであるRBL-2H3細胞株を利用する。 （培養RBL-2H3細胞のための方法は、ハッチンソンらに詳述されている。22）。このアッセイは、おそらく接続されているすべての肥満細胞のタイプに適合させることができる。 トリクロサン（TCS）は、病院、パーソナルケア製品、および消費財23,24において30年以上に使用されている広域スペクトル抗菌薬である。 TCSの抗菌特性の作用機序は、エノイル-アシルを阻害することによって可能性が高い、脂肪酸生合成の阻害であるキャリアタンパク質レダクターゼ25,26。このようなシャワージェル、ハンドローション、歯磨き粉、うがい薬、および0.3％または10 mMの24までの濃度におけるハンドソープのような消費者製品の広い範囲で世界的に見られる。 TCSの普及は人間27-29や河川30で検出可能なレベルをもたらしました。 Allmyr らによって行われた研究27は、TCSとその代謝物は、授乳中の母親からプラズマとミルクの両方に存在していることを実証した。重要なのは、TCSは容易に皮膚31-37に吸収される。 Queckenberg ら 37は、肥満細胞が存在する皮膚にかなりの濃度で、その結果、12時間以内に人間の皮膚に〜70mMのTCSクリームの約10％の吸収を発見した。 TCSは、ヒトのアレルギー性皮膚疾患7-11を管理するために臨床的に示されているが、TCSが、アレルギー性皮膚疾患を緩和する機構は38知られていなかった。蛍光マイクロプレートアッセイを使用してdetailedがこのビデオでは、我々は最近、2μMという低濃度でTCSは、かなりこれらの臨床データ2のための潜在的な説明を提供して、マスト細胞機能と脱顆粒を減衰することを実証した。これらの臨床データの説明を提供することに加えて、パーマーら、我々の知見は、 図 2には、TCSがカルシウム流入の下流シグナル伝達分子標的とすることを示唆している。多くの免疫学的および他の生物学的プロセスにおけるカルシウムシグナル伝達の重要性のために、TCSは、潜在的に必要な生物学的プロセスの様々に悪影響を及ぼす可能性がある。実際には、Udoji ら 39は、TCSが別の重要な先天性免疫機能、ヒトナチュラルキラー細胞溶解活性を抑制することが示された。 アレルギー性皮膚疾患（または、逆に、免疫毒性など）で治療補助としての可能性を超えて、TCSもかく乱40-49内分泌かもしれません。このように、溶液中のこの化学物質を準備する方法についての明確な手順I毒物への興味のあるの。 TCSが小さい疎水性分子であるため、有機ビヒクルは、しばしば、水に溶けやすくするために使用される。 TCSがテストされているほとんどの毒性試験では、製剤は、エタノール、アセトン、または油2,50,51などの有機溶媒を用いて水に溶解関与している。しかし、しばしばこれらの溶剤は、それによって被験物質データ51の解釈を複雑にし、自分自身を生物学的に活性である。実際には、Rufli らによる。52等53は、水生毒性実験のための試験溶液は、毒性成果物を作成するための化学溶媒の電位により、化学的方法を介して物理的方法を用いて調製されることが推奨される。我々は以前TCSが0.24％のエタノール/水（体積/体積）中に溶解し、30分を減衰RBLマスト細胞の脱顆粒2超音波処理することを示した。 0.24％より高い濃度でエタノールが肥満細胞degraを抑制することが示されているnulation 54,55-examplesの毒性試験で有機溶剤の潜在的交絡効果の。 それだけではなく生物又は研究のために使用される細胞に対する溶媒の影響を考慮することが重要であるだけでなく、それは被験物質自体に溶媒の影響を監視することが重要である。たとえば、Skaare ら 51は、油中の解散は、関数の完全な損失を引き起こしながら、（一般的に歯磨きやうがい薬で見つかった）ポリエチレングリコールでTCSを溶解が健康な女性の女性の抗細菌および抗プラーク効果を弱めていることがわかった。したがって、異なる溶媒の能力はTCSを含む、毒物および薬物を調節するために、効果をアッセイ設計において考慮されるべきである。油または風味添加物の使用は様々な製品50,51におけるTCSの効果を妨げる可能性があります。 有機溶剤を使用する必要性を排除する目的で、我々は、有機ゾルの使用を排除することによってTCS 2を溶解させるための手法に改良ベント。現在のプロトコルでは、我々は熱（≤50°C）で水性緩衝液に直接TCS顆粒を溶解した後、紫外可視分光光度法によってこのTCSの株式の濃度を確認してください。 TCSは、40μM（最大水溶性であるため、これらの改良が可能である<a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ）および50℃（加熱されたときに分解に抵抗することが示されている<a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ）56,57。 TCSも強く4,200 L /モル/ cmで12モル吸光係数が280nmの58で吸収することが知られているように、我々はまた、UV-可視分光測定の付加的な利点を有する。 このプロトコルは、低コストかつ迅速な検証を含む、有機溶剤を使用せずにバッファにTCS顆粒を溶解するために、シンプルでありながら効果的な方法を提供濃度、およびマスト細胞の脱顆粒に対する化学的影響を監視するための強力な蛍光マイクロプレートアッセイを説明しています。

<table><tbody><tr><td> RBL-2H3 細胞 </td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td> 私たちが使用した細胞は贈り物でしたが、ATCC</pからも入手できます。 </td></tr><tr><td> <また>p align="center">Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> 低湿度環境で保管する必要があります </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> ゲンタマイシン硫酸塩 </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> アルブミン、ウシ血清 </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T Baker</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム </td><td>VWR</td><td>BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucose </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> 塩化カリウム結晶 </td><td>J.T Baker</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> 塩化カルシウム二水化物 </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> グリシン </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-メチルウンベリフェリル-N-アセチル-&β;-D-グルコサミニド (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4</td><td> ホイルで包む &ndash; 感光性です </td></tr><tr><td> アンチDNPマウスIgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td>試薬の濃度は1 mg / mlです。アリコート25&micro;l&nbsp;試薬を別々の微量遠心チューブとパラフィルムに入れます。アリコートを-20°Cで保管します。使用されていないCと2-8°Cで使用されているアリコートを保管します。C for only longer than 1 month. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>コーネル大学のデビッド・ホロウカ博士とバーバラ・ベアード博士からの贈り物</td><td></td><td> 提案:ライフサイエンスDNP-BSAカタログ#<a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </tr><tr><td> > カルシウムイオノフォアA23187</td>シ<td>グマ</td><td>C75-22-1mg</td><td>イオノフォアは、400 &micro;l&nbsp;新鮮な100%DMSOをイオノフォアバイアルに注入し、-20°Cに保ちます。C 注:3か月の有効期限を過ぎたイオノフォアを正常に使用しました </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> 酢酸 </td><td>VWR</td><td>BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> 無水炭酸ナトリウム </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> 塩化ナトリウム </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> 塩酸</td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> 参照バッファー、pH 7 </td><td>VWR</td><td>BDH5046</td><td> </tr><tr><td> > 基準バッファー、pH 10 </td><td>VWR</td><td>BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Reference バッファー、pH 4 </td><td>VWR</td><td>BDH5018</td><td> </tr><tr><td> > pH電極ストレージソリューション </td><td>VWR</td><td>14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment:</td></tr><tr><td> DU 7500分光光度計 </td><td>Beckmann</td><td>販売終了</td><td> </td></tr><tr><td>Synergy 2 プレート リーダー Gen5 マイクロプレート データ収集および分析ソフトウェアを使用 </td><td>BioTek</td><td>モジュール S</td><td> </td></tr><tr><td> 血球計算量計 </td><td>Hausser</td> <td>Scientific3110</td><td> </td></tr><tr><td> 7 x&nbsp;7 CER HOT/STIR 120 V ホットプレート/マグネティックスタープレートの組み合わせ </td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> 組織培養水浴 </td><td>VWR</td><td>Model# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> 組織培養生物学的安全キャビネット SafeGARD(TCフード) </td><td>The Baker Company</td><td>Model# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> 組織培養インキュベーター </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><td></td><td> 範囲: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>メトラー・トレド</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> pH meter </td><td>Symphony/VWR</td><td>Model# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond</td> <td>Scientific4-000-100</td><td> </tr><tr><td> > Combitip dispenser </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">レシピ:</td></tr><tr><td> 酢酸緩衝液、pH 4.4 </td><td>0.12 M酢酸を作り、10 N NaOHでpH 4.4まで滴定します。これは、5.3 mLの氷酢酸を1 LのMilliQ水に含んだものです:(1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml、氷河の密度が1.37 g/mlであるため</td><td>滅菌フィルターをオートクレーブ処理したガラス瓶に入れます</td><td></td></tr><tr><td> 基板(4-MU) </td><td>Sigma M-2133、 250 mg、C18H21NO8、FW 379.4 CAS (37067-30-4) -20°Cで保存;Cストック:0.12 MのDMSO(1 mL DMSOに46 mg)、37°Cまで温めます。C、ボルテックス、10分間超音波処理します 温水と水浴ソニケーターで、再びボルテックス</td><td>各実験について、アセテートバッファー(100倍希釈)で基質の新鮮な溶液を作り、アセテートバッファーの最終濃度1.2 mM</td><td></td></tr><tr><td> グリシン炭酸塩バッファー、pH 10 </td><td>26.7 gグリシン47.1 g無水炭酸ナトリウム1 Lに脱イオン水を加えます。 pHを10</td><td>滅菌フィルターをオートクレーブ滅菌ガラス瓶</td><td></td></tr><tr><td> チロデス(2 L)、pH 7.4 </td><td>135 mM NaCl:15.78 g(または270 mlの1 M)5 mM KCl:10 mlの1 Mストック1.8 mM CaCl2: 7.20 ml の 0.5 M ストック 1 mM MgCl2: 4.00 ml の 0.5 M ストック 5.6 mM グルコース: 2.02 g (1 M 11.2 ml) 20 mM HEPES: 40 ml の 1 M ストック 濃縮 HCl pH を使用 ~9.7-7.4</td><td>滅菌フィルターをオートクレーブ滅菌ガラス瓶に入れます</td><td></td></tr><tr><td> RBL Cell Media </td><td>牛胎児血清(FBS、-20°Cで保存。C)37°Cで約4時間。Cウォーターバス 標準的な滅菌技術に従って、L-グルタミンを含む1 Lの最小必須培地(MEM)を取り出します(Earle'と800 ml MEMを持つためにいくつかのMEMを注ぎ、200 mLの温かいFBSを追加します 滅菌ピペットで1 Lの培地に1 mlの硫酸ゲンタマイシン抗生物質を追加します オートクレーブされ、細胞培養使用のみのためにマークされた培地ボトルのみを使用してください。</td><td>滅菌フィルター(0.2 mm)をオートクレーブ処理ガラス瓶に入れます<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">プラスチック材料:</td></tr><tr><td> 200 & micro;l&nbsp;96ラック</td><td>VWR</td><td>53509-009</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> 1,000 & micro;l&nbsp;HighRecovery </td><td>VWR</td><td>89003-420</td><td> polyethylene </td></tr><tr><td> 10 &micro;l&nbsp;マイクロチップ低結合滅菌 </td><td>VWR</td><td>14217-704</td><td> ポリプロピレン </td></tr><tr><td> 高G力のための使い捨て/円錐形微量遠心チューブ </td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td> ポリプロピレン </td></tr><tr><td>使い捨て/目盛り付き/円錐形/滅菌 50 ml&nbsp;スクリューキャップ付き遠心分離管</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td> ポリプロピレン </td></tr><tr><td> 使い捨て/目盛り付き/円錐形/滅菌15ml&nbsp;スクリューキャップ付き遠心チューブ </td><td>VWR</td><td>21008-103</td><td> ポリプロピレン </td></tr><tr><td> CELLSTAR 組織培養処理済みT-25フラスコ(フィルターキャップ付き) </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td>CELLSTAR 組織培養処理済み T-75 フラスコ フィルターキャップ付き </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp;紙/プラスチック包装血清ピペット </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp;紙/プラスチック包装血清ピペット </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp;紙/プラスチック包装血清ピペット </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp;紙/プラスチック包装血清ピペット </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td> 1cmキュベット</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td>CELLSTAR、96W マイクロプレート、組織培養処理済み、黒、蓋付き 96-well Plate </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> ポリスチレン </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td>022266501</td><td> ポリプロピレン/ ポリエチレン </td></tr></tbody></table>

rbl-2h3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

マスト細胞はアレルギー疾患や寄生虫に対する免疫防御において重要な役割を果たしている。かつて（アレルゲンによって）アクティブに、彼らは、アレルギー性メディエーターのエキソサイトーシスで結果そのプロセスを脱顆粒。薬物および毒物による肥満細胞の脱顆粒の変調は、人の健康に正または悪影響を与える可能性があります。肥満細胞機能は、ラット好塩基球性白血病マスト細胞の使用（RBL-2H3）、ヒト粘膜肥満細胞の広く受け入れられているモデルまでの時間を詳細に切開されている。 6肥満細胞からのヒスタミンと連携して直線的に放出される肥満細胞顆粒成分およびアレルギーメディエーターβ-ヘキソサミニダーゼを、容易かつ確実に適しているマイクロプレートアッセイで測定可能な蛍光強度を得、蛍光原基質との反応により測定することができる高スループット研究1。もともとNaal らによって出版した。1、我々は、スクリーニングOは、この脱顆粒アッセイを適応しているfは薬物や毒物、ここでその使用方法を示しています。 トリクロサンは、多くの消費者製品中に存在し、このエフェクトのメカニズムは不明であるが、人間のアレルギー性皮膚疾患における治療7-11援助であることが見出されている広域スペクトル抗菌剤である。ここでは、マスト細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの効果についてのアッセイを実証する。我々は、最近、トリクロサンを強くマスト細胞機能2に影響を与えることを示した。有機溶媒の使用を回避する目的で、トリクロサン熱と攪拌しながら水性緩衝液中に直接溶解させ、得られた濃度は、12（ε280 = 4,200 L / M / cmで使用）UV-可視分光光度計を用いて確認された。このプロトコルは、より広く、そのアレルギー電位をマスト細胞の脱顆粒に対する効果を決定するために様々な化学物質と一緒に使用される可能性があり、。

90分間50℃に加熱すると、TCSのためのUV-可視吸収スペクトルは図1に示すように、280nmの付近のピークで、260〜300nmの間の強力な、滑らかな曲線を生成する。 UV-可視分光光度計は、従って、280nmで公開されてモル吸光係数が4,200 L /モル/ cmで12であるので、濃度を計算するために利用することができる重要なツールである。我々は、TCSが50°Cに加熱した（データは示さず）後に、全体の脱顆粒実験の時間枠の間に溶液から脱落しないことを見出した。 マストから解放β-ヘキソサミニダーゼのレベルを記録し、このアッセイは、水性緩衝液に直接TCSを溶解するために、この加熱法を使用した後、我々はNaal らから最適化された蛍光ベースのアッセイを用いて肥満細胞の脱顆粒にTCSの効果を検討した。1蛍光発生基質産物を検出することにより、一時間のインキュベーション後の細胞。 DNP-BSによって脱顆粒に刺激するかどうか抗原（ 図2）やカルシウムイオノフォアA23187（ 図3）は ...

マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン2の強力な阻害効果を発揮するために利用。

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

次の実験の全体的な目標は、蛍光マイクロプレートアッセイを使用して、肥満細胞の脱顆粒に対する化学的影響を評価することです。このプロトコールでは、抗菌剤トリクロサンの阻害効果が有機溶媒を使用せずに実証されます。これは、最初にマストセルを96ウェルプレートに播種して一晩接着させ、加熱によって有機溶媒を使用せずに水溶液中でトリクロサンを調製することによって達成されます。その後、Trian溶液の濃度は、紫外可視分光法を使用して迅速に決定されます。第2のステップとして、細胞はトライアンの存在下または非存在下でIgEスラッシュ抗原またはカルシウムイオノフォアで刺激され、これによりマスト細胞脱顆粒マーカーβヘキソサミニダーゼが上清に放出されます。細胞上清へのβヘキソサミニダーゼの放出は、βヘキソサミニダーゼ基質を用いて定量され、その蛍光産物はマイクロプレートリーダーで定量されます。肥満細胞の脱顆粒結果に対するトリクロサンまたは他の試験化学物質の影響を測定するために、結果が得られます。これは、トリクロサンが、蛍光ベースのマイクロプレートアッセイに基づいて、ラット好塩基性白血病マスト細胞における抗原またはカルシウムイオン4の活性化脱顆粒を阻害することを示しています。この手法が従来の方法と比較した場合の主な利点は、安価で迅速、高感度な代替手段であり、ハイスループットスクリーニングに適している可能性があることです。さらに、一部の有機溶媒を使用せずにトライアンを水溶液に溶解することで、多くの有機溶媒が肥満細胞機能に及ぼす交絡効果を回避できます。トリクロサン濃度測定のためのこの技術は、UV対スペクトロメトリーが迅速かつ低コストであるという点でも利点があります。このMAは、肥満細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの影響についての洞察を提供することができ、SAとしてのこのマイクロプレートは、免疫毒性または内分泌破壊効果について試験されているさまざまな潜在的な抗アレルギー薬候補および化学物質のスクリーニングにも適用できます。このプロトコルは、ラット好塩基性白血病肥満細胞株、またはヒト粘膜肥満細胞または好塩基球の広く受け入れられているモデルであるRB 2 H 3を利用しています。RBL細胞は、トリプシンおよび細胞の計数に関する標準的な手順に従って、T 25フラスコで培養します。RBL培地を用いてRBL培地を用いて10〜6細胞/ミリリットルの密度の細胞懸濁液を調製し、平坦な黒底96ウェルプレートにウェル当たり100マイクロリットルの細胞を分注する。このプレートテンプレートシートに従って、系統誤差を避けるために、ウェルへの細胞の添加方法をランダム化します。細胞溶液をよく混合しますが、プレーティング手順中に細胞を懸濁させておくために添加した3つのウェルの各セット間で穏やかに混合します。すべての細胞を96

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、好塩基球脱顆粒を誘導する抗原のアレルギー性を評価するin...

ヒト化メディエーター酵素放出アッセイ:in vitroで好塩基球脱顆粒反応をモニタリングすることにより、試験抗原のアレルギー性をスクリーニングする免疫化学的方法

このビデオでは、肥満細胞の脱顆粒活性を測定するための比色分析を実演しています。肥満細胞によって放出された酵素は、基質を加水分解し、着色された製品を生成します。肥満細胞の脱顆粒活性は、細胞外への酵素の放出率を細胞内の総酵素含有量で正規化して測定しました。...

標的化学物質の効果を研究するための肥満細胞脱顆粒アッセイ

このビデオは、CXCR4ケモカイン受容体を発現する膠芽腫細胞を含む細胞アッセイを示しています。このアッセイでは、カルシウム感受性色素を使用して、薬剤の相互作用による蛍光変化を測定し、細胞シグナル伝達ダイナミクスに関する洞察を提供します。...

CXCR4相互作用因子の同定のための細胞アッセイ

このビデオは、脱顆粒アッセイを通じて好中球の活性化と顆粒エキソサイトーシスを監視するアッセイを示しています。炎症誘発性化合物によって活性化されると、ゼラチナーゼを含む好中球内の細胞質顆粒が細胞膜と融合し、それらの貨物を排出します。上清中のゼラチナーゼの存在は、蛍光色素結合ゼラチン基質の加水分解によって評価され、好中球の活性化と脱顆粒が確認されます。...

好中球の活性化とゼラチナーゼ放出をモニターするための脱顆粒アッセイ

特定の疾患の病態生理学を理解し、治療介入のための新しい戦略を特定するために、早期の内皮細胞(EEC)の移動の調査が重要です。次のプロトコルは、EECの調査に適応した細胞遊走を評価する技術について説明しています。...

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

ここでは、酵素の抗菌活性を迅速にスクリーニングし、特性評価するためのプロトコルを紹介します。マイクロスライド拡散アッセイと色素放出アッセイは、標的細菌基質を利用して、定性的および定量的な酵素活性評価を行います。...

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2...

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

ここでは、メディエーター放出アッセイを提示し、ヒトIgE受容体にトランスフェクトしたラット好塩基性白血病細胞株を用いて、1型アレルギー反応において典型的に認められるエフェクター細胞の脱顆粒をシミュレートする。この方法は、高感度、再現性、およびカスタマイズ可能な方法でアレルゲンの生物学的活性を調査します。...

ヒト化メディケーターは、アレルゲン効力の読み取りとしてアッセイをリリース

ここでは、改善された走化性アッセイプロトコルを提示する。このプロトコルの目標は、従来の細菌走化性法のステップとコストを削減し、植物と微生物の相互作用を理解するための貴重なリソースとして機能することです。...

根の滲出液中の根茎細菌の化学誘引物質の迅速な同定のための改良された気化症アッセイ

学ぶ 蛍光マイクロプレートアッセイを用いてRBL-2H3マスト細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの阻害効果を評価する方法。有機溶剤を使用せずにベータヘキソサミニダーゼの遊離を定量化し、アレルギー応答への影響を解明します。

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

さらに動画を探す