Name: 定量的なインビトロアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ 好中球結合アッセイを用いて、炎症条件下で活性化したヒト微小血管内皮細胞への好中球接着を定量化する方法。この技術は炎症性疾患の治療戦略開発に貢献します。

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この作品は、麻酔と周術期ケアのUCSF学科によってサポートされていました。

1。微小血管内皮細胞のメッキとメンテナンス<ol><li>命令を供給メーカーによるとあなたの微小血管内皮細胞を解凍し、成長する。このプロトコルでは、細胞をEGM-2 MVメディア（ロンザ）で増殖させた、そしてそれは全ての実験は、継代数に起因するいかなる変動を最小限に抑えるために解凍から2週間以内に行われることが推奨される。 HMVECロンと私たちの実験は4〜9の通路との間で行われている。 </li><li> 1日目：細胞が80〜90％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理及び1ml当たり120,000細胞で再懸濁します。 48ウェル、ポリスチレン組織培養プレート（S）にプレートウェルあたり36,000細胞（0.3ミリリットル）を。バックグラウンド蛍光測定値を得るために、好中球とインキュベートされることはありません HMVECの井戸を含めます。特に蛍光アッセイ、交互の行または列用に設計された48ウェルプレートを用いた場合を除き、隣接する井戸からの光の汚染を最小限に抑えることができます。注：ウェルズポリlysiでプレコートすることができますね、コラーゲンやフィブロネクチン。 </li><li> 2日目：新鮮な培地を追加します。 </li><li> 3日目：位相差顕微鏡で、細胞（ すなわち 、 &quot;玉石&quot;の外観と少し細胞の破片）健康的であり、彼らが100％コンフルエント（ 図1）であることを確認します。細胞が100％コンフルエントでない場合、彼らは準備が整うまで、毎日メディアを変更してください。 </li><li> HMVEC単層が治療のために準備ができたら、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で1回細胞を洗浄し、適切なウェルに炎症性アゴニストを含有する新鮮なEGM-2 MVメディアまたはメディア0.3 mlを加える。このプロトコルではHMVEC-肺をTNFαで処理した3時間[100 ngの/ mlの]（ぺプロテック、ニュージャージー州）、これはECの21のよく説明ベーターであるため。注：これは、（ステップ3.5）、好中球のラベルが付いたAM、時間あなたの実験をので、あなたの活性化HMVEC細胞（ステップ4.1）とカルセインことをことをお勧めしますが、同時に使用する準備が整いました。それはneutrophを分離し、標識するために私たちに約2.5時間かかりますILS。 </li></ol> 2。 Polymorphprepを使用して好中球分離<ol><li>以前に22説明したように好中球を分離し、または全血から多形核顆粒球を分離するため、既製の密度勾配液で。 Nuzzi、 らによるプロトコルに従ってPolymorphprepを採用。全血23 1mlあたり約2〜3×10 6の好中球の利回り2007年の結果は。注：赤血球を除去するために過剰な赤血球溶解、デキストラン沈降を回避するためには、密度勾配遠心24の前に行ってもよい。 </li><li> RTへPolymorphprep密度勾配液を持参してください。 </li><li>例えば、ヘパリン、クエン酸塩またはEDTAなどの抗凝固剤の存在下で、健康な人間のボランティアからの全血30mlのを収集します。血液は、2時間以内に使用され、18-22℃の間で保管してください</li><li> 15ミリリットルコニカルチューブ内の密度勾配溶液5mlを超える全血の層5ミリリットル（ <strong&gt;図2A）。これは、その後の遠心分離条件を変更することができるように血液および密度勾配溶液の容積を変化させる避ける。 </li><li> 18-22で30分間450×gで遠心℃、ゆっくりスピードアップとダウンの遠心分離機（ すなわち遠心ブレーキをオフにする）、および好中球の活性化を減少させ、層の混合を防ぐために振動を防ぐためによくチューブのバランスをとることを確認してください。長い遠心倍以上の遠心力がペレット化赤血球に向かってさらに下方に移動するように、好中球を含む下位の白血球層をもたらす。 </li><li>好中球（ 図2B）を含む層の汚染を防止するために、PBMCを含有プラズマ及び上部白血球バンドを吸引。 </li><li>好中球を含む白血球下位層を除去するために1〜2ミリリットル血清ピペットを使用してください。 50mlのPBSを30ml（のCa 2 +およびMg 2 +なし）に好中球のレイヤーを結合コニカルチューブ。 </li><li> PBSで50ミリリットル（のCa 2 +およびMg 2 +なし）にボリュームを起動し、18〜22歳で10分間、450×gで遠心℃、 </li></ol> 注：ステップ2.9と2.10はオプションですが、強く推奨。 <ol start="9"><li>上清を吸引。赤血球を溶解するために30秒間の滅菌水8mlに好中球を再懸濁し、すぐに5倍の2mlのPBS（のCa 2なし+およびMg 2 +）と優しく手でミックス。で細 ​​胞をインキュベートしない]に細胞懸濁液を追加30秒より長くのための水の重要な好中球の死が発生する可能性があるため。 </li><li> 18-22で5分間250 xgで遠心℃、 </li><li> 10mlのPBS（Ca 2 +のおよびMg 2 +なし）で1回細胞を洗浄し、18〜22歳で5分間250 xgで再び遠心℃、 </li><li> RPMI-1640（フェノールレッドなし）10ml中の好中球を再懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える電子色素排除法。これは、好中球の活性化につながる可能性があるので、1mlあたり5×10 6より大きい細胞密度の長時間は避けてください。 </li></ol> 3。カルセインAMと好中球のラベル<ol><li> 6×10 5好中球は、48ウェルプレートのウェルあたりに使用される。 </li><li>カウントした後、50ミリリットルコニカルチューブに再懸濁した細胞を転送し、フェノールレッドを含まないRPMI-1640で1mlあたり2-4×10 6細胞に好中球を希釈。 </li><li>カルセインが3μm（カルセインAM株式すなわち 2.98液（1 mg / ml）でml当たりのメディア）に原液AM加え、穏やかにチューブをフリックでよく混ぜる。以上5μMはカルセイン好中球からの漏れが発生しますAM 注：非蛍光カルセインAMが高い蛍光分子カルセイン（ つまり死んだ細胞が蛍光を発することはありません）を生成するために、内因性エステラーゼにより細胞内で切断される。 </li><li>アルミホイルでチューブをカバーとfをインキュベートまたは37℃で30分間、暗注C：長いインキュベーション時間は接着アッセイの過程で好中球から解放され、よりカルセインになることがあります。 </li><li> 18-22°Cで5分間450×gで遠心分離し、RPMI-1640（フェノールレッドなし、37℃に予熱）10mlで2倍の好中球を洗う。 40μM無菌フィルターは18-22で塊を除去した後、5分間450 xgで再び遠心分離するのに二回目の洗浄のために細胞を再懸濁した後、最初の好中球を渡​​す℃に</li><li> 1mlあたり2×10 6好中球で。（37℃に予め温めずにフェノールレッド）RPMI 1640中で好中球を再懸濁し</li></ol> 4。好中球結合アッセイ<ol><li>フィルター滅菌を0.5ml（0.22μm）をRPMI 1640（フェノールレッドなし）ウェルあたり3％BSAを含むと3倍HMVEC単層を洗浄します。 </li><li>メディアを吸引し、6×10 5カルセイン標識好中球（細胞サスペンシオ0.3 mlを加える48ウェルプレートの適当なウェルに好中球なしN）、またはRPMI 1640 0.3mlの（フェノールレッドなし）、 注：これは1cm 2あたり8×10 5の好中球と同等です。 </li><li> 37°C、5％CO 2インキュベーター内で20分間インキュベートする。 </li><li> 総好中球蛍光（PRE洗浄）：485 nmでの励起波長および発光FLUOstarにおける520nmの（フルオレセインフィルターセット）の波長、またはそれと同等の分光光度計を用いて各ウェルの蛍光強度を測定する。直前のインキュベーション終了点までこのステップを実行注：このプロトコルでは、放出される光のカルセインの励起および検出が覆わウェルの上部から行われたが、両方はまた、ウェルの底部から行うことができる。 </li><li> 0.5ミリリットルウェルあたりのPBS（W / Ca 2 +のおよびMg 2 +）と5倍HMVEC単層および好中球を含むウェルを洗ってください。メディアや洗浄を削除反転プレートによって、残りの液体を除去するためにペーパータオルの上に優しくパッティング。 </li><li>バックウェルあたりRPMI 1640 0.3ミリリットル（フェノールレッドなし）を追加します。 </li><li> 付着性好中球蛍光（POSTウォッシュ）：ステップ4.4のように、各ウェルの蛍光強度を測定します。 </li><li>パーセント順守とウェルあたり相対遵守を決定する： </li></ol> 注：この段階で、カルセイン-標識された好中球の画像は標準フルオレセインフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用することができることによって得ることができる。 図4の画像は、Pro7ソフトウェア（Qイメージング）、Qは-キャプチャ使用Retiga 2000Rカメラ（Qイメージング）を搭載したオリンパスIX51倒立顕微鏡で得た。

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Collins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+endothelial+cell+adhesion+molecules%3A+NF-kappa+B+and+cytokine-inducible+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Middleton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+and+surface+presentation+of+IL-8+by+venular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells.</a> Cell. 91, 385-395 (1997).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+binding+of+NAP-1%2FIL-8%3A+role+in+neutrophil+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration.</a> Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).</li>
<li>Detmers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-activating+protein+1%2Finterleukin+8+stimulates+the+binding+activity+of+the+leukocyte+adhesion+receptor+CD11b%2FCD18+on+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils.</a> J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).</li>
<li>Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+integrin+activation+by+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte integrin activation by chemokines.</a> Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).</li>
<li>Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+tethering+on+E-selectin+activates+beta+2+integrin+binding+to+ICAM-1+through+a+mitogen-activated+protein+kinase+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway.</a> J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+neutrophil+interaction+with+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).</li>
<li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+neutrophil-mediated+monocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment.</a> Blood. 114, 4613-4623 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+endothelial+TLR2+by+bacterial+lipoprotein+upregulates+proteins+specific+for+the+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response.</a> Innate Immun. 18, 602-616 (2012).</li>
<li>Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labelling+Technologies%22">The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies</a>. , 10, (2005).</li>
<li>Shin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipoprotein+TLR2+agonists+broadly+modulate+endothelial+function+and+coagulation+pathways+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK5+protein+promotes%2C+whereas+MEK1+protein+differentially+regulates%2C+the+Toll-like+receptor+2+protein-dependent+activation+of+human+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes.</a> J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+to+detect+nuclear+factor+activation+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).</li>
<li>Kuma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIRB796+inhibits+all+p38+MAPK+isoforms+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).</li>
<li>Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+E-selectin+expression+in+activated+endothelial+cells+are+inhibited+by+p38+MAPK+%28mitogen+activated+protein+kinase%29+inhibitor+RWJ+67657%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657.</a> International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).</li>
<li>Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+polymorphonuclear+cells+to+human+endothelial+cells.+Adhesion-molecule-dependent%2C+and+Fc+receptor-mediated+adhesion-molecule-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms.</a> Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).</li>
<li>Akeson, A. L., Woods, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorometric+assay+for+the+quantitation+of+cell+adherence+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells.</a> Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).</li>
<li>De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+dyes+in+the+determination+of+adherence+of+human+leucocytes+to+endothelial+cells+and+the+effect+of+fluorochromes+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function.</a> Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+acts+on+cultured+human+vascular+endothelium+to+increase+the+adhesion+of+polymorphonuclear+leukocytes%2C+monocytes%2C+and+related+leukocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines.</a> The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).</li>
<li>Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+vascular+endothelial+cells+acquire+adhesiveness+for+neutrophils+after+stimulation+with+interleukin+1%2C+endotoxin%2C+and+tumor-promoting+phorbol+diesters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters.</a> J. Immunol. 136, 649-654 (1986).</li>
<li>Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+adherence+of+neutrophils+to+umbilical+vein+endothelium+by+human+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).</li>
<li>Braut-Boucher, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-isotopic%2C+highly+sensitive%2C+fluorimetric%2C+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).</li>
<li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li>
<li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease%3A+a+Jack+of+all+trades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li>
<li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Wegener%26%2339%3Bs+granulomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+de+Medecine+Interne%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Wegener&#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li>
<li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

成功した好中球/微小血管内皮細胞接着アッセイのための最も重要なステップは次のとおりである：1）低継数（&lt;9）、健康な内皮細胞の使用は、低密度（ すなわち &lt;5×10 6個の細胞で孤立した好中球を維持2） / ml）と分離の2時間以内にそれらを使用して、それぞれ、3）気難しいカルセインAMで標識された好中球の洗浄および好中球からのカルセインのECの汚染や損失を最小限に抑えるためにタイムリーにカルセインAMで標識された好中球の使用は、 。 我々は、よく表面積（48ウェルプレートのウェルあたりすなわち 60万好中球）の組織培養の1cm 2あたり8×10 5好中球を追加します。我々は60万好中球の入力は当社の分光光度計の直線範囲内にあることを見つけ、そして相対的な癒着が測定されたとき確実にデータを再生する。しかしながら、好中球結合が非常に似て減少が観察される40,000、200,000 1,000,000好中球をウェル当たり添加するのp38-MAPK阻害アッセイ（ <stron...

血管内皮の循環血液と直接接触しているので、一意的に感染または損傷時に迅速な炎症反応を開始させる位置している。内皮細胞（ECS）の保存された細菌成分と危険分子の多様性、ならびにTNFαなどの炎症性メディエーターホストに対する受容体を認識する明白なパターン認識受容体。これらの受容体の活性化は、分泌性サイトカイン（ 例えば、IL-6、IL-8、CXCL1およびCCL2）へのECを誘導し、そしてその細胞表面1の接着分子（ 例えば、E / P-セレクチン、VCAM-1およびICAM-1）をアップレギュレートする、2。これらの分子は、すべての感染性病原体の宿主をクリアし、組織修復を3,4を開始するために感染や傷害部位への白血球の局在を促進する。感染に好中球応答が血管内皮と応答の間でよく調整された相互作用を伴う好中球。 EC活性化、ILアポン8が分泌され、感染症やけが5,6のサイトに家に好中球を可能に内皮に血管内の勾配を形成する。 E / P-セレクチン好中球の取り込みを仲介し、好中球の細胞表面上にglycomoleculesと比較的弱い団体を通じてローリング。これらの相互作用は、その同族受容体へのIL-8結合とともに、堅牢な、インテグリン媒介アタッチメントおよび内皮細胞表面7-10に好中球の最終的な逮捕を容易にします。停止した後、好中球は、直接病原体を排除するために、感染の特定の部位への脈管構造から移動病原体の拡散を防ぐために好中球細胞外トラップを生成し、創傷治癒を促進し、単球、マクロファージおよび樹状などの他の白血球を補充する追加の因子を放出することができ細胞11-17。 microvへの好中球の接着を定量するためのインビトロ方法は、この報告書に記載ascularはTNFα宿主炎症性メディエータによる活性化した後にECを。このアッセイは、ECの活性化のではなく、好中球を評価するために設計されている。初代ヒト好中球は、第密度勾配分離を用いて単離され、次いで、カルセインアセトキシメチル（AM）で標識される。生細胞加水カルセイン内エステラーゼは、492から495 nmおよび513から516 nmの18の放射の励起と高蛍光カルセイン分子にAM。蛍光標識された好中球は、その後、EC単層と共にインキュベートし、非付着性好中球は、その後、除去される。残りの結合した好中球の蛍光は、その後、蛍光分光光度計を用いて測定し、ウェルあたりの総好中球の蛍光入力のパーセントとして計算される。この方法は、分光光度法で使用される結合したカルセイン-標識された好中球を直接より定性的なEC交流から読み出さを与えるために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有するtivati​​on。このアッセイは、静的条件下で行われるので、好中球の接着カスケードに生じるごく初期のイベントが評価される。これは、そのE-セレクチンとの相互作用が中断されたときTNFα処理ヒト肺微小血管EC（HMVEC-肺）単層への好中球の順守を大幅に低減されることを示すために、E-セレクチン遮断抗体を使用して、この報告書で確認された。 TNFαに加えて、我々は正常Toll様受容体1/2アゴニストペプチドグリカン関連リポタンパク質（PAL）、ムレインリポタンパク質（MLP）とPam3Cysによってヒト臍帯静脈EC（HUVEC）活性化の程度を決定するために、このアッセイを使用しているPam3Cys 19,20によってHMVEC-肺の活性化。さらに、我々は正常にこの方法論は、さまざまな互換性があることを示唆し、キナーゼ阻害剤とHMVEC-肺における表面および細胞質タンパク質のRNAiによるノックダウンした後に、このアッセイを使用した生化学的およびscreeninグラムアッセイ20。要約すると、このアッセイは、in vitroで炎症性メディエーターによってECの活性化の程度にアクセスするため、使いやすい、再現性、より機能的な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>任意のベンダーと代替可能</td></tr><tr><td>48ウェル組織培養プレート</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (フェノールレッドなし)</td> <td>UCSF 細胞培養施設</td><td>CCFAL001</td><td>任意のベンダーと代替可能</td></tr><tr><td>D-PBS(Ca2+およびMg2+およびフェノールレッドなし)</td><td>UCSF細胞培養施設</td><td>CCFAL003</td><td>任意の</td>ベンダーRPMI-1640</tr><tr><td>(フェノールレッドなし)</td><td>で</td>代用可能ライフテクノロジー<td>ズ11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calcein AM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズC3099</td><td>(0.995 mM)ストックsoln</td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;M</td><td>フィルターVWR</td><td>21008-949</td><td>任意のベンダーで代用可能</td></tr><tr><td>FLUOstar OPTIMA 分光光度計</td><td>BMG LABTECH-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

血管内皮は、炎症反応に不可欠な役割を果たしている。炎症の急性期の間に、内皮細胞（ECの）保存された微生物成分又は宿主由来の危険分子による宿主メディエーター直接によって活性化される。活性化されたECの特急サイトカイン、動員ケモカインおよび接着分子は、感染症やけがの部位で白血球を活性化し、維持する。好中球は到着する最初の白血球であり、両方の細胞の表面に存在する接着分子のさまざまな内皮に付着する。好中球の主な機能は、直接、微生物の脅威を除去するための追加の因子の放出を介して他の白血球の動員を促進し、創傷修復を開始することである。したがって、内皮への採用とアタッチメントは、炎症応答の開始に重要なステップです。本稿では、用いたin vitro好中球接着アッセイで説明カルセインAM-標識された一次ヒト好中球は、静的条件下で微小血管内皮細胞の活性化の程度を定量する。この方法は、蛍光分光光度計で定量し、同じサンプルは、直接結合好中球のより定性的評価のために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有する。

好中球結合アッセイを使用して、信頼性、再現性のある結果を得るためには、 図1のHMVEC-肺に示すように、健康および微小血管内皮細胞のコンフルエントには、アッセイの当日に最適であることが不可欠である。また、低継番号微小血管のECは（9未満通路すなわち ）が使用されることが不可欠であり、従って、我々は、解凍から2週間以内にすべての実験を行うことをお勧めします。好中球の健康状態は、細胞が何らかの方法で構成されている場合、カルセインAMは、蛍光カルセイン分子に代謝されることはありません、特に以来、また、最も重要なのです。私たちは、トリパンブルー排除法を使用しており、細胞のかなりの割合（ すなわちステンド）死んでいる場合、検定を続行しないでください。 好中球を単離する方法はいくつ密度勾配および抗原ベースのカラム分離方法、のいずれかを含むがあるこれらは、この手順のために十分です。我々は、AxisシールドからPolymorphprep既製密度勾配液を使用することにしました。 図2に見られるよ...

感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載<em&gt; in vitroで</em静的な条件下での炎症性メディエーターによって活性化内皮細胞への結合初代ヒト好中球の&gt;定量。

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

本手順の全体的な目的は、静止条件下でインビトロにおいて血管内皮細胞に接着する好中球の相対数を定量し、微小血管内皮細胞の炎症性活性化の程度を決定することである。これは、まず第2ステップにおいて、健康な微小血管内皮細胞のコンフルエント単層を目的の実験刺激剤で処理することによって達成される。健康なヒトボランティアから好中球を単離し、その後calcium amで標識する。次に、ラベル化した好中球を血管内皮細胞に添加し、20分間接着させます。この間に、蛍光分光光度計を用いて洗浄前の測定を行います。最終ステップとして、非接着の好中球を洗浄して除去し、その後、洗浄後の測定を行います。最終的に、各処理条件下における血管内皮細胞単層へのカルシウムラベル化した好中球の接着率および相対的な接着量を決定することができます。この手法は、異なる条件下での微小血管内皮の炎症活性化の相対的な程度を決定できるため、ヒト炎症生物学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。さらに、このアッセイは、白血球の微小血管内皮への結合を伴うヒト内皮由来の疾患プロセスの研究ツールとして活用できる可能性があります。アッセイ当日は、位相差顕微鏡を用いて、細胞が細胞破片の少ない健全な石畳状の形態を呈しており、100%コンフルエントであることを確認してください。HM VEC単層が処理可能な状態になったら、細胞をHBSSで1回洗浄し、炎症アゴニストを含むか含まない新鮮な微小血管内皮細胞増殖培地0.3 millilitersを適切なウェルに添加します。ここでは、好中球を単離するために、HM VEC lungをTNF alphaで3時間処理しています。Polymorph prepを使用して、まず密度勾配溶液を室温に戻します。次に、抗凝固剤の存在下で健康なヒトボランティアから全血30 millilitersを採取し、15 milliliterコニカルチューブ内のPolymorph prep 5 millilitersの上に、血液5 millilitersを重層します。全血を、ブレーキオフの状態で450 ×g、18〜22 °Cで30分間遠心分離し、チューブのバランスが適切に取れていることを確認します。次に、不透明なピンク色の好中球層による汚染を防ぐため、黄色い血漿およびPBMCを含む層を吸引します。好中球を除去するには、ピペットとチューブをゆっくりと回転させながら、1〜2 mLのセロロジカルピペットで好中球層を吸引します。複数のチューブから好中球を回収し、30 mLのカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSを含む50 mLコニカルチューブに移します。さらにカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSを加え、全量を50 mLにします。細胞を遠心分離した後、上清を吸引し、再懸濁します。好中球を8 mLの滅菌水に懸濁し、赤血球を溶

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 -...

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。...

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

このビデオでは、蛍光顕微鏡を使用してがん細胞の好中球細胞外トラップ(NET)への付着を検出するアッセイを実演しています。試験ウェルでは、NETsに付着する蛍光標識がん細胞の数が顕著に増加していますが、DNaseで処理されたウェルでは、NETsへのがん細胞の接着が減少しています。...

がん細胞の好中球細胞外トラップへの付着を検出するためのin vitro接着アッセイ

粘膜細菌感染に応答して好中球トランス上皮移動は、上皮損傷および臨床疾患に寄与する。この現象を調整する分子機構の解明に向けた研究を容易にするために、トランスウェルフィルター上で成長した病原体、ヒト好中球、偏光ヒト上皮細胞層を組み合わせた in vitro...

インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

好中球の接着を定量する方法が報告されている。この方法は、血管内に発生したものと同様の動的流れ環境を作成する。これは、せん断応力との生体内環境に似コンテキストで精製された接着分子（リガンド）のいずれかへの好中球の接着や内皮細胞基質（HUVEC）の調査を可能にする。...

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。...

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

内皮細胞単層内の接着細胞の実際の数を定量できるin vitro法を報告します。...

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

血管内皮細胞は、しっかりと白血球動員を制御します。不十分な白血球の血管外漏出は、炎症性疾患に貢献します。したがって、内皮活性化の新しい規制要素の検索は、炎症性疾患の改善治療を設計する必要です。ここでは、白血球は炎症時に人身売買を変更できる新しい内皮調節を特徴付けるための包括的な方法論について述べる。...

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in...

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

学ぶ 好中球結合アッセイを用いて、炎症条件下で活性化したヒト微小血管内皮細胞への好中球接着を定量化する方法。この技術は炎症性疾患の治療戦略開発に貢献します。

定量的な

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