定量的なインビトロアッセイ

この手順の全体的な目標は、静的条件下でin vitroで内皮細胞に付着する好中球の相対数を定量することにより、微小血管内皮細胞の炎症性活性化の程度を決定することです。これは、まず、第2ステップで微小血管内皮細胞の健康なコンフルエント単層を所望の実験的刺激で処理することによって達成されます。健康なヒトのボランティアからの好中球を単離し、カルシウムアムで標識します。

次に、標識された好中球を内皮細胞に添加し、20分間接着させ、その間に蛍光分光幾何学によって事前洗浄測定を行います。最終ステップでは、非接着性の好中球を洗い流し、その後、洗浄後の測定値を取得します。最終的には、各治療条件下でのカルシウム標識好中球の内皮細胞単層への付着率と相対的付着率を決定できます。

この方法は、さまざまな条件下での微小血管内皮炎症活性化の相対的な範囲を決定できるため、ヒト炎症生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。さらに、このアッセイは、アッセイの日に微小血管内皮への白血球の結合に関与するヒト内皮ベースの疾患プロセスを研究するためのツールとして使用できる可能性があります。位相差顕微鏡を使用して、細胞が細胞の破片がほとんどない健康な丸石の外観を示し、100%コンフルエントであることを確認します。

HM VEC単分子膜の治療準備ができたら、HBSSで細胞を一度洗浄し、炎症アゴニストの有無にかかわらず、0.3ミリリットルの新鮮な微小血管内皮細胞増殖培地を適切なウェルに加えます。ここでは、HM VEC肺をTNFアルファで3時間治療して好中球を分離します まず、多形調製を使用して、密度勾配溶液を室温に戻します。次に、抗凝固剤層の存在下で健康な人間のボランティアから30ミリリットルの全血を採取した後、15ミリリットルの円錐管内の5ミリリットルのPolymorphプレップを超える5ミリリットルの血液

全血をGの450倍、摂氏18〜22度で30分間分離し、チューブのバランスが取れていることを確認します。次に、黄色のプラズマとPBMCを含む層を吸引して、不透明なピンク色の好中球層の汚染を防ぎます。好中球を除去するには、ピペットとチューブをゆっくりと回転させながら、1〜2ミリリットルの血清ピペットで好中球層を吸引します。

複数のチューブから好中球を、30ミリリットルのカルシウムとマグネシウムを含まないPBSを含む50ミリリットルの円錐形チューブに引き込みます。カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを多く含む50ミリリットルまで容量を増やします。細胞をスピンダウンした後、スナットを吸引してから蘇生します。

好中球を8ミリリットルの滅菌水に懸濁して、30秒後に赤血球をシラミにします。8ミリリットルの細胞懸濁液を5 xカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSの2ミリリットルにすばやく加え、続いて穏やかに混合します。細胞をスピンダウンした後、再度、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで細胞を一度洗浄し、フェノールレッドを含まないRPMI 1640の10ミリリットルでペレットを再懸濁し、トライアンブルーの排除によって生細胞をカウントします。

カウント後、再懸濁した細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、好中球をフェノールレッドフリーRPMI 1640で1ミリリットルあたり2〜400万個の細胞で希釈します。次に、新たに調製したカルシウムアムワーキング溶液を細胞に3マイクロモル濃度に加えます。チューブを数回静かに反転させて細胞懸濁液を混合し、ホイルで覆われたチューブを摂氏37度でインキュベートします。

30分後、標識された好中球を遠心分離し、次にペレットを摂氏37度の10ミリリットルで2回洗浄します。フェノールレッドフリーRPMI 1640は、細胞懸濁液を40ミクロンの滅菌フィルターに通し、2回目の遠心分離の前に凝集物を除去します。好中球を摂氏37度の10ミリリットルに再懸濁します。

フェノールレッドフリーRP MI 1640。そして、もう一度細胞を数えた後、1ミリリットルあたり200万個に希釈します。次に、3回目の洗浄後、ウェルあたり3%BSAを含む滅菌フェノールレッドフリーRPMI 1640の0.22ミクロンフィルター、滅菌フェノールレッドフリーRPMI 1640の0.5ミリリットルでHM vec単分子膜を3回洗浄し、培地を吸引し、0.3ミリリットルの細胞懸濁液に600,000カルシウム標識好中球、または好中球を含まない0.3ミリリットルのフェノールレッドフリーRPMI 1640を48ウェルプレートの適切なウェルに追加し、次に共培養物を20分間インキュベートします。摂氏37度、二酸化炭素5%、インキュベーション期間終了直前に、励起波長485ナノメートル、発光波長520ナノメートルの分光光度計で各ウェルの蛍光強度を測定します。

次に、プレートを裏返してメディアを取り除き、ペーパータオルにそっとパッドを当てて、残っている液体を取り除きます。hm ve単分子膜と好中球を含むウェルを、PBSのウェルあたり0.5ミリメートルでカルシウムとマグネシウムで5回洗浄します。毎回同じ方法でPBSを取り外します。

ウェルあたり0.3ミリリットルのフェノールレッドフリーRPMI 1640でウェルをリフレッシュし、示したように各ウェルの蛍光強度を測定します。最後に、これらの式を使用してウェルあたりの接着率と相対接着率を決定します 好中球結合アッセイを使用して信頼性の高い再現性のある結果を得るためには、アッセイ当日に微小血管内皮細胞の健康状態と共流暢さが最適であることが不可欠です。石畳の外観と、Fluor Star Optima分光光度計の単層の合計共流暢さに注意してください。

例えば、蛍光OD 520ナノメートルは、10, 000〜100万の標識好中球が分析されるときの線形範囲内にあることに注意してください。興味深いことに、炎症性アゴニストで治療されたHM VEC肺単層により多くの好中球が追加されると、アドヒアランスの割合が増加します。P 38マップキナーゼは、eセレクチン発現に必要であることが以前に実証されています。

TNFアルファでは、ヒト内皮細胞とその阻害により、接着性好中球の数が減少し、使用される細胞の数が分光光度計の線形範囲内にある限り、ウェルに追加される好中球の数が任意であることを示します。ここでは、P 38マップキナーゼ阻害剤B IRB 7 96の非存在下または存在下でのTN F α処理HM VEC肺細胞を用いた好中球接着アッセイが示されています。これらの結果は、P 38 mapk阻害後の好中球結合の相対的な減少が類似していることを示しています。

1ウェルあたりの好中球数に関係なく、レクチンはTNF αで処理した後、内皮細胞表面に発現し、好中球表面に存在する糖分子との静電相互作用を介して血管系から好中球を捕捉します。このグラフに示すように、TNFアルファ活性化内皮細胞をEセレクチンに対する抗体と事前にインキュベートすると、好中球に結合する能力が約75%低下します。このアッセイは、これらの画像で好中球接着カスケードの非常に初期のイベントを主に評価することを示しています。未処理およびTN ffat処理されたHM VEC肺単層に結合したカルシウム標識好中球を、コントロールIgGまたはEセレクチンのいずれかで事前にインキュベートします。

ポリクローナル抗体は半透明の光学顕微鏡画像を示していますが、この列にはフルオレセインフィルターセットを使用した同じ参照分野の蛍光画像がここにあります。これらのウェルには、先ほど示したPBSで洗浄する前の全好中球蛍光の代表的な画像が示されています。先ほど示したPBSで洗浄した後の付着性好中球蛍光の代表的な画像を示します。

TN FFA治療後のアドヒアランスの増加は、sセレクチンポリクローナル抗体の存在下で減少することに注意してください。この手順を試みる際には、健康な低継代数内皮細胞を使用し、収集から2時間以内に全血と単離された好中球を使用することが重要です。